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Artículo de método

Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

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DOI:

10.3791/61053

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4 de mayo de 2020

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

En este artículo

Resumen

Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.

Resumen

La espectrometría de masas de intercambio de deuterio de hidrógeno (HDX-MS) es un potente método para la caracterización biofísica de los cambios de conformación enzimática y las interacciones enzima-sustrato. Entre sus muchos beneficios, HDX-MS consume sólo pequeñas cantidades de material, se puede realizar en condiciones casi nativas sin necesidad de etiquetado enzimático/sustrato, y puede proporcionar información resuelta espacialmente sobre dinámicas de conformación enzimática, incluso para enzimas grandes y complejos multiproteína. El método se inicia mediante la dilución de la enzima de interés en tampón preparado en D2O. Esto desencadena el intercambio de protium en cruces de bonos péptidos (N-H) con deuterio (N-D). En los puntos de tiempo de intercambio deseados, las alícuotas de reacción se enfadan, la enzima se proteica en péptidos, los péptidos están separados por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), y el cambio en la masa de cada péptido (debido al intercambio de hidrógeno por deuterio) es registrado por LA. La cantidad de captación de deuterio por cada péptido depende en gran medida del entorno local de unión al hidrógeno de ese péptido. Péptidos presentes en regiones muy dinámicas del deuterio de intercambio de enzimas muy rápidamente, mientras que péptidos derivados de regiones bien ordenadas se intercambian mucho más lentamente. De esta manera, la tasa HDX informa sobre la dinámica de conformación de enzimas locales. Las perturbaciones a los niveles de captación de deuterio en presencia de diferentes ligandos se pueden utilizar para mapear sitios de unión de ligando, identificar redes alotéricas y comprender el papel de la dinámica de conformación en la función enzimática. Aquí, ilustramos cómo hemos utilizado HDX-MS para entender mejor la biosíntesis de un tipo de productos naturales péptidos llamados lanthipeptides. Los lanthipeptides son péptidos genéticamente codificados que son modificados post-traslacionalmente por enzimas grandes, multifuncionales y dinámicas conformadamente que son difíciles de estudiar con enfoques tradicionales de biología estructural. HDX-MS proporciona una plataforma ideal y adaptable para investigar las propiedades mecanicistas de este tipo de enzimas.

Introducción

Las proteínas son moléculas estructuralmente dinámicas que muestras de diferentes conformaciones en escalas de tiempo que van desde la vibración de unión a escala femtosecond hasta reordenamientos de dominios proteicos enteros que pueden ocurrir durante muchos segundos1. Estas fluctuaciones de conformación suelen ser aspectos críticos de la función enzimática/proteica. Por ejemplo, los cambios de conformación inducidos por la unión de ligando suelen ser de vital importancia para modular la función enzimática, ya sea organizando los residuos activos del sitio necesarios para la catálisis, definiendo sitios de unión de sustratos en mecanismos cinéticos secuenciales, protegiendo los intermediarios reactivos del medio ambiente o modulando la función enzimática a través de redes alotéricas. Estudios recientes también han demostrado que la dinámica de conformación se puede conservar a lo largo de la evolución y que las perturbaciones a los movimientos moleculares conservados pueden correlacionar con cambios en la especificidad del sustrato y la aparición de nuevas funciones enzimáticas2,3.

En los últimos años, la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) ha surgido rápidamente como una poderosa técnica para sondear cómo los paisajes de conformación de proteínas responden a perturbaciones como la unión de ligando o la mutagénesis4,5,6,7. En un experimento típico de HDX-MS(Figura 1),una proteína de interés se coloca en amortiguador preparado en D2O, lo que desencadena la sustitución de protones intercambiables con disolventes con deuteria. El tipo de cambio de la mitad de la mitad de los bonos de péptido depende fuertemente del pH, la secuencia local de aminoácidos, y del entorno estructural local de la mitad8. Las amides que se dedican a interacciones de unión al hidrógeno (como las presentes en α-helices y β hojas) intercambian más lentamente que en medio de regiones no estructuradas de la proteína que están expuestas a disolvente a granel. Por lo tanto, el alcance de la captación de deuterio es un reflejo de la estructura de la enzima. Se espera que las enzimas que son dinámicas de forma conformación, o que se someten a transiciones estructurales en la unión a los ligandos, produzcan una respuesta HDX medible.

