Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.
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Artículo de método
Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes
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Resumen
Resumen
Los testículos de Drosophila son un poderoso sistema modelo para estudiar procesos biológicos, incluida la biología de células madre, la arquitectura nuclear, la meiosis y el desarrollo de espermatozoides. Sin embargo, el immunolabeling del testículo entero de Drosophila se asocia a menudo a la no uniformidad significativa de la coloración debido a la penetración del anticuerpo. Las preparaciones aplastadas solo superan parcialmente el problema, ya que disminuye la calidad 3D de los análisis. Adjunto, describimos un protocolo del entero-montaje usando NP40 y heptano durante la fijación junto con immunolabeling en medios líquidos. Conserva el volumen adecuado para la microscopía confocal junto con un etiquetado reproducible y fiable. Mostramos diferentes ejemplos de reconstitución 3D de los núcleos de espermatocitos de secciones confocales. La reproducibilidad intra e inter-testículo permite la cuantificación 3D y la comparación de la fluorescencia entre células individuales de diferentes genotipos. Se utilizaron diferentes componentes de la estructura intranuclear MINT (Mad1-que contiene intra territorio nuclear), así como dos componentes asociados con el complejo de poros nucleares para ilustrar este protocolo y sus aplicaciones en las células más grandes del testículo, los espermatocitos S4-S5.
Introducción
Los testículos de Drosophila son un modelo valioso para el estudio de la arquitectura nuclear. En las células espermatogoniales mitóticas, el volumen nuclear está ocupado en gran medida por la cromatina. Estas células se someten a cuatro rondas de división, produciendo un quiste de 16 espermatocitos primarios. Durante los próximos días, los espermatocitos pasan por 6 etapas de desarrollo (S1-S6), aumentando en gran medida en volumen, aproximadamente 20 veces1,2. También cambian su morfología nuclear. El contorno del núcleo, revelado por la lamina Dm0, se vuelve irregular y muestra profundas invaginaciones1,3. Esto se acompaña de extensos cambios en la expresión génica y modificaciones en la organización de la cromatina1,4,5,6,7. Los cromosomas interfase están bien definidos en la etapa S4-S5, formando tres masas distintas correspondientes a los 2 autosomas bivalentes principales y el par X-Y acoplado con el nucleolo.
Mad1 fue aislado originalmente como un componente clave del punto de control mitótico (revisado en8). En interfase, se describe como situado principalmente en la envoltura nuclear, sino también en el nucleoplasma9,10,11. En el testículo de Drosophila, divulgamos que Mad1 es prominente en el nucleoplasma, asociado íntimo a las dos masas de cromatina de un autosoma principales y en un grado inferior a la cromatina XY. Definimos esta estructura asociada a la cromatina como MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Otras cuatro proteínas se asociaron con MINTs en espermatocitos: la nucleoporina Mtor/Tpr, la SUMO peptidasa Ulp1, la proteína de punto de control mitótico Mad2 y una subunidad de un complejo similar a Polycomb Raf212.
Para terminar la descripción de MINTs, necesitábamos utilizar los anticuerpos y nos enfrentamos con los problemas técnicos encontrados generalmente con immunostaining en testículo: una permeabilidad pobre dando por resultado una no uniformidad significativa de la coloración en la profundidad del testículo, particularmente en los spermatocytes grandes. Slas preparaciones anuladas aumentaron el acceso a los anticuerpos, pero llevaron a imágenes comprimidas, restringiendo los análisis 3D y previniendo la medición de la fluorescencia cuantitativa, incluida la colocalización. El problema de la penetración de anticuerpos también podría abordarse mediante agentes permeabilizantes como el desoxicolato de Na al0,3%,pero este procedimiento no arrojó resultados reproducibles en nuestras manos. Debido a que realizamos muchos experimentos de co-etiquetado, buscamos mejorar el protocolo de permeabilización. La combinación de NP40 del 1% más heptano dio lugar a más reproducibilidad, particularmente en el estudio de los spermatocytes grandes.
Este protocolo realiza la fijación e inmunotensión de los testículos en suspensión, mejorando la calidad de la muestra, así como mejorando la reproducibilidad, y haciéndola adecuada para la microscopía confocal. Utilizamos el protocolo para definir mejor las relaciones espaciales de ciertas proteínas nucleares de la envoltura con las estructuras nucleoplásmicas de espermiocitos grandes. Este método permitirá mejores investigaciones de los cambios que acompañan el desarrollo de los espermatozoides, por ejemplo, los cambios estructurales dinámicos del núcleo, incluyendo la cromatina, el nucleoplasma y los poros nucleares.
