Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.
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Artículo de método
Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes
En este artículo
Resumen
Resumen
Los testículos de Drosophila son un poderoso sistema modelo para estudiar procesos biológicos, incluida la biología de células madre, la arquitectura nuclear, la meiosis y el desarrollo de espermatozoides. Sin embargo, el immunolabeling del testículo entero de Drosophila se asocia a menudo a la no uniformidad significativa de la coloración debido a la penetración del anticuerpo. Las preparaciones aplastadas solo superan parcialmente el problema, ya que disminuye la calidad 3D de los análisis. Adjunto, describimos un protocolo del entero-montaje usando NP40 y heptano durante la fijación junto con immunolabeling en medios líquidos. Conserva el volumen adecuado para la microscopía confocal junto con un etiquetado reproducible y fiable. Mostramos diferentes ejemplos de reconstitución 3D de los núcleos de espermatocitos de secciones confocales. La reproducibilidad intra e inter-testículo permite la cuantificación 3D y la comparación de la fluorescencia entre células individuales de diferentes genotipos. Se utilizaron diferentes componentes de la estructura intranuclear MINT (Mad1-que contiene intra territorio nuclear), así como dos componentes asociados con el complejo de poros nucleares para ilustrar este protocolo y sus aplicaciones en las células más grandes del testículo, los espermatocitos S4-S5.
Introducción
Los testículos de Drosophila son un modelo valioso para el estudio de la arquitectura nuclear. En las células espermatogoniales mitóticas, el volumen nuclear está ocupado en gran medida por la cromatina. Estas células se someten a cuatro rondas de división, produciendo un quiste de 16 espermatocitos primarios. Durante los próximos días, los espermatocitos pasan por 6 etapas de desarrollo (S1-S6), aumentando en gran medida en volumen, aproximadamente 20 veces1,2. También cambian su morfología nuclear. El contorno del núcleo, revelado por la lamina Dm0, se vuelve irregular y muestra profundas invaginaciones
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Protocolo
1. Colección de testículos de Drosophila
NOTA: Los varones jovenes (0-15 h poste-eclosion) son necesarios para examinar las células de germen diploides (es decir, espermatogonia y spermatocytes).
- Seleccione las moscas jóvenes tanto como sea posible para minimizar la interferencia del desarrollo de espezátidas.
- Anestesiar a las moscas por breve exposición al dióxido de carbono y transferir a una almohadilla de mosca14,15.
- Bajo un microscopio de disección (aumento de 10x), use fórceps para extraer la cabeza.
- Transfiera de 5 a 10 moscas decapitad....
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Resultados
El principal obstáculo para obtener una tinción adecuada de los testículos de Drosophila es la limitada penetrabilidad de los anticuerpos, que se ha resuelto parcialmente mediante el uso de preparaciones aplastadas pero a costa de inducir una restricción de los análisis 3D (por ejemplo, representación 3D o medida de colocalización). El procedimiento permite un etiquetado uniforme y preserva el volumen de todas las células del testículo. Aquí hemos centrado la ilustración del método en la representación 3D de los espermat.......
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Discusión
Este protocolo proporciona un método para el immunolabeling acertado de los testículos adultos de Drosophila del entero-montaje. Como se informó en otros procedimientos, se deben usar machos jóvenes (incluso se acortó la edad a menos de 20 horas después de la eclosión) para minimizar la presencia de espermatozoides en desarrollo, lo que corre el riesgo de obstruir los espermatocitos. La disección debe ser rápida y la dilución de anticuerpos debe ajustarse para optimizar la relación señal/ruido21,<.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por los anticuerpos y A. Debec, los centros de stock de Bloomington y Viena para las moscas. Gracias a C. Jackson por sus sugerencias y discusiones estimulantes.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Regalo de A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, París, Francia) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 15 de mayo de 2011; 124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | ID de VDRC | 110218 | Centro de ARNi de Drosophila de Viena |
| Materials | |||
| DAPI | La | D1306 | debe prepararse en H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Puntas de pipeta de diámetro ancho | Fisherbrand | 11917744 | Punta de gran apertura |
| Thermo Scientific 0,2 mL Tubo individual | Thermo | AB-0620 | |
| Tubos de microcentrífuga de 2 ml | Sigma | T3531-200EA | Tubo siliconado de 2 ml |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Suero de cabra normal (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehído 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehído (4%) disuelto en PBS 1X ; alícuota en 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, sin calcio, sin magnesio |
| 0,1% (0,2 o 0,3%) PBS-T | PBS 1X que contiene 0,1% (0,2 % o 0,3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, para biología molecular, | Sigma | T8787 | |
| GFP | fuerte Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Ratón anti-Mtor | 1/40 regalo de J. Johansen, Universidad Estatal de Iowa | ||
| Rata anti-Nup62 | 1/200 regalo de H. Ohkura (Universidad de Edimburgo, Reino Unido | ||
| Conejillo de indias anti-Ulp1 | Regalo 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidad Erasmus, Róterdam | ||
| Conejo anti-Raf2 | Regalo 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidad Erasmus, Róterdam | ||
| Serie conjugada DyLight | Thermo | 1/500 Burro anti-(cobaya, ratón, conejo o rata) como segundos anticuerpos |
Referencias
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M.
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Reimpresiones y permisos
