Artículo de método

Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero

DOI:

10.3791/61039

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17 de abril de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los rotavirus son una población grande y en evolución de virus de ARN segmentados de doble cadena que causan gastroenteritis grave en los jóvenes de muchas especies de mamíferos y aves, incluidos los seres humanos. Con la reciente llegada de los sistemas de genética inversa del rotavirus, se ha hecho posible utilizar la mutagénesis dirigida para explorar la biología del rotavirus, modificar y optimizar las vacunas rotavirus existentes y desarrollar vectores de vacunas multiobjetivo de rotavirus. En este informe, describimos un sistema de genética inversa simplificado que permite la recuperación eficiente y confiable de rotavirus recombinantes. El sistema se basa en la co-transfección de vectores de transcripción T7 que expresan rotavirus de longitud completa (+)ARN y un vector CMV que codifica una enzima de tapado de ARN en células BHK que producen constitutivamente la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7). Los rotavirus recombinantes se amplifican mediante la sosción de las células BHK-T7 transinfectadas con células MA104, una línea de células renales de monos que es altamente permisiva para el crecimiento del virus. En este informe, también describimos un enfoque para generar rotavirus recombinantes que expresan una proteína de reportero fluorescente separada a través de la introducción de un elemento de parada-reinicio traslacional 2A en el segmento 7 del genoma (NSP3). Este enfoque evita eliminar o modificar cualquiera de los marcos de lectura abiertos virales, permitiendo así la producción de rotavirus recombinantes que retienen proteínas virales totalmente funcionales mientras expresan una proteína fluorescente.

Introducción

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Los rotavirus son las principales causas de gastroenteritis grave en lactantes y niños pequeños, así como en los jóvenes de muchas otras especies de mamíferos y aves1. Como miembros de la familia Reoviridae, los rotavirus tienen un genoma segmentado de ARN de doble cadena (dsRNA). Los segmentos del genoma están contenidos dentro de un virión icosahedral no envuelto formado a partir de tres capas concéntricas de proteína2. Sobre la base de la secuenciación y el análisis filogenético de los segmentos del genoma, se han definido nueve especies de rotavirus (A-D, F-J)3. Esas cepas que comprenden la especie de rotavirus A son responsables de la gran mayoría de las enfermedades humanas4. La introducción de vacunas contra el rotavirus en los programas de inmunización infantil a partir de la última década está correlacionada con reducciones significativas en la mortalidad y la morbilidad del rotavirus. En particular, el número de muertes infantiles asociadas al rotavirus ha disminuido de aproximadamente 528.000 en 2000 a 128.500 en 20164,5. Las vacunas contra el rotavirus se formulan a partir de cepas vivas atenuadas del virus, con 2 a 3 dosis administradas a niños a los 6 meses de edad. El gran número de cepas de rotavirus genéticamente diversas que circulan en humanos y otras especies de mamíferos, combinadas con su capacidad de evolucionar rápidamente a través de la mutagénesis y el reordenamiento, puede dar lugar a cambios antigénicos en los tipos de rotavirus que infectan a niños6,7,8. Estos cambios pueden socavar la eficacia de las vacunas existentes, lo que requiere su sustitución o modificación.