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Protocolo
1. Colección de testículos de Drosophila
NOTA: Los varones jovenes (0-15 h poste-eclosion) son necesarios para examinar las células de germen diploides (es decir, espermatogonia y spermatocytes).
- Seleccione las moscas jóvenes tanto como sea posible para minimizar la interferencia del desarrollo de espezátidas.
- Anestesiar a las moscas por breve exposición al dióxido de carbono y transferir a una almohadilla de mosca14,15.
- Bajo un microscopio de disección (aumento de 10x), use fórceps para extraer la cabeza.
- Transfiera de 5 a 10 moscas decapitadas a 100 μL del tampón de Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inhibidor completo de proteínas, pH 6.8) en un portaobjetos de vidrio recubierto de silicona sobre un soporte de fondo negro.
- Con el microscopio de disección con un aumento de 40x, use un par de pórceps número 5 para sostener una mosca entre el tórax y el abdomen y, con otros tórceps, aleje el abdomen del tórax. Aísle rápidamente los testículos y los tejidos adyacentes de la canal de la mosca15 y colóquelos en una nueva gota del tampón de Ringer en el mismo portaobjetos.
- Una vez que todos los testículos estén listos, limpie los testículos de los tejidos restantes (glándula accesoria y genitales externos).
- Elimine el exceso de búfer de la gota que contiene los testículos disecados. Por lo general, utilice una pipeta p200 con una punta de 10 μL instalada encima de una punta de 200 μL. Esto permite la eliminación del exceso de líquido a través de una pequeña abertura. Coloque una gota de fijador de paraformadehído al 4% en la parte superior de la gota que contiene los testículos disecados, y luego transfiera rápidamente los testículos a un tubo que contenga una solución fijadora fresca.
2. Fijación de paraformadehído
- Preparar 2 mL de solución fijadora justo antes de su uso: 600 μL de paraformadehído al 4% diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 30 μL de NP40 al 20% más 1200 μL de heptano en un tubo de microcentrífuga siliconado de 2 mL. Utilizar paraformadehído al 4% en PBS preparado en alícuotas de 600 μL y almacenado a -20°C.
Precaución: El heptano y el paraformaldehído son tóxicos y deben manipularse en una campana extractora de humos. Disponer de ellos de acuerdo con las regulaciones del instituto anfitrión. - Transfiera los testículos usando una micropipeta p200 con una punta de apertura amplia a la solución PFA/NP40/heptano. Agite el tubo hacia arriba y hacia abajo durante 30 s a mano. Continuar fijando los testículos en una batidora rotativa a temperatura ambiente durante 30 min.
- Detenga la mezcladora rotativa y coloque el tubo en un estante de tubos para permitir la separación de fases y para que los testículos se asienten en la parte inferior del tubo.
- Retire todo el heptano y la solución fijadora y enjuague los testículos rápidamente tres veces con 1x PBS.
- Transferir a un tubo individual limpio de 200 μL. Realizar todas las incubaciones en estos pequeños tubos para minimizar las cantidades de anticuerpos empleadas.
- Retire el exceso de tampón utilizando una micropipeta de 200 μL con una punta P200 y una P10 conectadas. Tenga cuidado de no aspirar testículos.
- Mantenga los testículos en 1x PBS sobre hielo hasta que todas las muestras estén listas.
3. Tinción de anticuerpos en solución
- Deseche el PBS y deje los testículos en PBS-T al 0,3% durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares.
- Pre-incubar en el mismo almacenador intermediario más el suero normal de la cabra del 5% (NGS) para 1 h.
- Añadir 200 μL del anticuerpo primario diluido en PBS-T al 0,3% más NGS al 5%(Tabla de Materiales).
- Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C (o temperatura ambiente) con agitación suave en un balancín.
- Lavar 3 veces en PBS-T al 0,3% durante 15 min en un balancín a temperatura ambiente. Permita que los testículos se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad.
- Añadir 200 μL de anticuerpo secundario diluido 1:500 de la serie conjugada DyLight.
- Incubar el anticuerpo secundario en una cámara oscura durante 4 h a temperatura ambiente.