La base mecanicista para el tipo de cambio lento de un medio estructurado se muestra en la Figura 25,8,9. Para someterse a HDX, la región estructurada primero debe muestrear transitoriamente una conformación desplegada, de manera que las moléculas solventes que catalizan el intercambio HDX a través de un mecanismo químico específico ácido/base, tengan acceso a la entresuela intercambiable. En última instancia, las magnitudes relativas del tipo de cambio químico (kchem) y las tasas de plegado y reencarnamiento (kopen y kclose) determinan la tasa HDX medida en el experimento5,8. A partir de este sencillo modelo cinético, está claro que el alcance de la captación de deuterio reflejará la dinámica de conformación subyacente (definida por kopen y kclose). La mayoría de los experimentos HDX-MS se realizan en un flujo de trabajo ascendente donde, tras la reacción de intercambio, la proteína de interés se digiere en péptidos y la captación de deuterio por cada péptido se mide como un aumento de la masa7. De esta manera, HDX-MS permite mapear perturbaciones a la dinámica de conformación enzimática en la escala espacial local de péptidos, lo que permite al investigador evaluar cómo la perturbación altera la dinámica en diferentes regiones de la enzima de interés.

Las ventajas del enfoque HDX-MS para dilucidar la dinámica estructural de las proteínas son numerosas. En primer lugar, el método se puede realizar con pequeñas cantidades de proteína nativa o en complejos proteicos en sistemas con estructura cuaternaria10. Ni siquiera es necesario que la preparación enzimática utilizada en el ensayo sea altamente purificada11,12, siempre y cuando el flujo de trabajo hdx-MS de abajo hacia arriba proporcione un número suficiente de péptidos identificados con confianza que cubren la secuencia de proteínas de interés. Además, HDX-MS puede proporcionar información sobre la dinámica de conformación en condiciones casi nativas sin la necesidad de etiquetado proteico específico del sitio, como se utilizaría en los estudios de fluorescencia de molécula única13,y no hay límite de tamaño para el complejo proteico o proteico que se puede investigar (lo que hace que enfoques como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear [NMR] sean desafiantes)7,14. Por último, se pueden emplear métodos HDX-MS resueltos en el tiempo para estudiar proteínas intrínsecamente desordenadas, que son difíciles de estudiar con cristalografía de rayos X15,16,17,18. La principal limitación de HDX-MS es que los datos son de baja resolución estructural. Los datos HDX-MS son útiles para señalar dónde están cambiando las dinámicas de conformación y para revelar cambios de conformación acoplados, pero a menudo no proporcionan mucha información sobre el mecanismo molecular preciso que impulsa el cambio observado. Los recientes avances en la combinación de métodos de disociación de captura de electrones con datos de proteínas HDX-MS han demostrado ser prometedores para mapear sitios de intercambio a residuos de aminoácidos individuales19,pero a menudo se necesitan estudios bioquímicos y estructurales de seguimiento para proporcionar claridad a los modelos estructurales reenviados por datos de HDX-MS.

A continuación, se presenta un protocolo detallado para el desarrollo de un ensayo HDX-MS20. Los protocolos de preparación de muestras que se presentan a continuación deben aplicarse generalmente a cualquier proteína que muestre una buena solubilidad en tampones acuosos. Los métodos de preparación de muestras más especializados y los flujos de trabajo HDX-MS están disponibles para proteínas que necesitan ser ensayos en presencia de detergente o fosfolípidos21,22,23,24. Los ajustes instrumentales para la recopilación de datos HDX-MS se describen para un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo de cuadrúpeda de alta resolución acoplado al sistema de cromatografía líquida. Los datos de complejidad y resolución similares podrían recopilarse en cualquiera de una serie de sistemas de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) disponibles comercialmente. También se proporcionan aspectos clave del procesamiento de datos mediante un paquete de software disponible comercialmente. También presentamos directrices para la recopilación y el análisis de datos que sean coherentes con las recomendaciones formuladas por la comunidad más amplia de HDX-MS12. El protocolo descrito se utiliza para estudiar las propiedades estructurales dinámicas de HalM2, una sintátida de lanthipéptido que cataliza la maduración multipaso de un producto natural de péptido antimicrobiano20. Ilustramos cómo HDX-MS se puede utilizar para revelar sitios de enlace de sustratos y propiedades alotéricas que han eludido la caracterización anterior. Varios otros protocolos sobre proteína HDX-MS se han publicado en los últimos años25,26. Junto con el trabajo actual, estas contribuciones anteriores deberían proporcionar al lector cierta flexibilidad en el diseño experimental.

