Artículo de método

Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular

DOI:

10.3791/61037

⸱

1 de mayo de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el uso de aglomeración macromolecular para crear un modelo de tejido cicatricial humano in vitro que se asemeja a condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un ambiente macromolecular lleno de gente, los fibroblastos de la piel humana exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales que se asemejan al tejido cicatricial.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha demostrado que los tejidos in vivo están muy llenos de proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polisacáridos, etc. El siguiente protocolo aplica una técnica de aglomeración macromolecular (MMC) para imitar este hacinamiento fisiológico mediante la adición de polímeros neutros (crowders) a cultivos celulares in vitro. Estudios previos con Ficoll o dextran como crowders demuestran que la expresión de colágeno I y fibronectina en las líneas celulares WI38 y WS-1 se mejoran significativamente mediante la técnica MMC. Sin embargo, esta técnica no ha sido validada en fibroblastos primarios de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas (hHSF). A medida que la cicatrización hipertrófica surge de la excesiva deposición de colágeno, este protocolo tiene como objetivo construir un modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico en colágeno mediante la aplicación de la técnica MMC con hHSFs. Se ha demostrado que este modelo MMC optimizado posee más similitudes con el tejido cicatricial in vivo en comparación con los sistemas tradicionales de cultivo celular de 2 dimensiones (2-D). Además, es rentable, eficiente en el tiempo y éticamente deseable en comparación con los modelos animales. Por lo tanto, el modelo optimizado reportado aquí ofrece un modelo avanzado "in vivo-como" para estudios hipertróficos relacionados con la cicatriz.

Introducción

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El tejido cicatricial representa la variable de reparación del tejido. Sin embargo, en muchos individuos, especialmente aquellos que sufren de quemaduras o trauma1, las cicatrices pueden ser excesivas e imponer efectos indeseables en la morfología y el funcionamiento de la piel curada. Aunque no se entienden completamente los mecanismos exactos de la formación patológica (cicatrices hipertróficas y queloides), la deposición excesiva de colágeno durante la cicatrización de heridas ha demostrado ser una contribución esencial2.

Está bien establecido que la transformación del factor de crecimiento beta 1 (TGF--1) y la actina muscular alfa suave (SMA) desempeñan un papel clave en la formación de cicatrices hipertróficas. La evidencia sugiere que el TGF-1 elevado estimula directamente la deposición excesiva de colágeno a través de la regulación de la vía de señalización SMAD3. Además, se ha encontrado que la ASMA contribuye a la formación de cicatrices hipertróficas mediante la regulación de la contracción celular y la reepitelización en el proceso de cicatrización de heridas4. La falta de modelos in vitro e in vivo adecuados es un impedimento importante para desarrollar y evaluar intervenciones y terapias para la remediación de cicatrices. El objetivo de este estudio es utilizar la técnica MMC existente para construir un modelo de cicatrices hipertróficas "in vivo-like" que sea adecuado para evaluar intervenciones novedosas y emergentes relacionadas con las cicatrices.

Reproducir tejido vivo fuera del cuerpo ha sido un objetivo durante años en la comunidad científica. El desarrollo de técnicas in vitro a principios del siglo XX logró en parte este objetivo. Las técnicas in vitro actuales han evolucionado ligeramente a partir de la demostración original de Roux de que las células embrionarias pueden sobrevivir ex vivo durante varios días en la salina caliente5. Sin embargo, las metodologías in vitro se limitan principalmente a los tipos de células simples cultivadas en 2-D y no recapitulan con precisión los tejidos in vivo. Si bien son útiles para examinar la bioquímica celular, la fisiología y la genética, los tejidos nativos son tridimensionales e incorporan múltiples tipos de células. Los sistemas in vitro 2D simples someten las células de mamíferos a entornos altamente artificiales en los que se pierde la arquitectura específica del tejido nativo6. A su vez, esto afecta a los eventos intracelulares y extracelulares, lo que resulta en morfología celular anormal, fisiología y comportamiento7.

El interés de este protocolo radica en el desarrollo y manejo clínico de cicatrices y queloides hipertróficos. Si bien está bien establecido que los fibroblastos dérmicos son en gran parte responsables de la abundante producción de colágenos presentes en el tejido cicatricial, el cultivo de fibroblastos dérmicos utilizando sistemas in vitro 2-D no reproduce la rotación de colágeno observada in vivo8. Los métodos in vitro contemporáneos todavía utilizan esencialmente "salina caliente", un ambiente completamente diferente al de los tejidos vivos. Los tejidos in vivo están extremadamente concurridos, con proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas y polisacáridos, ocupando entre el 5% y el 40% del volumen total. Como no hay dos moléculas pueden ocupar el mismo espacio al mismo tiempo, hay poco espacio libre disponible y una ausencia casi completa de agua libre9.