- Lavar en PBS-T al 0,3% durante 15 min en un balancín a temperatura ambiente. Después repetir con PBS-T al 0,2% y AL 0,1% PBS-T, cada vez durante 30 min en un balancín a temperatura ambiente. Haga un lavado final en 1x PBS durante 30 min para eliminar el detergente.
- Añadir 180 μL de solución DAPI a 1 μg/mL en 1x PBS durante 15 min. La solución común es de 10 mg/mL enH2O. Evite hacer una solución común en PBS, que puede reducir la señal de tinción dapi en la cromatina difusa en espermatocitos más grandes.
- Lavar 3x durante 5 min cada uno.
- Utilice una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos limpio.
- Aspirar los testículos y ponerlos en la diapositiva. Pre-enjuague de la punta de apertura amplia con 0.1% PBS-T evita que los testículos se peguen a la punta. Elimine el exceso de PBS.
- Añadir una gota (aproximadamente 100 μL) de Citifluor AF1.
- Coloque suavemente una cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar atrapar burbujas de aire.
- Selle la cubierta a la diapositiva con esmalte de uñas transparente.
- Observe los portaobjetos en un microscopio.
4. Análisis de colocalización
- Adquirir imágenes confocales. Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 710 (aceite apocromático 63x Plan) con una resolución z de 0,5 o 1 μm.
- Seleccione diferentes células de testículos independientes.
- Importe imágenes al software de procesamiento (por ejemplo, Imaris).
- Defina el núcleo por segmentación manual para excluir los núcleos vecinos. Utilice el software Coloc; recoge los coeficientes de correlación de Pearson (PCCs) dentro de todo el volumen entre 2 fluoróforos.
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Resultados
El principal obstáculo para obtener una tinción adecuada de los testículos de Drosophila es la limitada penetrabilidad de los anticuerpos, que se ha resuelto parcialmente mediante el uso de preparaciones aplastadas pero a costa de inducir una restricción de los análisis 3D (por ejemplo, representación 3D o medida de colocalización). El procedimiento permite un etiquetado uniforme y preserva el volumen de todas las células del testículo. Aquí hemos centrado la ilustración del método en la representación 3D de los espermat...
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Discusión
Este protocolo proporciona un método para el immunolabeling acertado de los testículos adultos de Drosophila del entero-montaje. Como se informó en otros procedimientos, se deben usar machos jóvenes (incluso se acortó la edad a menos de 20 horas después de la eclosión) para minimizar la presencia de espermatozoides en desarrollo, lo que corre el riesgo de obstruir los espermatocitos. La disección debe ser rápida y la dilución de anticuerpos debe ajustarse para optimizar la relación señal/ruido21,<...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por los anticuerpos y A. Debec, los centros de stock de Bloomington y Viena para las moscas. Gracias a C. Jackson por sus sugerencias y discusiones estimulantes.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Regalo de A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, París, Francia) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 15 de mayo de 2011; 124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | ID de VDRC | 110218 | Centro de ARNi de Drosophila de Viena |
| Materials | |||
| DAPI | La | D1306 | debe prepararse en H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Puntas de pipeta de diámetro ancho | Fisherbrand | 11917744 | Punta de gran apertura |
| Thermo Scientific 0,2 mL Tubo individual | Thermo | AB-0620 | |
| Tubos de microcentrífuga de 2 ml | Sigma | T3531-200EA | Tubo siliconado de 2 ml |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Suero de cabra normal (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehído 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehído (4%) disuelto en PBS 1X ; alícuota en 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, sin calcio, sin magnesio |
| 0,1% (0,2 o 0,3%) PBS-T | PBS 1X que contiene 0,1% (0,2 % o 0,3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, para biología molecular, | Sigma | T8787 | |
| GFP | fuerte Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Ratón anti-Mtor | 1/40 regalo de J. Johansen, Universidad Estatal de Iowa | ||
| Rata anti-Nup62 | 1/200 regalo de H. Ohkura (Universidad de Edimburgo, Reino Unido | ||
| Conejillo de indias anti-Ulp1 | Regalo 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidad Erasmus, Róterdam | ||
| Conejo anti-Raf2 | Regalo 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidad Erasmus, Róterdam | ||
| Serie conjugada DyLight | Thermo | 1/500 Burro anti-(cobaya, ratón, conejo o rata) como segundos anticuerpos |
Referencias
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