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Protocolo

1. Preparación de reactivos deuterados y soluciones de stock enzimático

  1. Preparar reactivos necesarios para las reacciones HDX (incluyendo cualquier búfer, sales, sustratos, ligandos, etc.) como soluciones de stock concentrado de 100-200x en D2O (99,9% fracción atómica D). Prepare al menos 50 ml de solución de stock de búfer.
    NOTA: Para la caracterización de HalM2, se prepararon las siguientes soluciones: 500 mM MgCl2,100 mM tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 750 mM ATP (en búfer HEPES), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 y 500 m AMPM AMPPNP.
  2. Congelar y liofilizar las soluciones de stock para la sequedad.
  3. Re-disolver en D2O, y repetir ciclo de liofilización al menos un tiempo adicional para reemplazar tantos de los protones intercambiables con deuterones como sea posible.
  4. Ajuste el pD del material de amortiguador HEPES deuterado al valor deseado con NaOD/DCl concentrado, teniendo en cuenta la siguiente relación27:
    figure-protocol-1
    NOTA: La velocidad HDX de la amide depende en gran medida del pL de la solución (pL = pH o pD)5. Los diferentes lotes de soluciones de almacenamiento en búfer deben prepararse, almacenarse y utilizarse de manera idéntica para evitar una ligera deriva de pL entre experimentos.
  5. Calcule la cantidad de cada reactivo necesario para un ensayo HDX de 300 μL y almacene como coácuotas de un solo uso a -80 °C.
  6. Preparar una solución de almacenamiento enzimático concentrado (~100-200 μM) en un búfer de almacenamiento enzimático protado utilizando un filtro centrífugo(Tabla de Materiales)o dispositivo equivalente.
    NOTA: El amortiguador exacto y el corte de peso molecular del filtro centrífugo dependerán de la proteína/enzima de interés. HalM2 se almacena en HEPES de 50 mM, pH 7,5, 100 mM KCl y 10% de glicerol. Se utilizaron filtros de 10 kDa para preparar la enzima concentrada.
  7. Aliquot la enzima en porciones de un solo uso y almacenar a -80 °C.
    NOTA: Esto puede ser un punto de parada. Todas las soluciones de stock descritas en la sección 1 se pueden preparar antes de las reacciones HDX. Si se almacenan a -80 °C, la mayoría de las enzimas/soluciones de stock deuterado serán estables durante muchos meses.

2. Calibración del volumen de enfriamiento HDX

  1. Prepare una reacción HDX de 300 μL en D2O utilizando los reactivos deuterados y las poblaciones de enzimas concentradas preparadas en la sección 1.
    1. Utilice una concentración final enzimática de 1-5 μM.
    2. Utilice una concentración de búfer HEPES deuterada final de al menos 50-100 mM.
    3. Asegúrese de que las concentraciones de otros componentes sean suficientes para mantener la actividad/función enzimática deseada.
  2. Preparar 1 L de solución de enfriamiento HDX (fosfato de 100 mM, 0,8 M guanidina-HCl, pH 1.9). Congelar y almacenar en porciones de 50 ml (para stock a largo plazo) y 1 mL porciones (para aliquots de un solo uso).
    NOTA: La composición exacta del búfer de enfriamiento dependerá de la enzima que se utilice en el paso de proteolisis del flujo de trabajo HDX-MS ascendente (paso 3.3.3). El búfer de enfriamiento dado aquí es compatible con pepsina, la proteasa más utilizada para HDX-MS. Si se utiliza una proteasa diferente, consulte con el proveedor de proteasa para garantizar la compatibilidad del búfer.
  3. Calibrar el volumen de búfer de enfriamiento necesario para ajustar el pL final de la mezcla de reacción HDX saciada a un valor de lectura de medidor de pH de 2,3.
    NOTA: El tipo de cambio H/D solvente de la unión N-H de peptídica es un proceso dependiente del pH que está sujeto a catálisis ácida y base. El tipo de cambio mínimo se produce a un valor de pH 2,5 (lectura del medidor de pH = 2,3 para una mezcla de 50:50 H2O:D2O). Por lo tanto, un valor final de pL cerca de 2,5 minimizará el intercambio posterior de hidrógeno que se produce durante el análisis LC-MS de abajo hacia arriba, preservando así la etiqueta de deuterio en los péptidos.
    1. Mezcle 50 μL de la mezcla de reacción HDX del paso 2.1 con 50 μL de búfer de enfriamiento y mida el pL de la mezcla saciada con un electrodo de micro yema.
    2. Aumente el volumen de la solución de enfriamiento según sea necesario para ajustar la lectura final del medidor de pH a un valor de 2,3.
    3. Una vez determinado el volumen de enfriamiento adecuado, repita el proceso de enfriamiento varias veces utilizando alícuotas frescas de 50 μL de la reacción HDX (paso 2.1) para asegurarse de que se logra un pL final consistente al adición de una cantidad fija de búfer de enfriamiento.