El desarrollo de sistemas de genética inversa totalmente basados en plásmidos que permiten la manipulación de cualquiera de los 11 segmentos del genoma del rotavirus se logró recientemente9. Con la disponibilidad de estos sistemas, se ha hecho posible desentrañar los detalles moleculares de la replicación del rotavirus y la patogénesis, desarrollar métodos mejorados de detección de alto rendimiento para los compuestos anti-rotavirus y crear nuevas clases potencialmente más eficaces de vacunas contra el rotavirus. Durante la replicación del rotavirus, los arnvirales (+)ARN no sólo guían la síntesis de proteínas virales, sino que también sirven como plantillas para la síntesis de la progenie dsRNA genome segmentos10,11. Todos los sistemas de genética inversa rotavirus descritos hasta la fecha se basan en la transfección de vectores de transcripción T7 en líneas celulares de mamíferos como fuente de ARN derivados del ADNC (+)ARN utilizados en la recuperación de virus recombinantes9,12,13. Dentro de los vectores de transcripción, los cDNa virales de longitud completa se colocan entre un promotor t7 ascendente y el ribozyme del virus delta de la hepatitis (HDV) aguas abajo, de tal manera que los virales (+)ARN son sintetizados por la polimerasa de ARN T7 que contienen 5' y 3'-termini auténticos (Figura 1A). En el sistema de genética inversa de primera generación, los virus recombinantes se hicieron transfectando células renales de hámster bebé que expresaban la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7) con 11 vectores de transcripción T7 (pT7), cada síntesis de dirección de un ARN único (+)de la cepa del virus SA11 simio, y tres plásmidos de expresión promotor-drive promotor de CMV, uno que codifica la proteína de fusión reovirus aviar p10FAST y dos subunidades codificantes del complejo de enzimas de tapado del virus de la vacuna D1R-D12L9. Los virus SA11 recombinantes generados en células BHK-T7 transinfectadas se amplificaron mediante la sustitución con células MA104, una línea celular permisiva para el crecimiento del rotavirus. Se ha descrito una versión modificada del sistema de genética inversa de primera generación que ya no utiliza plásmidos de soporte12. En su lugar, el sistema modificado genera con éxito rotavirus recombinantes simplemente transfectando células BHK-T7 con los 11 vectores de transcripción SA11 T7, con la advertencia de que los vectores para la fábrica viral (viroplasmo) bloques de construcción (proteínas no estructurales NSP2 y NSP5) se añaden a niveles 3 veces más altos que los otros vectores14,15. También se han desarrollado versiones modificadas del sistema de genética inversa que apoyan la recuperación de las cepas humanas KU y Odelia del rotavirus16,,17. El genoma del rotavirus es notablemente susceptible de manipulación por genética inversa, con virus recombinantes generados hasta la fecha con mutaciones introducidas en VP418,NSP19, NSP219, NSP320,,21y NSP522,,23. Entre los virus más útiles generados hasta el momento se encuentran los que han sido diseñados para expresar proteínas de reportero fluorescente (FP)9,,12,,21,24,25.

En esta publicación, proporcionamos el protocolo para el sistema de genética inversa que utilizamos en nuestro laboratorio para generar cepas recombinantes de rotavirus SA11. La característica clave de nuestro protocolo es la co-transfección de células BHK-T7 con los vectores de transcripción 11 pT7 (modificados para incluir niveles 3x de los vectores pT7/NSP2SA11 y pT7/NSP5SA11) y un vector de expresión CMV que codifica laenzima np868R(Figura 2). En nuestras manos, la presencia del plásmido NP868R conduce a la producción de tetas más altas de virus recombinantes por células BHK-T7 transinfectadas. En esta publicación, también proporcionamos un protocolo para modificar el plásmido pT7/NSP3SA11 de tal manera que se puedan generar virus recombinantes que expresen no sólo el producto proteico del segmento 7 NSP3, sino también un FP separado. Esto se logra reingeniería el marco de lectura abierta (ORF) NSP3 en el plásmido pT7/NSP3SA11 para contener un elemento de detención-reinicio traslacional 2A descendente seguido de un FP ORF (Figura 1B)24,26. A través de este enfoque, hemos generado rotavirus recombinantes que expresan varios FP: UnaG (verde), mKate (rojo lejano), mRuby (rojo), TagBFP (azul), CFP (cian) y YFP (amarillo)24,,27,28. Estos rotavirus de expresión de FP se fabrican sin eliminar el NSP3 ORF, produciendo así virus que se espera que codifican un complemento completo de proteínas virales que funcionan.

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Protocolo

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1. Preparación de medios y mantenimiento del cultivo celular