La técnica MMC impone restricciones que afectan a las propiedades termodinámicas del citosol y los fluidos intersticiales. Las interacciones moleculares, los complejos de señalización receptor-ligand, las enzimas y los orgánulos están confinados y restringidos a interactuar libremente9. Las interacciones dentro del entorno pericelular (es decir, intersticio) también están limitadas. La evidencia reciente confirma que las altas concentraciones de macromoléculas inertes en soluciones abarrotadas perturban la difusión, asociación física, viscosidad y propiedades hidrodinámicas10.

Curiosamente, varios agentes de aglomeración populares (es decir, Ficoll, dextran, polivinilpirrolidona [PVP] y sodio 4-estirenosulfonato [PSS]) no son equivalentes cuando se aplican a diferentes tipos de células y en diferentes configuraciones. En un estudio anterior, Se informó que Ficoll era menos citotóxico para las células madre mesenquimales en comparación con la PVP. Estos resultados fueron interpretados como la consecuencia de su carga neutra y el radio hidrodinámico relativamente pequeño11. Por el contrario, un segundo estudio encontró que el deextran es más eficaz en la estimulación de la deposición de colágeno I por fibroblastos pulmonares humanos en comparación con Ficoll12. Los datos de nuestro propio estudio sugieren que Ficoll mejora la deposición de colágeno por fibroblastos derivados de cicatrices hipertróficas, mientras que la PVP es tóxica para estas células13.

Se ha demostrado que la conversión de procolágeno a colágeno es más rápida en un ambiente in vivo altamente concurrido14,mientras que la tasa de reacciones biológicas se retrasa en un sistema de cultivo 2D diluido15. Hemos optimizado el protocolo in vitro aquí, incorporando MMC para mostrar el cultivo de fibroblastos dérmicos sirviendo como un modelo más "in vivo-como" para fibrosis dérmica y formación de cicatrices. En contraste con el sistema de cultivo 2D común, el cultivo de hHSFcon MMC estimula significativamente la biosíntesis y la deposición de colágeno13. En particular, otras características de la fibrosis (es decir, el aumento de la expresión de la matriz de metaloproteinasas [MMP] y citoquinas proinflamatorias) también son evidentes bajo este protocolo MMC optimizado13. Cuando se cultiva utilizando este método, se muestra que las células dérmicas recapitulan los parámetros fisiológicos, bioquímicos y funcionales medidos in vivo.

El protocolo MMC in vitro optimizado se ha utilizado para evaluar la expresión de colágeno y otras proteínas ECM por fibroblastos dérmicos aislados de la dermis de cicatrices hipertróficas y la dermis adyacente no implicada. Cuando se cultiva en entornos MMC in vitro, se ha observado que los hHSF expresan ciertas características (es decir, ARNm, bioquímica, fisiología y fenotipo) similares al tejido cicatricial hipertrófico dérmico in vivo. La evidencia indica que las propiedades físicas y químicas son consideraciones importantes a la hora de seleccionar crowders y optimizar las condiciones MMC para el cultivo in vitro.

Para la prueba de principio, el protocolo MMC se aplica aquí para evaluar cualitativa y cuantitativamente la capacidad de Shikonin y sus análogos para inducir la apoptosis. Esto permite evaluar las posibles aplicaciones de estos compuestos de medicina tradicional china (TCM) de origen natural para la gestión de cicatrices dérmicas13. No obstante, la simplicidad, la rentabilidad y la puntualidad de este protocolo MMC in vitro también satisfacen las regulaciones recientes para eliminar la experimentación en mamíferos por la Directiva 2010/63/UE y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) de la UE.

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Protocolo

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1. Cultivo celular

  1. Mantener los hHSF y los fibroblastos dérmicos normales derivados del tejido no patológico (hNSF) en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal (FCS) y una solución de 1% v/v de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37oC en una incubadora con un 5% de CO 2/95% de aire.2
  2. Compra Ficoll 70, Ficoll 400 y ácido ascórbico de las empresas apropiadas.