3. Preparación de muestras de referencia y optimización del flujo de trabajo LC-MS de abajo hacia arriba

  1. Preparar muestras de referencia no deuteradas para la proteína de interés en triplicato en tubos de 0,5 ml. Asegúrese de que las condiciones de mezcla de reacción final sean idénticas a las utilizadas en las reacciones HDX auténticas (paso 2.1), excepto que las reacciones se preparan en H2O utilizando soluciones de stock reactivos también preparadas en H2O.
  2. Enciba las muestras como en el paso 2.3 agregando el volumen adecuado de búfer de enfriamiento para ajustar el pH final a 2.5. Flash congelar las muestras en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta que estén listas para su análisis.
  3. Analice las muestras de referencia enzimática protadas utilizando un flujo de trabajo LC-MS ascendente.
    NOTA: Antes de ejecutar estos pasos, el sistema LC-MS que se utilizará para la adquisición de datos debe calibrarse correctamente y estar listo para su uso. La sincronización y la temperatura de todos los pasos en el flujo de trabajo LC-MS de abajo hacia arriba deben controlarse rigurosamente para minimizar las diferencias en el intercambio posterior entre muestras. Con la instrumentación de EM utilizada en este protocolo (Tabla de materiales y Información de apoyo), la mayoría de los pasos se pueden controlar a través del software del instrumento. Para garantizar la recopilación de réplicas precisas, se recomienda automatizar tantos de los pasos del flujo de trabajo como sea posible.
    1. Retire una muestra de referencia enzimática individual (preparada como en el paso 3.2) del congelador y descongele a 37 °C durante 1 minuto en un baño de agua.
    2. Precisamente 2 minutos después de extraer la muestra del congelador y descongelar, inyecte una porción de 40 μL de la muestra de referencia saciada en una columna de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) que contenga una fase estacionaria funcionalizada con pepsina (una proteasa estable en ácido).
    3. Digerir la muestra a un caudal de 100 μL/min durante 3 min a 15 °C utilizando ácido fórmico del 0,1% en H2O (pH = 2,5) como disolvente.
    4. Recoge los péptidos pépticos mientras se escapan de la columna de pepsina a una columna de trampa C18 mantenida a 0,4 °C para minimizar el intercambio posterior.
    5. Pase los péptidos pépticos desalados de la columna de trampa a una columna analítica C18 (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) mantenida y operada a 0,4 °C para la separación de los péptidos pépticos.
      NOTA: Los pasos 3.3.3−3.3.5 pueden ser automatizados por ciertos sistemas LC-MS utilizados para la adquisición de datos HDX-MS. Alternativamente, estos pasos se pueden realizar de forma independiente, teniendo en cuenta que el tiempo y la temperatura de cada paso deben controlarse cuidadosamente para lograr un intercambio posterior consistentemente bajo.
    6. Elute la columna C18 con un sistema de disolvente de acetonitrilo/agua/0,1% de ácido fórmico. Optimice el gradiente LC para la proteína de interés con el fin de maximizar la separación y preservar la etiqueta de deuterio en los péptidos pépticos.
      NOTA: Los detalles de la elución de degradado se proporcionan en la información de soporte.
    7. Someta el digerido péptico a la espectrometría de masas de ionización de electrospray (ESI).
      NOTA: Las condiciones de origen proporcionadas en la información de soporte proporcionarán una ionización suficiente para la mayoría de los péptidos pépticos.
      1. Una vez ionizado en el instrumento MS, realice una separación de movilidad de iones de fase de gas utilizando nitrógeno como gas amortiguador para mejorar la capacidad máxima del método.
      2. Después de la separación de movilidad de iones, someta los iones precursores pépticos a un flujo de trabajo mse que implica ciclos alternos de baja energía de colisión (4 V) y alta energía de colisión (21-40 V).
        NOTA: Los regímenes alternos de energía de baja y alta colisión permiten la recopilación de datos de EM (baja energía de colisión) simultáneamente con datos MSMS (alta energía de colisión). Esto, a su vez, permite la correlación de tiempo de los iones precursores con sus respectivos iones de fragmento. Esta correlación es esencial para la identificación segura de péptidos descrita en la sección 4.
      3. Detecte el precursor del péptido y los iones de fragmento utilizando un analizador de masas con una potencia de resolución de al menos 20.000.
      4. Simultáneamente con la adquisición de datos, adquiera datos de EM para un estándar externo [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
        NOTA: El flujo de trabajo de MS descrito en el paso 3.3.7 se conoce como un protocolo MSE. Los ajustes instrumentales completos de un protocolo MSE adecuado para HDX-MS de abajo hacia arriba se proporcionan en la información de soporte.
    8. Evaluar la calidad de los datos de LC-MS.
      NOTA: Utilizando el protocolo descrito anteriormente y los ajustes instrumentales proporcionados en la información de soporte,las muestras de referencia deben producir un cromatograma iónico total con una intensidad máxima de señal de aproximadamente 1 x 108. Debe haber muchos péptidos pépticos que eluden entre 3-9 min(Figura 3A-C).
    9. Inyecte 40 μL de muestras en blanco (0,1% de ácido fórmico en agua) para limpiar las columnas de pepsina y analíticas C18.
      NOTA: En general, 2-3 espacios en blanco deben ser suficientes.
    10. Repita los pasos 3.3.1−3.3.9 para cada una de las muestras de proteína de referencia triplicada.

