Método de alto rendimiento para medir el tiempo de sedación del alcohol de la Drosophila melanogaster individual

Resumen

Los métodos actuales para medir la sensibilidad al alcohol en Drosophila están diseñados para probar grupos de moscas. Presentamos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales. El método no requiere herramientas especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio utilizando materiales comunes.

Resumen

Drosophila melanogaster proporciona un excelente modelo para estudiar los fundamentos genéticos de la sensibilidad al alcohol. A diferencia de los estudios en poblaciones humanas, el modelo Drosophila permite un control estricto sobre los antecedentes genéticos, y un número prácticamente ilimitado de individuos del mismo genotipo se puede criar rápidamente bajo condiciones ambientales bien controladas sin restricciones reglamentarias y a un costo relativamente bajo. Las moscas expuestas al etanol sufren cambios fisiológicos y conductuales que se asemejan a la intoxicación por alcohol humano, incluyendo la pérdida del control postural, la sedación y el desarrollo de la tolerancia. Aquí, describimos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales. El ensayo se basa en la grabación de vídeo de moscas individuales introducidas sin anestesia en placas de cultivo celular de 24 pocillos en una configuración que permite el inicio sincrónico de la exposición al alcohol. El sistema permite a una sola persona recopilar datos individuales de sedación de etanol en hasta 2.000 moscas dentro de un período de trabajo de 8 horas. En principio, el ensayo puede ampliarse para evaluar los efectos de la exposición a cualquier sustancia volátil y aplicarse para medir los efectos de la toxicidad aguda de los volátiles en otros insectos, incluidas otras especies de moscas.

Introducción

El Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo informa que en 2015 el consumo excesivo de alcohol, designado como "trastorno por consumo de alcohol", afectó a unos 16 millones de personas en los Estados Unidos. El abuso de alcohol causa una amplia gama de efectos fisiológicos adversos y es una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos. En los seres humanos, disminución de la sensibilidad, o un bajo nivel de respuesta al alcohol, tiene un fuerte componente genético y se asocia con un mayor riesgo de desarrollar trastornos del consumo de alcohol^1,2,3,4. Los estudios de riesgo genético en poblaciones humanas son desafiantes debido a la mezcla de la población, diversos historiales de desarrollo y exposiciones ambientales, y la dependencia de cuestionarios autoinformados para cuantificar fenotipos relacionados con el alcohol, que a menudo se confunden con otras condiciones neuropsiquiátricas.

Drosophila melanogaster proporciona un excelente modelo para estudiar los fundamentos genéticos de la sensibilidad al alcohol^5,6,7,8. El modelo Drosophila permite un control estricto sobre los antecedentes genéticos, y un número prácticamente ilimitado de individuos del mismo genotipo se puede criar rápidamente bajo condiciones ambientales bien controladas sin restricciones regulatorias y a un costo relativamente bajo. Además de las mutaciones disponibles públicamente y las líneas de ARNi que se dirigen a la mayoría de los genes en el genoma, la disponibilidad del Panel de Referencia Genética drosophila melanogaster (DGRP), una población de 205 líneas endogámicas derivadas endogámicas con secuencias completas del genoma, ha permitido estudios de asociación en todo el genoma^9,,10. Dichos estudios han identificado redes genéticas asociadas con los efectos sobre el tiempo de desarrollo y la viabilidad en la exposición al desarrollo al etanol^11,12. La conservación evolutiva de los procesos biológicos fundamentales permite extraer inferencias traslacionales mediante la superposición de ortologs humanos en sus contrapartes de mosca.

Las moscas expuestas al etanol sufren cambios fisiológicos y conductuales que se asemejan a la intoxicación por alcohol humano, incluyendo la pérdida del control postural^8,la sedación y el desarrollo de la tolerancia^13,,14,,15. La sedación inducida por alcohol en Drosophila se puede cuantificar utilizando inebriómetros. Se trata de columnas de vidrio vertical de 122 cm de largo con tabiques de malla eslanados a los que las moscas pueden unir^16,,17,,18. Un grupo de al menos 50 moscas (los sexos se pueden analizar por separado) se introducen en la parte superior de la columna y se exponen a vapores de etanol. Las moscas que pierden el control postural caen a través de la columna y se recogen a intervalos de 1 minuto. El tiempo medio de elución sirve como una medida de sensibilidad a la intoxicación por alcohol. Cuando las moscas se exponen al alcohol por segunda vez después de recuperarse de la primera exposición, pueden desarrollar tolerancia, como se desprende de un cambio en el tiempo medio de elución^13,15,19,20. Mientras que los ensayos de embriabolímetros han llevado a la identificación de genes, redes genéticas y vías celulares asociadas con la sensibilidad a la sedación alcohólica y el desarrollo de tolerancia^{12,,13,,14,21}, el ensayo consume mucho tiempo, bajo rendimiento e ineficaz para medir la sensibilidad al alcohol en moscas individuales.

