Artículo de método

Ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) para la detección específica y rápida del virus del lago Tilapia

DOI:

10.3791/61025

⸱

18 de mayo de 2020

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1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science, King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS), King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

En este artículo

Resumen

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Presentamos un ensayo RT-LAMP para la detección de TiLV en peces de tilapia utilizando instrumentos simples durante un período de tiempo relativamente corto en comparación con las técnicas convencionales rt-PCR. Este protocolo puede ayudar a controlar la propagación epidémica de TiLVD, especialmente en los países en desarrollo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad por el virus del lago Tilapia (TiLVD), una enfermedad viral emergente en la tilapia causada por el virus del lago tilapia (TiLV), es un desafío persistente en la industria de la acuicultura que ha dado lugar a la morbilidad masiva y mortalidad de tilapia en muchas partes del mundo. Por lo tanto, es necesario un ensayo diagnóstico eficaz, rápido y preciso para la infección por TiLV para detectar la infección inicial y prevenir la propagación de la enfermedad en la acuicultura. En este estudio, se presenta un método de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) altamente sensible y práctico para detectar el virus del lago tilapia en el tejido de los peces. Una comparación de los ensayos RT-qPCR y RT-LAMP de muestras infectadas reveló resultados positivos en 63 (100%) y 51 (80,95%) muestras, respectivamente. Además, un análisis de muestras no infectadas mostró que los 63 tejidos no infectados arrojaron resultados negativos tanto para los ensayos RT-qPCR como para RT-LAMP. La reactividad cruzada con cinco patógenos en la tilapia se evaluó utilizando RT-LAMP, y todas las pruebas mostraron resultados negativos. Tanto las muestras de hígado como de moco obtenidas de peces infectados mostraron resultados comparables utilizando el método RT-LAMP, lo que sugiere que la mucosidad se puede utilizar en RT-LAMP como un ensayo no letal para evitar la matanza de peces. En conclusión, los resultados demostraron que el ensayo RT-LAMP presentado proporciona un método eficaz para la detección de TiLV en el tejido tilapia dentro de 1 h. Por lo tanto, se recomienda el método como herramienta de cribado en granjas para el diagnóstico rápido de TiLV.

Introducción

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La enfermedad por el virus del lago Tilapia (TiLVD) es una enfermedad viral en la tilapia (Oreochromis spp.) que al parecer causa muertes por tilapia en muchas regiones del mundo, incluyendo Asia1,2, Africa, y América. La enfermedad fue reconocida por primera vez durante la mortalidad masiva de tilapia en 2009 en Israel, donde el número de tilapia silvestre en el lago Kinneret se desplomó dramáticamente de 257 a 8 toneladas por año2. La enfermedad es causada por el virus del lago tilapia (TiLV), que ha sido asignado a la familia Amnoonviridae como un nuevo género Tilapinevirus y una nueva especie Tilapia tilapinevirus3. La caracterización genética de TiLV mostró que el virus es un virus de ARN envuelto, de sentido negativo y de una sola cadena que tiene 10 segmentos que codifican 10 proteínas1,2,4. Varias especies de tilapia en el género Sarotherodon, Oreochromis,y Tilapine y otros peces de agua caliente (por ejemplo, gourami gigante (Osphronemus goramy)) han demostrado ser susceptibles a TiLV2,5. Actualmente, este virus continúa propagó globalmente, posiblemente a través del movimiento de peces vivos infectados6,7, mientras que el riesgo de transmisión viral a través de tilapia congelada o su producto es limitado8. La mortalidad sustancial debida a la infección por TiLV tiene el potencial de tener un impacto económico significativamente perjudicial en la industria de la tilapia. Por ejemplo, el impacto económico del síndrome de mortalidad de verano en Egipto asociado con la infección por TiLV se calculó en US$100 millones9. En consecuencia, es importante desarrollar un método de diagnóstico rápido y adecuado para facilitar el control de esta enfermedad en las piscifactorías.