  1. Obtenga células renales de hámster bebé que expresen constitutivamente las células MA104 del ARN t7 (BHK-T7) y del riñón de mono verde africano.
    NOTA: Las células BHK-T7 (o BSR-T7) no están disponibles comercialmente, pero son una línea celular común de laboratorios que utilizan genética inversa para estudiar la biología del virus del ARN. La línea celular BHK-T7 utilizada en este protocolo fue obtenida de la Dra. Ursula J. Buchholz (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, USA), co-desarrolladorde la línea celular BHK original que expresa T7 RNA polimerasa29. Las celdas MA104 están disponibles en European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) y en American Type Culture Collection (ATCC).
  2. Preparar los siguientes medios de cultivo en un entorno estéril, preferiblemente un gabinete de seguridad biológica de clase II. Almacene los medios en la oscuridad a 4 oC y caliente a 37 oC inmediatamente antes de su uso.
    NOTA: Las fuentes de componentes de medios se proporcionan en la Tabla de materiales.
    1. Para preparar el medio incompleto de DMEM, combine 500 ml del medio esencial mínimo (MEM) modificado de Dulbecco que contiene 4,5 g/L de glucosa y 1% de glutamina con 5 ml de 100x pen-strep.
    2. Para preparar el medio completo dMEM, combine 500 mL de medio incompleto DMEM con 25 ml de suero bovino fetal (FBS).
    3. Para preparar el medio incompleto GMEM, combinar 500 ml de medio esencial mínimo de Glasgow, 5 ml de glutamina 100x, 50 ml de caldo de triptosa-fosfato (TPB), 5 ml de 100 aminoácidos no esenciales (NEAA), y 5 ml de 100x pen-strep.
    4. Para preparar el medio completo gMEM, combine 500 mL de medio incompleto GMEM con 25 ml de FBS inactivado por calor.
    5. Para preparar el medio completo GMEM+G, añadir 10 ml de genética de 50 mg/ml (G418) a 500 ml de medio completo GMEM.
    6. Para preparar el medio incompleto SMEM, combine 500 ml del MEM de Eagle modificado de Joklik, 5 ml de glutamina 100x, 50 mL de TPB, 5 mL de 100x NEAA y 5 mL de 100x pen-strep.
  3. Cultivo de células MA104 en matraces T75 o T175 que contienen 12 o 25 ml de medio completo DMEM, respectivamente. Para pasar las células MA104 que han alcanzado el 100% de confluencia, enjuague la monocapa celular 2x con solución salina tamponada de fosfato (PBS), disociar con tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) solución, y resuspender en 5 (matraz T75) o 10 mL de (matraz T175) de medio incompleto DMEM.
    1. Coloque 0,5 x 1,0 ml de células resuspendidas en matraces frescos y lleve al volumen final apropiado agregando el medio completo dMEM. Colocar los matraces en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
  4. Propagar células BHK-T7 en matraces T75, alternando entre el uso de GMEM y GMEM+G medio completo con cada ronda de paso. Para subculturar células BHK-T7 que han alcanzado el 100% de confluencia, enjuague la monocapa celular 2x con PBS, disocie con solución de trippsina-EDTA y resuspenda en 5 ml de medio.
    1. Después de colocar 15 ml de GEM o GMEM+G completo en un matraz T75 fresco, agregue cuatro gotas de células BHK-T7 resuspendidas. Colocar el matraz en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.

2. Preparación del plásmido

  1. Obtener los siguientes plásmidos que expresan rotavirus SA11 (+)ARN de Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 y pT7/NSP5SA111. Obtener el plásmido que expresa la enzima de tapado ASFV (pCMV/NP868R) de los autores21.
    NOTA: Los plásmidos pT7/NSP3SA11 modificados diseñados para expresar un FP a través de la actividad de un elemento traslacional 2A (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) también se pueden obtener de los autores24,,26. PT7/NSP3-2A-3xFL-FP plásmidos que expresan los siguientes FP están disponibles: UnaG (verde), mKate (rojo lejano), mRuby (rojo), TagBFP (azul), CFP (cian) y YFP (amarillo)24.
  2. Transformar plásmidos en Ecompetente . coli DH5 y esparcir bacterias en las placas de agar caldo de Luria que contienen el antibiótico adecuado. Cultivar cultivos bacterianos recogidos de colonias individuales y preparar cantidades más pequeñas de plásmido (20 g) utilizando un kit de purificación miniprep de espín(Tabla de materiales),de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Preparar grandes cantidades de plásmido de cultivos bacterianos utilizando kits de purificación midi y maxi(Tabla de materiales).
    NOTA: Los plásmidos adecuados para su uso en el sistema de genética inversa también se han preparado con otros kits de purificación de plásmidos. No es necesario preparar plásmidos utilizando kits diseñados específicamente para generar material libre de endotoxinas.
  3. Ajuste las concentraciones de plásmidos purificados a 1 mg/ml en agua de grado de biología molecular libre de nucleasas. Compruebe la pureza del plásmido confirmando una relación de absorción de 260/280 de 1,8 euros utilizando un espectrofotómetro. Además, utilice electroforesis en geles de agarosa al 0,8% para verificar que los plásmidos están predominantemente superbobinados.
  4. Plásmidos purificados de aliquot en tubos de microcentrífuga estériles de 0,5 ml, cada uno de los cuales contiene 10 l. Almacene los plásmidos a -80 oC.

