Imágenes de células vivas del ciclo de vida del depredador bacteriavo Bdellovibrio mediante microscopía de fluorescencia Time-Lapse

Resumen

Aquí se presenta un protocolo que describe el monitoreo del ciclo de vida completo de la bacteria depredadora Bdellovibrio bacteriovorus usando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo en combinación con una almohadilla de agarosa y platos de imágenes celulares.

Resumen

La bacteria Bdellovibrio es una pequeña bacteria depredadora gramnegativa que mata otras bacterias gramnegativas, incluidos los patógenos dañinos. Por lo tanto, se considera un antibiótico vivo. Para aplicar B. bacteriovorus como un antibiótico vivo, primero es necesario entender las principales etapas de su complejo ciclo de vida, particularmente su proliferación dentro de sus presas. Hasta ahora, ha sido un reto monitorear las sucesivas etapas del ciclo de vida depredador en tiempo real. Aquí se presenta un protocolo integral para la imagen en tiempo real del ciclo de vida completo de B. bacteriovorus,especialmente durante su crecimiento dentro del huésped. Para este propósito, se utiliza un sistema que consiste en una almohadilla de agarosa en combinación con platos de imágenes celulares, en el que las células depredadoras pueden moverse libremente debajo de la almohadilla de agarosa, mientras que las células de presa inmovilizadas son capaces de formar bdelloplasts. La aplicación de una cepa que produce una subunidad de ADN polimerasa III con etiquetas fluorescentes permite además controlar la replicación cromosómica durante la fase de reproducción del ciclo de vida de B. bacteriovorus.

Introducción

Bdellovibrio bacteriovorus es una bacteria pequeña (0,3-0,5 m por 0,5-1,4 m) gramnegativa que se aprovecha de otras bacterias gramnegativas, incluidos patógenos nocivos como Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Shigella flexneri^1,,2,,3. Dado que B. bacteriovorus mata patógenos, se considera un antibiótico vivo potencial que se puede aplicar para combatir las infecciones bacterianas, particularmente las causadas por cepas multirresistentes.

B. bacteriovorus presenta un ciclo de vida peculiar qu....

Protocolo

1. Preparación de B. bacteriovorus lysate para análisis microscópico

1. En un matraz de 250 ml, configure la cocultura combinando 1 ml de cultivo fresco de 24 h B. bacteriovorus (por ejemplo, HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) y 3 ml de cultivo de presas durante la noche (por ejemplo, E. coli S17-1 pZMR100) con 50 mL de tampón Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂ [pH a 7,6]) complementado con antibióticos cuando sea necesario (aquí, 50 g/ml de kanamicina).
2. Incubar la cocultura durante 24 h a 30oC con agitación a 200 rpm.
3. Compruebe que las células de presa estén completamente alicentes mediante microscopía ....

Resultados

El sistema descrito basado en TLFM permite que las células individuales de B. bacteriovorus sean rastreadas a tiempo (Figura 3, Película 1) y proporciona información valiosa sobre cada etapa del complejo ciclo de vida depredador. La fusión PilZ-mCherry permite etiquetar toda la célula depredadora en la fase de ataque, así como en la fase temprana de la fase de crecimiento (Figura 3). La transición del ataque a la fase replicativa fue vi.......

Discusión

Debido al mayor interés en el uso de B. bacteriovorus como un antibiótico vivo, se necesitan nuevas herramientas para observar el ciclo de vida depredador, particularmente las interacciones depredador-patógeno, se necesitan. El protocolo presentado se utiliza para realizar un seguimiento de todo el ciclo de vida de B. bacteriovorus, especialmente durante su crecimiento dentro del huésped, en tiempo real. Además, la aplicación de una cepa que produce una abrazadera beta etiquetada fluorescentemente de la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Centrífuga	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	Rotor ref. 12183
CertificadoBiología Molecular Agarosa	BIO-RAD	161-3100	Agarosa de baja fluorescencia para almohadilla de agarosa
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Paquete de procesamiento de imágenes de código abierto
Plato con fondo de vidrio 35 mm	ibidi	81218-200	vidrio
sin recubrimientoMicroscopio	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, módulo láser de enfoque definitivo, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, montaje SSI FP DV, KIT OBJ. Oly 100x aceite 1.4 NA, prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
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