Hasta ahora, el diagnóstico de TiLVD se ha basado en ensayos moleculares, aislamiento viral e histopatología. Se han desarrollado diferentes protocolos e imprimaciones pcR para el diagnóstico TiLV10,,11. Por ejemplo, se ha desarrollado y validado un método de PCR cuantitativo de transcripción inversa basado en verde SYBR (RT-qPCR) con la sensibilidad de detectar tan solo dos copias/L del virus para la deteccióntiLV 10. Otros métodos de PCR para la detección de TiLV incluyen TaqMan cuantitativoPCR 11, RT-PCR2, RT-PCR12anidado y RT-PCR13semianidado. Sin embargo, estos métodos requieren equipos de laboratorio sofisticados y períodos de tiempo relativamente prolongados para producir resultados debido a la complejidad de las reacciones, lo que los hace inadecuados para la aplicación en campo.

El ensayo de amplificación isotérmica (LAMP) mediado por bucle es una aplicación for-field rápida, sencilla y práctica14,15. La técnica emplea el principio de una reacción de desplazamiento de la hebra, mientras que la reacción de amplificación se ejecuta en condiciones isotérmicas sin un sofisticado y costoso ciclor térmico14,,15. En consecuencia, los productos LAMP amplificados o RT-LAMP se analizan en bandas tipo escalera utilizando electroforesis de gel de agarosa con una mancha fluorescente para la visualización segura del ADN o del ARN14 u observación a simple vista para la presencia de turbidez o un precipitado blanco16,,17,,18. Por estas razones, esta técnica se ha utilizado para la detección in situ de diferentes patógenos de peces17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27. El propósito de este estudio fue establecer un ensayo RT-LAMP rápido, sensible y preciso para la detección de TiLV. El ensayo RT-LAMP ofrece cribado para TiLV en muestras de peces en un plazo de 30 minutos. La técnica se puede aplicar para el diagnóstico y la vigilancia de TiLVD.

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Protocolo

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Este experimento, que implicó el uso de tejido animal, fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Kasetsart, Bangkok, Tailandia (número de protocolo ACKU61-VET-009).

1. Recolección de tejidos

  1. Euthanizar pescado de tilapia utilizando una sobredosis de aceite de clavo de olor (es decir, más de 3 ml/L). El metanosulfonato de tricaína se puede utilizar como alternativa al aceite de clavo de olor.
  2. Utilice tijeras y fórceps de mayonesa estériles para abrir el abdomen de la tilapia postmortem e exbotee aproximadamente 30–50 mg de tejido hepático, o utilizando un vidrio de cubierta de microscopio, recoja 100 ml de moco raspando la capa de piel de pescado longitudinalmente (de anterior a posterior) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. Proceda al paso de extracción de ARN inmediatamente o mantenga la muestra recogida a 80 oC hasta el experimento. Como el ARN intacto es más sensible que el ADN, utilice materiales y reactivos libres de RNase durante la extracción del ARN.

2. Extracción de ARN

  1. Para extraer el ARN del tejido hepático, agregue 30–50 mg del tejido de tilapia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 600–1.000 ml de reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol(Tabla de materiales),y pulver la muestra hasta que sea homogénea utilizando un homogeneizador de tejido de mano. Las muestras de tejido requieren aproximadamente el 10% del reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol. Para las muestras de moco, utilice sólo 300 ml del reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol (3:1).
    ADVERTENCIA: El reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol es tóxico; por lo tanto, la manipulación debe llevarse a cabo con cuidado. Se debe usar equipo de protección, como gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes de seguridad.
  2. Centrifugar la muestra homogeneizada a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente, y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
  3. Añadir un volumen igual de etanol 95% al tubo y mezclar bien.
  4. Transfiera la solución a una columna de centrifugado(Tabla de materiales)colocada en un tubo de recogida y centrífuga a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente. Deseche el flujo y transfiera la columna de giro a un nuevo tubo de recogida.
  5. Añadir 400 l de reactivo de ARN Prelavado(Tabla de Materiales)a la columna y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente antes de desechar el flujo. Repita este paso una vez más.
    NOTA: Para preparar el ARN Pre-Wash, agregue 10 ml de etanol al 95% a 40 ml de concentrado de ARN Pre-Wash.
  6. Añadir 700 l de búfer de lavado de ARN(Tabla de materiales)a la columna y centrifugar a 10.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
    NOTA: Para preparar el tampón de lavado de ARN, añada 52 ml de etanol al 95% a 12 ml de concentrado de RNA Wash Buffer.
  7. Eluir la muestra de ARN capturada en la matriz de columna de espín con 100 l de agua libre de nucleasas y centrífuga a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente.
  8. Mida la concentración del ARN extraído utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes y diluya el ARN a la concentración deseada utilizando agua libre de nucleasas.
    NOTA: El valor de absorbancia calificado de OD260/OD280 oscila entre 1,6 y 1,9, lo que indica la pureza aceptable del ARN para el ensayo RT-LAMP.
  9. Continúe con el siguiente paso inmediatamente, o mantenga la muestra a 80 oC hasta su uso.