3. Generación de virus recombinantes

NOTA: La investigación del rotavirus humano y animal, incluida la generación y caracterización de cepas de rotavirus recombinantes, debe tratarse en condiciones de nivel 2 de seguridad de la biotecnología (BSL-2) y requerirá la aprobación previa del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC). Las condiciones adecuadas de laboratorio de BSL-2 se describen en Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos (BMBL) producidos por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)30.

  1. Día 1: sembrado de células BHK-T7 en placas de 12 pocillos
    1. Enjuague una monocapa recién confluente de células BHK-T7 contenidas en un matraz T75 2x con PBS. Interrumpa la monocapa celular con la solución trypsin-EDTA y resuspenda las células en 5 ml de medio completo de GMEM.
    2. Utilice un contador de células automatizado y una solución trypan-blue para determinar la concentración de células BHK-T7 viables en el medio. Células de semilla en placas de cultivo celular de 12 pocillos, cada pocal que contiene 2 x 105 células en un volumen total de 1 mL de GMEM (libre de G418) medio completo. Incubar en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%. Las células deben alcanzar una confluencia del 80-90% para el día 2.
  2. Día 2: transfección de células BHK-T7 con mezclas de plásmido
    1. Para preparar la mezcla de plásmido, combine lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml utilizando existencias de plásmido ajustadas a 1 mg/ml: 0,8 ml cada una de plásmidos SA11 pT7 VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 y NSP4, 2,4 l cada uno de plásmidos SA11 pT7 NSP2 y NSP5, y 0,8 l de pCMV/NP868R. Mezcle suavemente los plásmidos tocando el tubo y recopile el contenido por centrifugación por pulso. Para preparar virus recombinantes que expresan FP, sustituya pT7/NSP3SA11 por el plásmido pT7/NSP3-2A-3xFL-FP adecuado.
      NOTA: Las mezclas de plásmido deben almacenarse en hielo hasta que se utilicen. Se debe preparar un tubo separado para cada transfección.
    2. Para preparar la mezcla de reactivos de plásmido/medio sérico reducido/transfección: Añadir 110 ml de medio sérico precalentado (37 oC) reducido(Tabla de materiales)a cada mezcla de plásmido y mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, añadir 32 l de reactivo de transfección(Tabla de materiales)a cada mezcla de color plásmido/reducción del medio sérico; esto produce una concentración de 2,5 ml de reactivo de transfección por g de plásmido en mezclas. Mezclas de vórtice suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Durante el período de incubación de 20 minutos, enjuague las células BHK-T7 en placas de 12 pocillos (preparadas el día 1) una vez con 2 ml de medios incompletos de GMEM. Después, añadir 1 mL de medio incompleto SMEM a cada pocal y devolver las placas a la incubadora.
    4. Después del período de incubación de 20 minutos, agregue el plasmido/reducción del medio sérico/la mezcla de transfección gota a gota a cada pocador de las placas de 12 pocillos utilizando un pipeteador de 200 l. Suavemente las placas de roca y volver a una incubadora de CO2 de 37oC, 5%.
  3. Día 4: trassando las células BHK-T7 transinfectadas con células MA104
    1. Enjuague una monocapa recién confluente de células MA104 contenidas en un matraz T75 2x con PBS. Interrumpa la monocapa usando la solución trypsin-EDTA y resuspenda las células en 5 ml de medio completo de DMEM.
    2. Usando un contador de células automatizado y una solución trypan-blue, determine la concentración de células MA104 viables en el medio. Ajuste la concentración a 8 x 105 células MA104/ml en medio incompleto DMEM y agregue 0,25 ml de células suspendidas (2 x 105 células) con gota a los pozos que contienen células BHK-T7 transinfectadas.
    3. Ajustar la concentración de tripsina (pancreática porcina tipo IX) en el medio a 0,5 g/ml añadiendo 0,8 ml de 1 mg/ml de stock de tripsina a cada pocal.
      NOTA: Las existencias de tripsina deben prepararse en PBS, alícuotas y almacenarse a -20 oC.
    4. Utilice las células MA104 restantes para preparar placas de 6 pocillos que serán necesarias en el día 7 para amplificar los virus recombinantes. Para las placas de 6 pocillos de semilla, diluir las células MA104 resuspendidas a una concentración de 1,5 x 105 células/ml en el medio completo de DMEM y colocar 2 ml en cada poca. Colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
  4. Día 7: recuperación y amplificación del virus recombinante de células transinfectadas
    1. Sujeto células BHK-T7/MA104 en placas de 12 pocillos a tres ciclos de congelación-descongelación en condiciones estériles, moviendo placas entre un congelador de -20 oC y una superficie de temperatura ambiente. Después de transferir los lysates a tubos de 1,5 ml, los tubos de centrífuga durante 10 minutos a 500 x g (4 oC) a los desechos celulares grandes de pellets. Recoger el sobrenadante y almacenar a 4 oC (corto plazo) o -20 oC (largo plazo).
    2. Lavar MA104 monocapas en placas de 6 pocillos (preparadas el día 4) 2x con PBS. Coloque 2 ml de medio incompleto DMEM en cada pocal que contenga 0,5 g/ml de trippsina. Añadir 300 sL de sobrenadante recuperado de los lysates de células BHK-T7/MA104 en pozos y colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
    3. Incubar placas durante 7 días o hasta que se observen efectos citopáticos completos (CPE). Células Lyse MA104 en placas de 6 pocillos por tres ciclos de congelación-descongelación, luego transfiere los lysates a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Pellet grandes desechos celulares por centrifugación durante 10 min a 500 x g (4 oC). Transfiera los lysates celulares clarificados a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdelos a -20 oC.

