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Artículo de método
Este protocolo describe la clonación y expansión de células T reguladoras humanas para la generación de Treg humanas viables de ultra alta pureza con desmetilación estable en la región desmetilada específica de Treg (TSDR) y características fenotípicas específicas de Treg.
Las células T reguladoras humanas (Treg) son notoriamente difíciles de aislar en alta pureza dados los métodos actuales de enriquecimiento de Treg. Estos métodos se basan en la identificación de Treg a través de varios marcadores de superficie celular dependientes de la activación con diferentes niveles de expresión en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Por lo tanto, las poblaciones aisladas como "Treg" a menudo contienen un número considerable de células efectoras no Treg (es decir, Teff) que dificultan la caracterización fenotípica y funcional precisa de estas células, su caracterización genómica y proteómica, su enumeración confiable en diferentes estados de salud y enfermedad, así como su aislamiento y expansión con fines terapéuticos. Esto último, en particular, sigue siendo un obstáculo importante, ya que la expansión inadvertida de las células efectoras que se encuentran en compartimentos celulares relevantes para Treg (por ejemplo, células T CD4 + CD25 + ) puede hacer que la inmunoterapia basada en Treg sea ineficaz o incluso perjudicial. Este trabajo presenta un método que evita los problemas asociados con el aislamiento y la expansión de Treg basados en la población y muestra que la generación de clones candidatos a Treg con la posterior selección, cultivo y expansión de solo células monoclonales cuidadosamente examinadas, permite la generación de un producto de células Treg ultrapuras que se puede mantener en cultivo durante muchos meses. permitiendo la investigación posterior de estas células, incluso para posibles aplicaciones terapéuticas.
El propósito de este protocolo es permitir la propagación in vitro de Treg humano clonal de ultra alta pureza. El aislamiento de las poblaciones enriquecidas con Treg y la posterior clonación permiten la selección de los fenotipos deseados de Treg y su expansión para un estudio más detallado de la biología de estas células, la exploración de su posible utilidad terapéutica y otras aplicaciones experimentales posteriores.
La clonación de Treg producirá una pureza de Treg significativamente mejor que los enfoques de aislamiento y expansión policlonal. Esto se debe a la exclusión fiable y controlada de células....
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Este protocolo sigue todas las directrices institucionales relativas a la conducta ética de la investigación que implica el uso de muestras humanas. El trabajo con células humanas y otros productos sanguíneos humanos debe realizarse al menos en un entorno con certificación BSL-2 siguiendo las pautas de seguridad BLS-2 como mínimo.
1. Preenriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica humana para células CD4 + CD127loCD25hi
PRECAUCIÓN: Utilice una técnica estéril en todo momento. Deseche los objetos punzocortantes inmediatamente en un r....
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La implementación exitosa de este protocolo conducirá a la generación de clones y líneas de células T reguladoras humanas estables.
La preselección/preenriquecimiento de las células CD4+CD127loCD25hi fue un método sencillo para obtener una población inicial que contuviera la mayor parte de las células Treg humanas (Figura 1A-C). No todos los clones mostraron un fenotipo Treg. La preselección de clones mediante la m.......
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Este protocolo describe la propagación de células T reguladoras humanas ultrapuras a través del aislamiento, la expansión y la investigación cuidadosa de las células obtenidas en un enfoque de dilución limitante y expansión basado en células alimentadoras a partir de poblaciones iniciales que contienen Treg.
Los pasos críticos en este enfoque son: 1) la elección de una población inicial apropiada. En general, el compartimento CD127loCD25hi
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Los autores no tienen nada que revelar.
Este proyecto contó con el apoyo del Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número K08EY025324 (Nowatzky) y por un Premio Colton Scholar del Centro Judith y Stewart Colton para la Autoinmunidad (Nowatzky).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; m Stericup, 500 mL | Millipore | 5500 | Almacenamiento y preparación de medios |
| 100x Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140-050 Componente de | medios |
| Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL (50/bolsa, caja de 500) | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | Componente de medios |
| 25 ml Cuenca de pipeta de pocillo único | Fischer Scientific | 13-681-508 | |
| Tubo de centrífuga cónico de 50 mL (25/manguito) | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50x Penicilina Estreptomicina Soln | Corning | Corning, 30-001-Cl | Componente de medios |
| CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Tapón de rosca PP estéril 1,8 mL | Nalge Nunc | 377267 | |
| DMSO | Corning | 25-950-CQC | |
| Kit de selección positiva EasySep Human CD25 | Stemcell Technologies | 18231 | Las alternativas son la clasificación basada en columnas FACS o MACS |
| EasySep Human CD4+CD127low T Cell Pre-Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19231 | Las alternativas son la clasificación basada en columnas FACS o MACS |
| EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Kit de aislamiento de células T reglamentarias (alternativa al artículo 12) | Stemcell Technologies | 18063 | Las alternativas son la clasificación basada en columnas FACS o MACS |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-5442-03 | PBMC purificación de sangre periférica de productos de leucoféresis; medio de gradiente de densidad |
| Suero AB humano (PHS-AB) | Valley Biomedical Inc | HP1022 | Componente de medios |
| LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas azules fijables, para excitación UV | Thermo Fischer | L-34962 | Tinte de viabilidad |
| Fitohemaglutinina-L (PHA-L) | Millipore/Sigma | 11249738001 | Estimulación de células T |
| IL-2 recombinante (p. ej., PROLEUKINâ ) | Prometheus | / Componente de medios | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Componente de medios |
| Anticuerpos de tinción para citometría de flujo (fenotipado Treg) | Ver "Comentarios" | Ver "Comentarios" | Los anticuerpos de tinción se incluyen en: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PMCID de PubMed Central: PMC6497402. En caso de que se utilice el kit de selección positiva EasySep Human CD25, teñir con el anticuerpo anti-CD25 2A3 o BC96, por ejemplo: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629) |
| TCR Vβ Kit de repertorio; IOTest Beta Mark | Beckman Coulter | PN IM3497 | Verificación de expansiones para monoclonalidad Placa de cultivo de |
| tejidos, 96 pocillos, fondo en U con tapa de baja evaporación Corning | 353077 |
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