4. Tratamiento de los datos de referencia y definición de una lista de péptidos

  1. Analice los datos sin procesar de MSE (paso 3.3.7) utilizando software de proteómica (Tabla de materiales). Con el software proteomics, vaya a Bibliotecas | Bancos de datos de secuencia de proteínas para definir la base de datos de proteínas importando la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés.
    NOTA: El objetivo de este paso es buscar péptidos pépticos derivados de la proteína de interés y utilizar los datos MSMS (adquiridos simultáneamente con los datos de EM) para validar cualquier identificación de péptido putativo.
  2. Dar un nombre a la secuencia proteica de interés. Importe la secuencia de proteínas (en formato FASTA). El software realizará una digestión en silico de la proteína de la base de datos para generar una lista de péptidos que se utilizarán para buscar los datos de LC-MS.
  3. Defina los parámetros de procesamiento (ubicados en el menú Biblioteca). Seleccione Electrospray MSE como tipo de adquisición de datos. En el campo Bloquear masa para cargar 2, escriba 785.8426 para el m/z para el 2+ ión de [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) y haga clic en finalizar.
  4. Defina los parámetros de flujo de trabajo (ubicados en el menú Biblioteca).
    1. Seleccione Electrospray MSE para el tipo de búsqueda. En el | flujo de trabajo Encabezado Consulta de búsqueda de base de datos, seleccione la proteína de base de datos creada en el paso 4.2 en el campo Banco de datos.
    2. Cambie El reactivo de resumen primario a inespecífico y desactive el campo Reactivo modificador fijo manteniendo pulsado el botón Ctrl mientras hace clic en Carbamidomethyl C.
  5. Especifique el directorio de salida navegando a las opciones | configuración de automatización | Identidad E. Marque las casillas apex 3D y péptido salida 3D y salida de contabilidad de iones y especifique el directorio deseado.
  6. Procese los datos de ejemplo de referencia.
    1. En la barra de herramientas izquierda del espacio de trabajo de la plataforma proteómica, cree una nueva placa haciendo clic con el botón derecho en La placa de microtitro. Resalte tres pozos en la placa de microtíter (uno por cada muestra de referencia recogida en la sección 3). Haga clic izquierdo en un pozo, mantenga pulsado y arrastre a tres pozos.
    2. Haga clic con el botón derecho y seleccione Agregar datos sin procesar. En la ventana que aparece, vaya al directorio que contiene los tres archivos de referencia de la sección 3 y selecciónelos al mismo tiempo.
    3. Haga clic en siguiente y elija los parámetros de procesamiento definidos en el paso 4.3. Haga clic en siguiente y seleccione los parámetros de flujo de trabajo definidos en el paso 4.4. A continuación, haga clic en finalizar.
  7. Una vez que los datos sin procesar, los parámetros de procesamiento y los parámetros de flujo de trabajo se han asignado a cada pozo de la placa, los pozos aparecerán azules. Seleccione los pozos, haga clic con el botón derecho y seleccione procesar los últimos datos sin procesar. Haga clic en la esquina inferior derecha de la ventana para realizar un seguimiento del procesamiento de los datos. Una vez que aparece el mensaje No hay trabajo que ejecutar, el procesamiento se realiza completamente.
  8. Una vez completado el procesamiento de datos, los pozos de la placa se volverán verdes. Haga clic con el botón derecho en los pozos y seleccione ver los resultados del flujo de trabajo. Se abrirá una ventana independiente para cada archivo de datos de referencia.
  9. Inspeccione los datos para asegurarse de que la mayoría de las señales de EM en los datos de la muestra de referencia se asignaron con éxito a péptidos predichos a partir de la digestión en silico de la proteína de interés. Los péptidos coincidentes se colorearán en azul en el espectro de salida (Figura 4). Haga doble clic en el filtro OK y compruebe que la cobertura porcentual es superior al 99%.
    NOTA: Al procesar, la salida de datos se guardará automáticamente con la extensión de archivo(raw_data_file_name_IA_final_peptide) en el directorio especificado en el paso 4.5.
  10. Importe la salida de software de proteómica en el software de procesamiento HDX (Tabla de materiales) para umbrales adicionales.
    1. Haga clic en Datos en la esquina izquierda de la ventana de software de procesamiento HDX. Haga clic en importar resultados PLGS y haga clic en el icono agregar. Elija los archivos de datos procesados del paso 4.9 navegando al directorio adecuado.
    2. Haga clic en Siguiente y especifique los siguientes parámetros: iones consecutivos mínimos ≥ 2, error de masa = 5 ppm y umbral de archivo = 3. Haga clic en finalizar.
  11. Una vez satisfecho con los parámetros de umbral, guarde el proyecto HDX. Todos los datos HDX se importarán a este proyecto para su análisis y visualización.
    NOTA: Las muestras intercambiadas de deuterio descritas en la siguiente sección deberán procesarse con un flujo de trabajo LC-MS idéntico. Por lo tanto, antes de continuar con los ensayos HDX (sección 5), asegúrese de que la preparación de la muestra (sección 2), el flujo de trabajo LC-MS ascendente (sección 3) y los flujos de trabajo de procesamiento de datos (sección 4) están proporcionando la reproducibilidad deseada y la cobertura de secuencia de la proteína objetivo. Si es necesario cambiar cualquiera de estos procesos para mejorar la cobertura, se recomienda volver al paso 2.1, preparar muestras de referencia nuevas en triplicato y repetir las secciones 2-4 (mientras se realizan los ajustes necesarios en el protocolo) para asegurarse de que cada péptido se puede generar y detectar reproduciblemente.