3. Diseño de imprimación

  1. Utilice Primer Explorer versión 4 para diseñar las imprimaciones específicas para el RT-LAMP. Vaya al sitio web, https://primerexplorer.jp/e/, y haga clic en el botón PrimerExplorer V4.
  2. Seleccione el archivo que contiene las secuencias del segmento 3 de TiLV en formato FASTA y, a continuación, haga clic en el botón Primer Diseño.
    NOTA: Recuperar las secuencias en formato FASTA del número de adhesión de GenBank KX631923, que representa el virus del lago tilapia TV1 segmento 31.
  3. Para diseñar las imprimaciones, introduzca los siguientes parámetros básicos:
    - Un contenido de GC de 40%–60%
    - Un amplicon de 280 pares de bases (bp)
    - Una temperatura de fusión similar (Tm) entre las imprimaciones con una diferencia máxima de 5 oC
    NOTA: Las imprimaciones no deben complementarse entre sí
    1. Evite las regiones de secuencia propensas a formar estructuras secundarias.
    2. Seleccione el análisis de imprimación de dimer con un mínimo de 3,5 euros para un diseño óptimo para el G más grande, y seleccione los extremos de las imprimaciones con un máximo de 4 euros para un diseño óptimo para el G más pequeño.
  4. Haga clic en el botón Generar.
    NOTA: Una vez que el software termine de procesar los datos de entrada, se mostrarán los resultados de la imprimación(Figura 1).

4. Ensayo RT-LAMP

  1. Preparar una mezcla maestra RT-LAMP que contenga 2,5 l de búfer de reacción SD II 1, 3 ml de 6 mM MgSO4, 1,4 ml de conjunto dNTP de 1,4 mM, 4 ml de betaína de 0,8 M, 1,3 ml de mezcla de calceína de 0,052 mM, 1 l de 1,6 m de imprimación TiLV-F3, 1 l de imprimación TiLV-B3 de 1,6 M, 1 l de imprimación TiLV-BIP de 0,2 M, 1 l de imprimación TiLV-FIP de 0,2 m, 1 l de polimerasa de ADN Bst de 0,3 U, 1 l de transcriptasa inversa de 0,1 U AMV y 3,8 ml de agua libre de nucleasas por reacción.
    NOTA: Prepare el exceso de mezcla maestra que comprende al menos el 10% del volumen total de reacción.
  2. Dispensar 22 l de la mezcla maestra RT-LAMP en un tubo estéril de 1,5 microcentrífugas.
  3. Añadir 3 l del ARN extraído al tubo de reacción y mezclar la muestra mediante vórtice. Para el control negativo, utilice agua destilada en lugar de materiales de ARN.
  4. Incubar la reacción a 65 oC durante 60 min, seguido de 80 oC durante 10 min para finalizar la reacción.
  5. Después de la incubación, observe visualmente los cambios colorimétricos a simple vista. Un resultado positivo aparecerá como un color verde fluorescente.

