Una guía de sección, corte y procesamiento de imágenes para adquisición y análisis de muestras óseas corticales de alto rendimiento para Micro-TC sincrotrón

Summary

Empleamos un protocolo geológico (coring) de muestreo para adquirir muestras óseas corticales de tamaño uniforme para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método es mínimamente destructivo, eficiente, resulta en muestras cilíndricas que minimizan los artefactos de imagen de formas de muestra irregulares y mejora la visualización y análisis microarquiitectural.

Abstract

El hueso es un tejido dinámico y mecánicamente activo que cambia de estructura sobre la vida útil humana. Los productos del proceso de remodelación ósea han sido estudiados sustancialmente utilizando técnicas bidimensionales tradicionales. Los recientes avances en la tecnología de imágenes de rayos X a través de tomografía micro-computarizada de escritorio (μCT) y tomografía micro-computarizada de radiación sincrotrón (SRμCT) han permitido la adquisición de escaneos tridimensionales de alta resolución (3D) de un campo de visión más grande (FOV) que otras técnicas de imágenes 3D (por ejemplo, SEM) proporcionando una imagen más completa de las estructuras microscópicas dentro del hueso cortical humano. Sin embargo, la muestra debe centrarse con precisión dentro del FOV para limitar la aparición de artefactos de rayas conocidos por afectar el análisis de datos. Estudios anteriores han reportado la adquisición de bloques óseos rectilíneas de forma irregular que resultan en artefactos de imágenes debido a bordes irregulares o truncamiento de imagen. Hemos aplicado un protocolo de muestreo geológico (coring) para adquirir especímenes de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método de coring es eficiente y mínimamente destructivo para el tejido. Crea muestras cilíndricas uniformes que disminuyen los artefactos de imagen por naturaleza de ser isométricos durante la rotación y proporcionan una longitud de trayecto uniforme para los haces de rayos X a lo largo del escaneo. El procesamiento de imágenes de datos tomográficos de rayos X de muestras con forma irregular y de cored confirma el potencial de la técnica para mejorar la visualización y el análisis de la microarquitectura ósea cortical. Un objetivo de este protocolo es ofrecer un método confiable y repetible para la extracción de núcleos óseos corticales que es adaptable para varios tipos de experimentos de imágenes óseas de alta resolución. Un objetivo general de la obra es crear una adquisición de hueso cortical estandarizado para SRμCT que sea asequible, consistente y directa. Este procedimiento puede ser adaptado por investigadores en campos relacionados que comúnmente evalúan materiales compuestos duros como antropología biológica, geociencias o ciencias materiales.

Introduction

Con los recientes avances en la tecnología de imágenes, ahora es factible adquirir datos de imágenes de rayos X con muy alta resolución. Los sistemas micro-CT de escritorio (μCT) son el estándar actual para el hueso canceloso por imágenes debido a su naturaleza no destructiva¹. Sin embargo, cuando las características microestructurales por imágenes del hueso cortical, el uso de μCT ha sido más limitado. Debido a las restricciones de resolución, los sistemas de escritorio no pueden alcanzar la resolución necesaria para crear imágenes de características microestructurales más pequeñas que los poros corticales, como las lagunas de osteocitos. Para....

Protocol

Todos los especímenes procedían de donantes cadavéricos embalsamados de la Universidad de Toledo, la Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida y la Universidad Médica del Noreste de Ohio (NEOMED), con el consentimiento informado del propio donante o de los parientes más cercanos del donante. La Junta de Revisión Institucional para la Protección de los Sujetos Humanos (IRB) de la Universidad de Akron consideró que estos especímenes estaban exentos de una revisión completa del IRB, ya que no se adquirieron de individuos vivos. La información demográfica, incluida la edad, el sexo y la causa de la muerte, estaba disponible para todos los donantes. Los individuos selecci....

Results

El método descrito de muestreo básico demostró ser altamente eficaz y eficiente. La perforación de muestras utilizando este protocolo permitió la adquisición de muestras de tamaño consistente de >300 para experimentos en la línea de haz CLS BMIT-BM^2,con un FOV de ~2 mm a 1,49 μm de tamaño voxel. Para validar la consistencia del diámetro del núcleo, se tomaron tres mediciones a lo largo de la longitud (superior, media, inferior) de un subconjunto de núcleos femorales anteriores humanos (n

Discussion

No ha habido un protocolo integral y estandarizado para adquirir muestras uniformes y cilíndricas de núcleo óseo cortical para imágenes SRμCT de alta resolución con configuraciones limitadas de FOV. El protocolo detallado aquí llena ese vacío proporcionando un tutorial completo sobre cómo adquirir muestras de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para imágenes SRμCT y la posterior visualización y extracción precisas de datos microarquiitecturales. Hemos demostrado que nuestro protocolo proporciona un método más esta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carburo de corte por inmersión de 1-1/8" para materiales compuestos	Warrior	61812	28,6 mm de inmersión
70% Etanol	Fisher Scientific	BP8201500	3,8 litros
Pinzas de punta roma	Fisher Scientific	10-300
Tubos de centrífuga	ThermoFisher	55398
Crystalbond 509-3 Epoxi	Ted Pella	821-3
CTAnalyser	Bruker microCT	v.1.15.4.0	Descargar e instalar en https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool Kit	Amazon	787269885110
Hoja de sierra de oblea de diamante para material compuesto	Buehler	#11-4247
Taladro Prensa	de chorro Molino/Taladro	350017	Modelo: JMD-15, las taladradoras de sobremesa son sustitutos adecuados, pero normalmente carecen de una mesa de máquina traducible para colocar las muestras debajo del vástago
de perforación Pinzas de punta fina	Fisher Scientific	22-327379
Pinzas de fijación para la mesa de la máquina XY para molino/taladro	MSC Industrial Supply	#04804571
Portaobjetos de microscopio de vidrio	Ted Pella	26005	Portaobjetos de 75x50mm, 1mm de espesor
Mandril de corredera de vidrio	Buehler	#112488	Lo suficientemente grande como para contener correderas de vidrio de 75x50 mm
Placa calefactora capaz de alcanzar 140 & grados; C	Incubadora	HP88850105
ThermoScientific	NAPCO	Modelo 4200
Isocut Fluido	Buehler	111193032	Lubricante; 30mL
Broca de diamante para joyeros	Otto Frei	#119.050	Broca de perforación de tallo hueco de 2 mm de diámetro interior
NRecon	Bruker microCT	v.1.6.10.2	Descargar e instalar en https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Sierra oscilante	Harbor Freight	62866
Platos de vidrio aptos para horno	Pyrex	1117715	Contenedor de almacenamiento de alimentos de vidrio
Sierra de precisión de baja velocidad (Isomet 1000)	Buehler	111280160
Hojas de afeitar	Amazon	25181
Latas de aluminio poco profundas	Amazon		B01MRWLD0R ~ 8 cm de diámetro
Tazas de muestra	Amazon	616784425436 885334344729
Tergazyme detergente	Alconox	1304-1	caja de 1,8 kg
Limpiador ultrasónico	MTI Corporation	KJ201508006