5. Realización de reacciones HDX

  1. Prepare el espacio de trabajo para las reacciones HDX.
    1. Búfer de enfriamiento pre-alícuota en tubos de 0,5 ml correctamente etiquetados. Prepare un tubo diferente para cada punto de tiempo, cada réplica y cada estado bioquímico a analizar. Utilice el volumen adecuado de búfer de enfriamiento del paso 2.2 necesario para ajustar la lectura final del medidor de pH de una porción de 50 μL de la reacción HDX a un valor de 2,3.
    2. Centrífuga brevemente las tinas de 0,5 ml para transferir todo el búfer de enfriamiento a la parte inferior del tubo. Coloque los tubos sobre hielo.
    3. Llene un pequeño Dewar con nitrógeno líquido y manténgalo junto al espacio de trabajo.
  2. Prepare las reacciones HDX. Asegúrese de que haya suficiente volumen de reacción para recoger el número deseado de puntos de tiempo de intercambio (una alícuota de 50 μL por cada punto de tiempo deseado). Recoger al menos 4-5 puntos de tiempo sobre 3-4 órdenes de magnitud en escala de tiempo (por ejemplo, tiempos de enfriamiento de 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min] y 14.400 s [4 h] proporcionan una cobertura adecuada de la dinámica de intercambio para la mayoría de las enzimas).
    1. Premezcla todos los componentes deuterados (menos enzima) del paso 1.1 en D2O.
    2. Para cada estado bioquímico a examinar (enzima libre, enzima + ligando, enzima + inhibidor, etc.), preparar reacciones HDX en al menos triplicato.
    3. Incubar las mezclas de reacción en un baño de agua con temperatura controlada a 25 °C durante 10 minutos antes de la adición de la enzima.
      NOTA: La enzima debe prepararse como una solución de stock concentrado (~100−200 μM, paso 1.6) para minimizar la adición de protium en el ensayo HDX.
    4. Al añadir la enzima a una concentración final de 1-5 μM, comience el temporizador. Mezcle cuidadosamente y rápidamente la solución utilizando una pipeta de 200 μL para asegurarse de que la enzima se distribuye uniformemente en la muestra.
    5. En los puntos de tiempo de intercambio deseados, retire 50 alícuotas de μL de la reacción HDX y mezcle rápida y uniformemente con el búfer de enfriamiento helado pre-alícuota en un tubo de 0,5 ml.
      NOTA: Los volúmenes de mezcla y el procedimiento de mezcla deben ser lo más precisos y reproducibles posible para garantizar que el pL de enfriamiento final deseado de 2.3 se alcance rápidamente en todas las muestras. Mantener frío el tampone de tampones de enfriamiento ayudará a minimizar el intercambio posterior tras la desnaturalización de la enzima.
    6. Inmediatamente después de apagar la muestra HDX, tapar el tubo y congelar el flash en nitrógeno líquido.
    7. Continúe recogiendo puntos de tiempo hasta que se completen todos los ensayos y, a continuación, transfiera muestras al congelador -80 °C para su almacenamiento.
      NOTA: Esto puede ser un punto de parada. Después de recopilar todos los puntos de tiempo HDX, las muestras se pueden almacenar a -80 °C hasta que estén listas para el análisis de LC-MS. Idealmente, las reacciones HDX triplicada deben realizarse para todos los estados bioquímicos de interés en el mismo día. Como mínimo, todas las reacciones HDX de réplica para un estado bioquímico determinado deben ejecutarse en paralelo el mismo día.
  3. Después de recopilar todos los puntos de tiempo HDX saciados, someta las muestras al flujo de trabajo optimizado de LC-MS ascendente desarrollado como se describe en el paso 3.3. Inyecte muestras HDX en un orden aleatorio con un número adecuado de espacios en blanco entre muestras para asegurarse de que cualquier transporte de péptidos sea mínimo.
    NOTA: Los datos HDX no necesitan ser recogidos en modo MSE. Por lo tanto, el segmento de energía de colisión alta (paso 3.3.7.2) debe ser eliminado del ciclo de trabajo MS. Esta debe ser la única alteración realizada en el flujo de trabajo descrito en el paso 3.3.
  4. Evalúe la calidad de los datos HDX a medida que se recopilan.
    1. Asegúrese de que los picos cromatográficos presentes en el cromatograma iónico total de las muestras de referencia no deuteradas aparezcan al mismo tiempo de retención en las muestras deuteradas (como en la Figura 3D-F).
    2. Asegúrese de que los espectros de masas resumidos en intervalos de tiempo específicos a partir de muestras de referencia y deuteradas muestren evidencia de deuteración (es decir, un cambio en el sobre isotópico de péptidos individuales a valores m/z más altos en las muestras deuteradas [Figura 6]).