4. Aislamiento de placa de virus recombinantes

  1. Activar los virus en 100 oC de lisados celulares clarificados añadiendo tripsina a una concentración final de 10 g/ml e incubando a 37 oC durante 1 h. Preparar una serie de dilución en serie de 10 veces que van de 10-1 a 10-7 (1 ml cada una) en un medio incompleto DMEM.
  2. Enjuague MA104 monocapas en placas de 6 pocillos 2x con 2 ml de PBS y una vez con medio incompleto DMEM. Añadir 400 ml de diluciones de lisado por duplicado a las placas. Incubar las placas durante 1 h en una incubadora de 37oC, 5%co2, meciéndose cada 10 a 15 minutos para redistribuir las diluciones a través de la monocapa.
  3. Preparar una solución de superposición de agarosa-MEM combinando volúmenes iguales de medio esencial mínimo de 2x Eagle (EMEM; precalentado a 37oC) con 1,5% de agarosa que se ha derretido en agua utilizando un horno microondas y preenfriado a 45oC. Mantener la solución superpuesta a 42 oC utilizando un baño de agua y ajustar a una concentración final de 0,5 g/ml de trippsina inmediatamente antes de colocarla en las células.
  4. Extrae las diluciones de lisados de placas de 6 pocillos, luego enjuague las células una vez con 2 ml de DMEM incompleto. Superponga suavemente 3 ml de la solución de superposición de agarosa-MEM en la monocapa de celda contenida en cada pocil. Deje que la superposición de agarosa se endurezque a temperatura ambiente y, a continuación, devuelva las placas a la incubadora.
  5. Tres días más tarde, prepare una solución de superposición de agarosa-MEM como en el paso 4.3 y lleve a 42 oC. Inmediatamente antes de su uso, ajuste la solución de superposición a una concentración final de 50 g/ml de rojo neutro(Tabla de materiales).
  6. Agregue 2 ml de la solución de superposición encima de la capa de agarosa existente en las placas de 6 pocillos. Después de permitir que la nueva capa de agarosa se endurezque, devuelva las placas a la incubadora. Proteja las soluciones y placas que contienen rojo neutro de la exposición a la luz.
  7. Durante las siguientes 6 h, identifique las placas de rotavirus en las placas de 6 pocillos con la ayuda de una caja de luz. Escoja placas claramente definidas usando tuberías de transferencia desechables, recuperando tapones de agarosa que se extienden completamente a la capa celular.
  8. Expulsar el enchufe en un tubo de 1,5 ml que contenga 0,5 ml de medio incompleto DMEM y vórtice la muestra durante 30 s. Amplificar el virus aislado de placa eludado en el medio por propagación en monócapas MA104 en placas de 6 pocillos o t25 que contienen medio incompleto DMEM y trippsin a 0,5 g/ml.
    NOTA: En Arnold et al.31se encuentra disponible información adicional sobre el aislamiento y la titering del rotavirus mediante ensayo de placa.