5. Electroforesis de gel de agarosa

  1. Preparar un gel de agarosa de 1,5% p/v suspendiendo 0,6 g de polvo de agarosa en 40 ml de 1 tampón TAE. Derretir la mezcla calentándola en un microondas durante 3-5 min hasta que la agarosa se disuelva por completo, y gire para mezclar.
  2. Deje que la agarosa se enfríe hasta que la temperatura alcance los 65 oC. Vierta 40 ml de la solución de agarosa en una bandeja de gel y agregue un peine al molde de gel.
  3. Deje que el gel de agarosa se ajuste a temperatura ambiente durante 20-30 min hasta que se haya solidificado por completo. A continuación, retire el peine y coloque el gel en el tanque de gel.
  4. Añadir un tampón de carrera para cubrir la superficie del gel en el tanque de gel.
  5. Añadir 10 l de la muestra RT-LAMP y 2 l de tampón de carga de gel de 6x a cada poca. Añadir 5 l de una escalera de ADN de 1 kb al carril de referencia.
  6. Enchufe la tapa conectada al cátodo y al ánodo conectado a una fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación, establézquela en una constante de 100 V y funcione durante 40 minutos.
  7. Después de completar la separación del gel, retire el gel de la bandeja de gel. A continuación, manchar el gel escurrido con bromuro de etidio (EtBr) a una concentración de 10 mg/ml durante 7 min y restain hacerlo en agua destilada durante 5 min.
    ADVERTENCIA: EtBr es tóxico y se considera carcinógeno; por lo tanto, tenga cuidado al usar este agente.
  8. Exponer el gel a la luz UV utilizando un sistema de documentación de gel donde aparecen las bandas, y tomar una foto del gel.

6. Síntesis complementaria de ADN (ADNc)

  1. Preparar una mezcla maestra de síntesis de ADNc que contenga 2 ml de tampón RT de 5x, 0,5 ml de mezcla de imprimación, 0,5 ml de enzima RT y 2 ml de agua libre de nucleasas por reacción.
    NOTA: Prepare el exceso de mezcla maestra que comprende 1 veces la reacción debido a la pérdida potencial durante el pipeteo.
  2. Dispensar 5 l de la mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
  3. Añadir 100 ng del ARN extraído diluido (obtenido del paso 2.8) al tubo de reacción, mezclar y girar hacia abajo para mover toda la mezcla a la parte inferior del recipiente.
  4. Incubar las reacciones a 42 oC durante 60 min, seguido de 98 oC durante 5 min en una máquina pcR. Almacene el ADNc a 20 oC hasta su uso.

7. RT-qPCR

  1. Preparar una mezcla maestra TiLV qPCR que contenga 0,3 l de imprimación inversa de 10 m, 0,3 ml de imprimación hacia delante de 10 m, 5 ml de 2x de polimerasa de ADN verde SYBR y 0,4 ml de agua libre de nucleasas por reacción. Utilice las siguientes imprimaciones y controles:
    Imprimación delantera (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATGGATT-3'
    Imprimación inversa (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAAGTTCT-3'
  2. Dispensar 6 l de la mezcla maestra TiLV qPCR en cada pocel de la tira qPCR compatible con el ciclor térmico en tiempo real utilizado.
  3. Añadir 4 l de la plantilla de ADNc, control negativo (agua libre de nucleasas), control positivo (10 pg/L) y pTiLV (plásmido)10 o plásmido en serie de TiLV plásmido al pozo, y mezclar cada muestra parpadeando. Lleve a cabo cada muestra en triplicado.
  4. Coloque las reacciones qPCR en el ciclor térmico en tiempo real programado. Establezca el programa qPCR para realizar la incubación a 95 oC durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 oC para 10 s y 60 oC para 30 s antes del paso de la curva de fusión en el que la temperatura debe aumentar de 65 oC a 95 oC a incrementos de 0,5 oC/5 s.
  5. Realice el análisis de datos evaluando las curvas de amplificación y fusión y, a continuación, calcule el número de copias de TiLV utilizando la curva estándar obtenida de los datos utilizando los plásmidos diluidos en serie.

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Resultados

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En este estudio, se desarrolló un ensayo RT-LAMP para detectar la infección por TiLV en la tilapia. Las muestras analizadas se recogieron en 14 granjas ubicadas en diferentes partes de Tailandia entre 2015 y 2016. Los peces infectados y no infectados se agruparon principalmente en función de los diagnósticos físicos y la aparición de TiLVD sintomático. La infección por TiLV se confirmó posteriormente utilizando RT-PCR después del proceso de recolección. La electroforesis de gel de agarosa y la detección de un color verde...