6. Procesamiento de datos HDX

  1. Importe los datos HDX en el proyecto HDX creado en el paso 4.11 haciendo clic en Datos | MS Archivos en la barra de herramientas superior.
    1. Haga clic en Nuevo estado y Nueva exposición según sea necesario para definir los estados bioquímicos (por ejemplo, enzima libre, enzima + ligando, etc.) y los tiempos de exposición al deuterio, respectivamente, que son pertinentes para el análisis.
    2. Haga clic en Nuevo raw para seleccionar los archivos de datos HDX que se analizarán. Asigne los tiempos de intercambio adecuados y el estado bioquímico a cada archivo de datos sin procesar que se importe.
      NOTA: Los datos se pueden importar y procesar en lotes, o todos a la vez. Agregar datos al proyecto no deshacerá ningún análisis que se haya realizado previamente dentro de ese proyecto.
  2. Una vez agregados los archivos de datos, haga clic en Finalizar para iniciar el procesamiento de datos. Después de un breve retraso, el software preguntará si el usuario desea guardar los datos antes de continuar. Haga clic en Sí.
    NOTA: El procesamiento inicial puede tardar hasta varias horas dependiendo de cuántas muestras se estén analizando, cuántos péptidos hay en la lista final de péptidos (paso 4.10), el tamaño de la ventana cromatográfica y la frecuencia de adquisición espectral.
  3. Si lo desea, modifique los parámetros de procesamiento en el menú Configuración para cambiar los parámetros de búsqueda de iones. Asegúrese de emplear los mismos parámetros de búsqueda de iones para todos los datos de un proyecto determinado.

7. Análisis y visualización de los datos HDX

NOTA: Una vez completado el procesamiento inicial de los datos sin procesar (paso 6.2), el software de procesamiento HDX habrá localizado péptidos de la lista de péptidos (generados en el paso 4.10) en cada uno de los archivos de datos sin procesar que se analizaron. Una vez que la distribución del isótopo para un péptido en la lista se encuentra en un archivo de datos sin procesar, el software de procesamiento HDX representa cada isótopo con un "palo" (como en la figura 6C-E). Las intensidades relativas de los palos para un péptido dado se utilizan para calcular la captación de deuterio en relación con los espectros de referencia. Mientras que el software de procesamiento HDX hace un trabajo admirable de asignar correctamente "palos" a la mayoría de los péptidos, todavía se requerirá una curación manual significativa de los valores de captación de deuterio.