5. Electroforesis de gel de dsRNA viral

  1. Colocar 600 ml de lysates celulares infectados clarificados y 400 l de tiocianato de guanidinio en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, vórtice durante 30 s e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 200 l de cloroformo, vórtice durante 30 s e incubar durante 3 min. Después de la centrifugación durante 5 min a 13.000 x g (4 oC), transfiera 550 ml de la fase acuosa superior a tubos nuevos.
  2. Recuperar dsRNA viral de la fase acuosa mediante la adición de 2 volúmenes (900 ol) de alcohol isopropílico frío y tubos invertidos 4 x 6x. Después de incubar a temperatura ambiente durante 10 min, tubos centrífugos durante 10 min a 13.000 x g (4 oC). Deseche los sobrenadores y conserve los pellets de ARN.
  3. Lavar los pellets añadiendo 1 ml de etanol al tubo, invirtiendo una vez y centrifugando durante 5 min a 7.500 x g (4 oC). Después de retirar cuidadosamente el lavado de etanol con un pipeteador, deje que los pellets de ARN se sequen al aire en el banco de laboratorio durante 5 a 10 minutos. Disolver los gránulos de ARN en 15 ml de agua de grado de biología molecular libre de nucleasas y almacenarlos a -20 oC.
  4. Combine 10 ml de muestras de ARN disuelto con 2 l de tampón de carga de ADN 6x, cargue en minigeles de poliacrilamida prefabricados al 10% (o equivalentes fundidos a mano) y resuelva los ARN por electroforesis en tampón de carrera Tris-glicina durante 2 h bajo una corriente constante (16 mA). Remoje los geles durante 5 a 10 minutos en agua que contengan bromuro de etidio de 1 g/ml y detecte segmentos del genoma del rotavirus con un transiluminador UV.

6. Recuperación y secuenciación del dsRNA viral

  1. Localice las bandas virales dsRNA en geles de poliacrilamida preferiblemente utilizando luz UV de longitud de onda larga de baja intensidad, para evitar generar reticulados de ácido nucleico. Con una cuchilla de afeitar fresca, corte los fragmentos de gel que contienen bandas dsRNA y transfiera a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Después de añadir 10 x 20 l de agua libre de RNase, tritura cada fragmento con una plaga de pellets desechables sin RNase diseñada para adaptarse a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o mediante la elaboración y bajada a través de una aguja de 18 G. Incubar fragmentos triturados durante la noche a 4oC.
  3. Recuperar 3 l de líquido de tubos que contienen fragmentos de gel triturados. Genere cDNAs de los drnA virales utilizando un kit de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa de un paso (RT-PCR)(Tabla de materiales)y imprimaciones de oligonucleótidos apropiadas.
    NOTA: Los productos PCR se purifican con gel con un kit de limpieza de PCR(Tabla de Materiales)y se envían para la secuenciación durante la noche, junto con los cebadores, por los servicios de secuencia de ADN comercial.

7. Análisis inmunoblot de proteínas virales

  1. Placas de 6 pocillos semilla con 3 x 105 células MA104 por pozo en un volumen total de 2 ml de medio completo DMEM. Colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% y dejar hasta que las células alcancen la confluencia (3-5 días).
    NOTA: Los pozos con monocapas confluentes contendrán 1,2 x10 celdas.
  2. Tratar los sobrenatos clarificados incubando con 10 g/ml de trippsina a 37 oC durante 1 h para activar las partículas de rotavirus recombinante contenidas en ellos.
  3. Enjuague MA104 monocapas en placas de 6 pocillos 2x con 2 ml de PBS. Infectar las células añadiendo, a cada pozo, 200 l de inóculo que contiene 3 x 5 unidades formadoras de placa (PFU) por célula de rotavirus activado por trippsina en medio incompleto DMEM. Devuelva las placas a la incubadora.
  4. Cada 10 minutos, retire las placas y mezcle suavemente para redistribuir el inóculo a través de la monocapa celular. Después de 1 h, reemplace el inóculo por un medio incompleto de 2 ml de DMEM.
  5. A las 8 h después de la infección, enjuague las células en placas de 6 pocillos 2x con PBS. Raspar las células en 750 s de PBS y transferir el volumen a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Enjuague la placa con otros 750 ml de PBS y combínelo con la muestra de 750 ml previarecogida.
  6. Células de pelet en la muestra centrifugando a 5.000 x g durante 10 min a 4oC. Después de desechar el sobrenadante, almacene los gránulos celulares a -80 oC hasta que se procesen más.
  7. Prepare el tampón de lisis celular que contenga 300 mM de NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2% Triton X-100 y 1 inhibidor completo de la proteasa libre de EDTA. Después de añadir 300 l de tampón de lisis a los gránulos de células congeladas, muestras de vórtice brevemente e incubar en hielo durante 10 min.
  8. Repita el proceso de vórtice e incubar muestras sobre hielo 3x. Después, las muestras de centrífuga a 15.000 x g durante 10 min a 4 oC, luego recoger los sobrenatolentes y almacenar a -80 oC.
  9. Resolver proteínas contenidas en volúmenes de 20 l de muestras de sobrenadantes por electroforesis en minigeles de poliacrilamida lineales prefabricados de 8 a 16% y transferencia a membranas de nitrocelulosa. Bloquear membranas incubando con PBS-Tween 20 (0.02%) solución que contiene un 5% de leche seca sin grasa.
  10. Sondas de membranas mediante la incubación con uno o más anticuerpos primarios (por ejemplo, antisuero anti-NSP3 o anti-VP6 de conejillo de indias, anticuerpo anti-Bandera M2 monoclonal de ratón o anticuerpo anti-PCNA monoclonal de conejo). Detectar anticuerpos primarios mediante la incubación de membranas con igG anti-ratón de caballo, conde anti-guinea IgG, o cabra anticonejo IgG rábano picante peroxidasa conjugada anticuerpos secundarios, seguido por el sustrato de quimioluminiscencia de quimioluminiscencia (ECL) mejorado. Visualice señales de luminiscencia utilizando un sistema de imágenes de gel(Tabla de materiales)o una película de rayos X.