2. Construcción del modelo de cicatrices hipertróficas MMC

  1. Sembrar los hHSF o hNSF (50.000/pozo) en una placa de 24 pocillos que contiene 1 ml de medios en cada pocal.
  2. Colocar en una incubadora de 37oC a 5% de CO2 y dejar durante la noche.
  3. Prepare los medios MMC. Sobre la base del volumen total requerido para el experimento, producir un 10% de medios FCS/DMEM mezclando Ficoll 70 (18,75 mg/ml), Ficoll 400 (12,5 mg/ml) y ácido ascórbico (100 oM).
  4. Coloque la mezcla en un baño de agua de 37oC durante 1 h para dispersar los habachos en la solución y, a continuación, esterilizar el soporte MMC con un filtro de 0,2 m.
  5. Aspirar los medios gastados y reemplazarcon el medio MMC recién hecho.
  6. Incubar las células durante 6 días a 37oC y 5% deCO2,cambiando el medio cada 3 días.

3. Expresión de la cantidad total de colágeno

  1. Preparar la solución roja Sirius (0,1% p/v). Disolver 0,2 g de polvo rojo directo 80 en 200 ml de agua destilada desionizada (ddH2O) con 1 ml de ácido acético.
  2. Aspirar los medios MMC y añadir 300 solución De Sirio Rojo en cada pozo. Incubar a 37oC durante 90 min.
  3. Enjuague suavemente la solución Sirius Red con agua del grifo y deje que la placa se seque al aire durante la noche.
  4. Extraiga la mancha roja de Sirio añadiendo 200 ml de hidróxido de sodio (0,1 M) en cada poca. Coloque la placa en un agitador orbital durante 5-10 minutos para extraer completamente la mancha roja de Sirio.
  5. Transfiera 100 l de la mancha Roja Sirius extraída en una placa transparente de 96 pocillos y mida la absorbancia a 620 nm utilizando un lector de microplacas.

4. Expresión de colágeno I (inmunomancha)

  1. Lavar los pozos con 200 ml de solución salina con fosfato (PBS, pH a 7,35).
  2. Fijar las células usando metanol (500 l/pozo) a 4 oC durante 10 min.
  3. Bloquear interacciones inespecíficas con 3% de albúmina sérica bovina durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
  4. Aspirar la solución de bloqueo e incubar con 200 l de anticuerpo anti-colágeno I (10 g/ml) durante 90 min a RT.
  5. Aspirar el anticuerpo primario y lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada uno.
  6. Incubar con 200 ol de anticuerpo secundario anticonejo-FITC de cabra (1:400 dilución) y 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1: 2000 dilución) durante 30 min en RT. Cubra la placa con papel de aluminio.’
  7. Deseche el anticuerpo secundario y el DAPI y lave 3 veces con PBS durante 5 min cada uno.
  8. Visualice la mancha de fluorescencia directamente bajo un microscopio.

5. Hincha occidental

  1. Lave las células 2veces con PBS.
  2. Añadir 40 l de tampón de lisis en cada pocal y raspar la capa celular con una punta de pipeta. El tampón de lisis contiene tampón de PIRA, cóctel inhibidor de proteasa (PIC), vanadate sódico de 2 mM y fluoruro de sodio de 10 mM.
  3. Transfiera el lisado proteico a tubos de microcentrífuga y mida la concentración de proteínas utilizando un ensayo proteico según las instrucciones del fabricante16.
  4. Carga 10 g de proteína de cada grupo en los pozos de 4%-12% geles de proteína Bis-Tris. Realizar electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato de sodio (SDS-PAGE) a 200 V durante 30 min.
  5. Transfiera la proteína a la membrana de nitrocelulosa ejecutando una mancha occidental a 90 V durante 90 min. Evitar la formación de burbujas de aire entre el gel y la membrana de nitrocelulosa.
  6. Bloquee la membrana con 10 ml de tampón de bloqueo.
  7. Incubar con anticuerpos primarios a 4oC durante la noche. Los anticuerpos primarios son: anticolágeno I, anticolágeno III, anti-colágeno IV, anti-SMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, y anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
  8. Lavar la membrana con 0,1% TBS-Tween 20 (5x para 5 min cada uno). TBS/Tween 20 (1 L) contiene lo siguiente: 50 mL de 1 M Tris (pH a 7,4), 30 ml de cloruro sódico de 5 M, 1 ml de Tween 20 y 920 ml de ddH2O.
  9. Incubar con un anticuerpo secundario apropiado para RT durante 1 h.
  10. Repita el paso 5.8 y visualice la fluorescencia utilizando un sistema de imágenes.