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Discusión

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La industria acuícola está continuamente amenazada por infecciones virales que causan pérdidas económicas sustanciales99,23,,28. Por ejemplo, el emergente TiLV representa una amenaza importante para los países productores de tilapia en muchas partes del mundo1,6,9. Hasta ahora, no ha habido terapias específicas disponibles para prevenir...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El proyecto está financiado financieramente por el número de subvención del Fondo de Investigación de Tailandia (TRF) RDG6050078 y el Centro de Estudios Avanzados para la Agricultura y la Alimentación, Instituto de Estudios Avanzados, Universidad Kasetsart, Bangkok, Tailandia en el marco del Proyecto de Promoción de la Investigación de Educación Superior y La Universidad Nacional de Investigación de Tailandia, Oficina de la Comisión de Educación Superior, Ministerio de Educación, Tailandia. La investigación es apoyada en parte por la Beca del Programa de Posgrado de la Escuela de Posgrado de la Universidad de Kasetsart. Los autores quieren agradecer al Dr. Kwanrawee Sirikanchana por la narración que habla del video y a Piyawatchara Sikarin por editar el video.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Recolección de tejidos:Aceite de
clavoBetter PharmaN/A
Tricaína metanosulfonatoSigma-AldrichE10521Una opción alternativa al aceite de clavo
Extracción de ARN:
Reactivo ácido a base de guanidinio-fenol (reactivo TRIzol)ThermoFisher Scientific Corp.
Reactivo ácido a base de guanidinio-fenol (reactivo GENEzol)GeneaidGZR100
Direct-zol RNA Kit:Zymo ResearchR2071
- Prelavado
- Tampón
ARN- Agua
- ColumnasZymo-spin IIICG
- Tubos
RT-LAMP:
1x Tampón de reacción SD IIBiotechrabbitBR1101301
Sulfato de magnesio (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP setBiolineBIO-39053
BetaínaSigma-AldrichB2629
Mezcla de calceínaMerck1461-15-0
Bst ADN polimerasaBiotechrabbitBR1101301
AMV transcriptasa inversaPromegaM510A
Invitrogen10320995
Elite incubadora de baño seco, unidadúnica Ciencia MayorEL-01-220
gel:
AgarosaTampón de Vivantis TechnologiesPC0701-500G
Tampón de tris-borato-EDTA (TBE)Sigma-AldrichSRE0062
tampón Tris-acético-EDTA (TAE):
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- Ácido acético (glacial), EMSUREMerck Millipore1000632500
- Etilendiaminatetraacetato disódico dihidratado (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co., Ltd.GR107
Tinte de carga de gel de ADN (6X)ThermoFisher Scientific Corp.R0611
Escalera y marcadores de ADNVivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Sistema de electroforesis horizontal)Fuente de alimentación Bio-Rad1704487
PowerPac HCBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
bandeja de muestras UVBio-Rad 1708271
N&alfa; Generador de imágenes BINeogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA Synthesis KitVivantis TechnologiescDSK01Una opción alternativa para la síntesis de ADNc
NanoDrop2000 (espectrofotómetro de microvolúmenes)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 TermocicladorBio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
Agua libre de nucleasas, agua estérilMultiCell809-115-CL
Tiras de PCR de 8 tubos,Bio-RadTLS0851
Tubo plano de PCR Tiras de 8 tapones, ópticoBio-RadTCS0803
CFX96 TermocicladorBio-Rad1855196
Equipos y materiales generales:
Tijeras MayoN/A
/A
Vortex Genie 2 (mezclador de vórtice)Científico Industrias
Microcentrífuga LM-60LioFugeCM610
Corning LSE mini microcentrífugaCorning6765
PipetasRaininPipete-Lite XLS Puntas de
pipeta filtradas QSPQuality Scientific Plasticsserie
Puntas filtradas Corning IsotipCLS
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sin nucleasas, NESTWuxi NEST Biotechnology615601
15596026 de ARN de zol directo de lavado de libre de DNasa/RNasa de recolección Agua sin nucleasas blanco táctil Pinzas NTF Serie

Referencias

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