8. Imágenes de células vivas de células infectadas con virus que expresan FP

  1. Placas de 6 pocillos semilla con 3 x 105 células MA104 por pozo en un total de 2 ml de medio completo DMEM. Colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% y dejar hasta que las células alcancen la confluencia (3-5 días).
    NOTA: Los pozos con monocapas confluentes contendrán 1,2 x10 celdas.
  2. Activar las muestras de rotavirus, de marea conocido, por incubación con 10 g/ml de trippsina a 37oC durante 1 h.
  3. Enjuague placas de 6 pocillos con MA104 monocapas 2x con 2 ml de PBS. Infectar las células añadiendo a cada pozo 200 l de inóculo que contiene 3 x 5 PFU por célula de rotavirus activado por trippsina en medio incompleto DMEM. Devuelva las placas a la incubadora y las placas de roca suavemente para redistribuir el inóculo a través de la monocapa celular cada 10 minutos.
    NOTA: Los pozos que se simulan infectados con inóculo DMEM libre de virus deben incluirse como controles.
  4. Después de 1 h de adsorción de virus, enjuague la monocapa 2x con PBS y reemplace el medio por 0,5 ml por pozo de medio incompleto DMEM. A las 7,5 h después de la infección, reemplace el medio de cultivo por DMEM con baja fluorescencia de fondo(Tabla de materiales). A las 8 h después de la infección, utilice un generador de imágenes de células vivas para examinar las células con un aumento de 20 x en busca de señal de fluorescencia verde, roja o azul.

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Resultados

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El protocolo de genética inversa descrito en este artículo se lleva a cabo a través de múltiples pasos distintos: (1) co-transfección de células BHK-T7 con vectores de transcripción de rotavirus pT7 y un plásmido de expresión pCMV/NP868R, (2) la sustitución de células BHK-T7 transinfectadas con células MA104, (3) amplificación de virus recombinantes presentes en las células BHK-T7/MA104 se lisia utilizando células MA104 y (4) el aislamiento de la placa del virus recombinante utilizando células MA104(...