  1. Análisis de los valores de captación de péptidos
    1. Seleccione el primer péptido en la lista de péptidos y abra el trazado espectral apilado en el menú Vistas. Desplázate hacia arriba y hacia abajo en la ventana de trazado de espectros apilados para ver los espectros de masas del péptido seleccionado en función del tiempo de intercambio de deuterio (Figura 7D,E).
    2. Asigne y desasigne palos según sea necesario utilizando clics del ratón para asegurarse de que la distribución adecuada del isótopo se ha ubicado en los datos y que cada pico isótopo se ha asignado (los palos asignados aparecerán azules). Al hacer clic en cualquiera de los espectros de la gráfica espectral apilada (Figura 7D,E) permitirá al usuario asignar/anular la asignación de sticks en la ventana visor de datos activa (Figura 7C).
    3. Compruebe las asignaciones de stick para cada estado de carga alternando el estado de carga en la parte superior de la ventana de trazado espectral apilado.
    4. Repita los pasos 7.1.1−7.1.3 para cada estado de interés bioquímico. El estado bioquímico también se puede alternar en la parte superior de la ventana de trazado espectral apilado. Para las mediciones de diferencia de absorción de deuterio más precisas, asegúrese de que los palos se asignan para el mismo conjunto de estados de carga para cada estado bioquímico.
    5. Repita los pasos 7.1.1−7.1.4 para cada péptido en la lista de péptidos.
    6. Compruebe la desviación estándar de los valores de captación de deuterio péptido utilizando el mapa de cobertura.
      1. Acceda al mapa de cobertura desde el menú Vistas, que muestra cada péptido de la lista de péptidos asignada a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés (Figura 8C). Coloree los péptidos según la desviación estándar relativa (unidades de Da).
      2. Busque visualmente en el mapa péptidos atípicos con una desviación estándar relativa alta. Haga clic en los péptidos atípicos en el mapa de cobertura para rellenar los trazados espectrales apilados(Figura 8B)y la ventana visor de datos (Figura 8A) con el péptido de destino.
      3. Utilizando la gráfica espectral apilada, compruebe cuidadosamente que todos los estados de carga y todos los puntos de tiempo del péptido atípico tienen palos asignados adecuadamente.
        NOTA: Muy a menudo, los péptidos con grandes desviaciones estándar (>0.3 Da) tienen picos isotópicos que el software no asignó adecuadamente palos (como se indica en la Figura 8B). La asignación de los palos que faltan generalmente permitirá reducir la desviación estándar relativa de un péptido a <0.3 Da.
      4. Oculte el péptido de la lista si la desviación estándar relativa no se puede reducir a menos de 0,3 Da.
  2. Exporte datos de diferencia HDX entre dos estados bioquímicos para mapear un modelo estructural de la proteína de interés.
    1. Muestre la diferencia de interés en el mapa de cobertura. Haga clic con el botón derecho en el mapa de cobertura para exportar los datos de diferencia a un archivo .csv. Exporte los datos de estado (en formato .csv) navegando a Data | Exportar datos de estado en la barra de herramientas principal.
      NOTA: El formato adecuado de los datos de diferencia y los archivos de datos de estado se proporciona en la información de soporte.
    2. Importe los datos de diferencia, los datos de Estado y el archivo pdb de la proteína de interés en Deuteros28. Elija el intervalo de confianza del 99%, seleccione habilitar sumay procese los datos.
      NOTA: MATLAB debe estar instalado en el PC para poder ejecutar Deuteros. Deuteros utilizará las mediciones de réplica en el conjunto de datos para calcular la desviación estándar de los datos de captación para cada péptido. Esta desviación estándar se utilizará para definir el intervalo de confianza para un intercambio significativo, que se mostrará en los trazados.
    3. En Opciones PyMOL, seleccione | de captación de exportación exportar para generar un script Pymol para asignar regiones de diferencia de intercambio significativa en la estructura pdb de la proteína de interés utilizando el software PyMOL.
      NOTA: Utilizando el flujo de trabajo descrito en este protocolo, el intervalo de confianza del 99% para la diferencia significativa de absorción de deuterio para un péptido dado en un único punto de tiempo es típicamente 0,3−0,5 Da. El intervalo de confianza del 99% para la diferencia resumida sobre todos los puntos de tiempo de intercambio es típicamente 0,7−1,0 Da.

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Resultados

Es necesario evaluar la calidad de la digestión proteótica y la reproducibilidad del flujo de trabajo para cada conjunto de inyecciones de muestra. Por lo tanto, antes de realizar ensayos HDX-MS, es esencial establecer condiciones efectivas para la proteolisis de la proteína de interés, para la separación de péptidos utilizando cromatografía líquida en fase inversa y movilidad de iones de fase de gas, y para la detección de péptidos utilizando EM. A tal fin, las muestras de referencia para la proteína de interés (recogid...

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Discusión

El flujo de trabajo HDX-MS presentado en este protocolo proporciona una plataforma notablemente robusta para mapear la distribución espacial de elementos estructuralmente dinámicos en proteínas y para investigar cómo estas dinámicas cambian en respuesta a la perturbación (unión de ligando, mutagénesis enzimática, etc.). HDX-MS tiene varias ventajas distintas sobre otros enfoques de biología estructural que se utilizan comúnmente para investigar la dinámica de conformación. En particular, sólo se necesitan pequeñas cantid...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá, los Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, la Fundación Canadiense para la Innovación y los fondos de puesta en marcha de la Universidad McGill.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
[glu-1]-fibrinopéptido B (Glu-Fib)BioBasicNA
0,5 mL Amicon Ultracel 10k dispositivo de filtración centrífuga (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
acetonitriloFisherA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
ácido fórmicoThermo Fisher28905
guanidina-HClVWR97063-764
HEPESFisherBP310-1
Cloruro de magnesioSiGMA-Aldrich63068-250G
Cloruro depotasioFosfato de potasio BioBasicPB0440
TCEP se sintetizó a pedido
Nombre del material/equipoCompañíaNúmero de catálogo>Comments/Description
software
DeuterosAndy M C Lau, et alversión 1.08
DynamXWatersversión 3.0
MassLynxWatersversión 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Watersversión 3.0.3
PyMOLSchrö versión2.2.2
Nombre del Material/ EquipoCompañíaNúmero de catálogoComentarios/Descripción
Instrumentos y equipos
ACQUITY UPLC BEH C18 analítica Aguasde columna186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Precolumnade Waters186003978
Sistema ACQUITY UPLC M-Class HDXWaters
Waters
Electrodo de pH de micropunta ThermoFisher13-620-291
Waters Enzymate BEH columna o pepsina solumnWaters186007233
Waters Synapt Aguas
El péptido de T012500 de Clorhidrato de TRC Canadá BioBasic PB0445 HDX Manager G2-Si

Referencias

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