6. RT-PCR

  1. Recoger el ARN total utilizando el tampón de lisis mezclado con 2-mercaptoetanol incluido en el kit de ensayo de extracción de ARN.
  2. Purificar el ARN según las instrucciones del fabricante17.
  3. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes.
  4. Realizar la síntesis de ADNc de primera hebra utilizando un kit de síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante.
  5. Las imprimaciones de oligonucleótidos RT-PCR se proporcionan (precoatadas) en placas de pozo sin formato de 96 personalizadas. Mezclar 100 ng de las muestras de ADNc con 10 l de supermezcla verde SYBR en la placa personalizada.
  6. Aumente el volumen total a 20 l/bien utilizando ddH2O.
  7. Ejecutar RT-PCR utilizando un ciclor térmico siguiendo las instrucciones del fabricante: 40 ciclos de desnaturalización a 98 oC para 15 s y recocido/extensión a 60oC para 60 s. Los genes probados en RT-PCR incluyen: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3 , TGFB1 y VEGF.

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Resultados

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En cada experimento se realizaron muestras de triplicado, y cada experimento se repitió 3 veces utilizando células de tres pacientes individuales. Los datos se expresan como porcentajes del grupo de control. Se aplicaron la prueba post-hoc de ANOVA unidireccional y Tukey para analizar las diferencias estadísticas (*p . 0,05).

MMC utilizando Ficoll al 9% FVO (ocupación de volumen fraccionario) mejora la cantidad total de colágeno y colágeno I deposición en hHSF13

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Discusión

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Este protocolo tiene como objetivo optimizar y autenticar un modelo in vitro mejorado :scar-in-a-jar" para el tejido cicatricial cutáneo humano. Estudios anteriores han informado de la aplicación de la técnica MMC a los fibroblastos pulmonares humanos12, células madre mesenquimales de médula ósea humana23,y fibroblastos dérmicos humanos23 utilizando dextran12,Ficoll12y PVP23 como...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur "SPF 2013/004: Investigación Básica de La Biología de la Piel" y la "Innovación para el Cuidado de la Herida para los Trópicos" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Los autores agradecen el asesoramiento y la asistencia de la Dra. Paula Benny y la Dra. Michael Raghunath.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.2 μ m filtroSartorius16534
2-MercaptoetanolSigma-AldrichM6250
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificP36962
Alexa Fluor 680Thermo Fisher ScientificA-21076
Alexa Fluor 800Thermo Fisher ScientificA-11371
anticuerpo primario alfa de actina de músculo liso (αSMA)AbcamAB5694
Sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 de Applied Biosystems (termociclador)Thermo Fisher Scientific4351106
Ácido ascórbicoWako#013-12061
Albúmina sérica bovinaSigma-Aldrich#A2153
Bradford ensayo de proteínasBio-Rad500-0006
Anticuerpo primario de colágeno I (para inmunotinción)Abcam6308
Anticuerpo primario de colágeno I (para western blot)Abcamab21286
Anticuerpo primario de colágeno IIIAbcamab7778
Anticuerpo primario de colágeno IVAbcamab6586
Rojo directo 80Sigma-Aldrich2610108
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Life Technologies11996-065
Suero fetal de ternera (FCS)Life Technologies6000-044
Ficoll 400GE HealthCare#17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare#17-0310-10
Anticuerpo primario GAPDHSigma-AldrichG8795
Anticuerpo secundario anti-conejoAbcamab97050
Cicatriz hipertrófica humana/fibroblastos normales (hHSF/hNSF)Cell Research Corporation106, 107, 108
Kit de síntesis de ADNc iScriptBio-Rad#1708890
Anticuerpo primario MMP-1Abcamab38929
MMP-13 anticuerpo primarioAbcamab39012
Anticuerpo primario MMP-2Abcamab37150
Anticuerpo primario MMP-9Abcamab38898
Espectrofotómetros de microvolumen NanoDropThermo Fisher ScientificN/A
Membrana de nitrocelulosaBio-Rad10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Geles de proteínaThermo Fisher ScientificNP0321BOX
Tampón de bloqueo OdysseyLI-COR Biosciences927– 40000
Odyssey Fc Sistema de imagenLI-COR BiosciencesN/A
Microscopio Olympus IX-81 HCS (para inmunotinción)OlympusN/A Solución
penicilina/estreptomicina (P/S)Life Technologies15140-122
Ensayos PrimePCRBio-RadImprimaciones personalizadas prerrecubiertas en placas de 96 pocillos según los requisitos
Cóctel inhibidor de proteasa (PIC)Sigma-Aldrich11697498001
PVP 360Sigma#PVP360
PVP 40Sigma#PVP40
tampón RIPAMerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN#74134
Vanadato de sodioSigma-Aldrich450022
Sodio vanadatoSigma-Aldrich450243
SpectraMax M5 Lector de microplacas multimodoMolecular DevicesN/A
SsoAdvanced universal SYBR green supermixBio-Rad#172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416
de

Referencias

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