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Discusión

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En nuestro laboratorio, nos basamos rutinariamente en el protocolo de genética inversa descrito aquí para producir rotavirus SA11 recombinantes. Con este enfoque, las personas con poca experiencia en técnicas de biología molecular o el trabajo con rotavirus recuperan virus recombinantes incluso en su primer intento. Hemos generado cerca de 100 virus recombinantes siguiendo este protocolo, incluidos aquellos con genomas que han sido rediseñados para expresar proteínas extrañas (por ejemplo, FPs) y que contienen adiciones ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones De NIH R03 AI131072 y R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, y el Lawrence M. Blatt Endowment. Agradecemos a los miembros del laboratorio IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, y Guido Papa por sus muchas contribuciones y sugerencias en el desarrollo del protocolo de genética inversa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Riñón de hámster bebé - T7 RdRP (BHK-T7) CélulasContacto: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Poliacrilamida Mini-GelBio-Rad45608105
Celómetro AutoT4 Contador de células viablesNexcelom
ChemiDoc MP Sistema de imagen en gelBio-Rad
ChloroformMP 194002
Clarity Western Quimioluminiscencia Mejorada (ECL) SustratoBio-Rad170-5060
E.coli competente DH5alpha BacteriaLucigen60602-2
Inhibidor completo de la proteasaPierceA32965
Pipetas de transferencia desechables, puntas extendidas ultrafinasMTC BioP4113-11
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Lonza12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)Calidad Biológica115-073-101
Etanol, Absoluto (200 pruebas)Fisher BioreagentsBP2818-500
Solución de bromuro de etidio (10 mg/ml)Invitrogen15585-011
Suero fetal bovino (FBS)Corning35-010-CV
Suero Fetal Bovino (FBS), Inactivado por CalorCorning35-011-CV
Bandera M2 Anticuerpo, Monoclonal de RatónSigma-AldrichF1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep KitSigmaNA0200-1KT
Geneticin (G-418)Invitrogen10131-027
Gibco FluroBrite DMEMThermoFisherA1896701DMEM con bajo fondo fluorescencia
Glasgow Medio esencial mínimo (GMEM)Gibco11710-035
IgG anti-conejo de cabra, peroxidasa de rábano picante (HRP)Tecnología de señalización celular7074S Conejillo de
Indias Anti-NSP3 AntisueroPatton55068
conejillo de indias Anti-VP6 AntierumPatton53963
IgG anti-conejillo de indias para caballos, peroxidasa de rábano picante (HRP) KPL conjugada5220-0366
IgG anti-ratón para caballos, tecnología de señalización celular conjugada con eroxidasa de rábano picante (HRP)7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Myco Kit de detección de PCRJH Science25235
Alcohol isopropílicoMacron3032-02
Solución de L-glutamina ( 100x)Gibco25030-081
Luria Agar Polvo (Miller's LB Agar)Productos de investigación RPIL24020-2000.0
Medio 199 (M199) Medio de cultivoHycloneSh30253.01
Mínimo Medio esencial -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)Lonza04-719Q
Riñón de mono (MA104) CélulasATCCATCC CRL-2378.1
Espectrofotómetro NanoDrop OneThermoScientific
Solución Roja Neutra (0,33%)Sigma-AldrichN2889-100ml
Solución de aminoácidos no esenciales (100x)Gibco11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Poliacrilamida Mini-GelInvitrogenXP00102BOX
Agua de grado de biología molecular libre de nucleasasInvitrogen10977-015
NucleoSpin Gel y kit de limpieza de PCRTakara740609.25
Opti-MEM Medio de suero reducidoGibco31985-070
Mortero de pellets (sin RNasa, desechable)Fisher12-141-368
Solución de penicilina-estreptomicina, (100x penn-strep)Corning30-002-Cl
Fosfato solución salina tamponada (PBS), 10xFisher BioreagentsBP399-20
Tripsina porcina, tipo IX-SSigma-AldrichT0303
Sistema de minipreparación de plásmido PureYieldPromegaA1223
Qiagen Kit Maxi de plásmidoQiagen Qiagen12162
Qiagen Kit Midi de plásmidoQiagen12143
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
SA11 pT7 Vectores de transcripciónAddgene89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Vectores de transcripción que expresan proteínas fluorescentesContacto: jtpatton@iu.edu
de placaKit RT-PCR de un solo paso SuperscriptIII Invitrogen12574-035
Trans-Blot Turbo Kit de transferencia de nitrocelulosaBio-Rad170-4270
Sistema de transferencia Trans-Llot TurboBio-Rad
TransIT-LTI Reactivo de transfecciónMirus MIR2306
Tampón de ejecución de gel Tris-Glycine-SDS (10x)Bio-Rad161-0772
Triton X 100Fisher BioreactivosBP151-500
Trizol Reactivo de extracción de ARNAmbion15596026
Azultripán Corning25-900-CI
Tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) Solución de disociación celularCalidad Biológico118-087-721
Caldo de fosfato de triptosaGibco18050-039
Tween-20VWR0777-1L
Vertrel VF solventeZoroG0707178
Zoe Generador de imágenes fluorescente de células vivasBio-Rad
conjugada lote de laboratorio lote de laboratorio SeaKem LE Agarose Lonza 50000 Para electroforesis en gel SeaPlaque agarose Lonza 50100 Para ensayo de

Referencias

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