Los ensayos alternativos de sedación de etanol que no requieren la elaborada configuración del ebriómetro permiten mediciones más convenientes pero siguen siendo limitados en el rendimiento y generalmente requieren análisis de grupos de moscas en lugar de individuos^{21,,22,,23,,24,,25}. La evaluación de moscas individuales minimiza el potencial de efectos de confunción debido a interacciones grupales, como las derivadas de comportamientos sociales. Aquí, presentamos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales.

Protocolo

1. Construcción del aparato de ensayo

1. Cree una plantilla de cartón del tamaño de una placa de cultivo de celda de 24 pocillos trazando alrededor de la placa en cartón y cortando el área designada.
2. Corte un pedazo de malla de una pequeña malla de insectos del tamaño de la placa de cultivo celular usando la plantilla de cartón del paso 1.1.
3. Prepare una placa de cultivo celular de 24 pocillos colocando una pequeña línea de pegamento caliente alrededor del perímetro de la parte superior de la placa usando una pistola de pegamento caliente y colocando la malla de la pantalla en la parte superior de los pozos abiertos.
4. Asegure un palo artesanal de madera a cada uno de los tres lados de la misma placa de cultivo celular del paso 1.3 usando una pistola de pegamento caliente. La placa de cultivo de celda modificada ahora debe parecerse al diagrama de placas que se muestra en la Figura 1A y a la configuración experimental que se muestra en la Figura 2.
   NOTA: Prepare al menos tantas placas de cultivo celular como quepan en las cámaras de filmación (ver más abajo).

Figura 1: Diagrama del aparato de ensayo y cámara de filmación. (A) Diagramas superiores. Se muestran las vistas superior, lateral y frontal del aparato de prueba, respectivamente. Una malla de malla de pantalla se encuentra plana encima de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Los palos artesanales de madera, representados por las puntas de flecha, están unidos a tres lados adyacentes para la estabilidad y la ayuda de alineación, dos en el lado de la placa del pozo con seis pocillos y uno en el lado de la placa con cuatro pozos. Todos los accesorios están pegados en caliente en el aparato. (B) Diagramas inferiores. Se muestran las vistas superior, lateral y frontal de la configuración del ensayo, respectivamente. Se corta una hendidura en el lado derecho de la caja, desde la abertura de la tapa hasta la parte posterior de la abertura, con la parte inferior del nivel de hendidura hasta la superficie interior. El orificio en la parte superior de la caja, la superficie paralela al suelo, se centra para una exposición máxima de vídeo. El cuadro sombreado representa la cámara de vídeo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Fotografía del sistema de ensayo. La cámara de vídeo se coloca en la parte superior de la cámara de poliestireno, con la lente insertada en el orificio de corte, ilustrado en los diagramas de la Figura 1B. Dos conjuntos de placas de cultivo celular modificadas de 24 pocillos descansan sobre una almohadilla de iluminación que se inserta en una hendidura a través del lado de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Construcción de la cámara de filmación

1. Cree una cámara de filmación cortando un agujero del tamaño de la lente de la cámara de vídeo en el lado de una caja de poliestireno. Corte una ranura adicional de la anchura de la almohadilla de iluminación en el lado opuesto de la caja de poliestireno. La cámara de filmación debe parecerse a la cámara de filmación que se muestra en la Figura 1B y la Figura 2.
2. Prepare la cámara de filmación para su uso insertando la almohadilla de iluminación en la ranura y colocando la cámara en el orificio de la lente por encima de la almohadilla de iluminación.
3. Coloque todos los materiales y realice todas las pruebas posteriores en un entorno controlado, preferiblemente una cámara conductual con aproximadamente un 30% de humedad, una temperatura de 25 oC, un flujo de aire uniforme y niveles de ruido inferiores a 65 dB.

3. Preparación del aparato de ensayo y moscas

1. Pipetear 1 ml de etanol 100% a través de la malla de la pantalla en cada poca.
2. Seque la malla de la pantalla con un trozo de tela de queso.
3. Corte dos trozos de tela de queso las dimensiones de la placa de cultivo celular utilizando la plantilla de cartón creada en el paso 1.1. Colóquelos encima de la malla de la pantalla seca de la placa de cultivo celular modificada que contiene etanol del paso 3.2.
4. Cree una pequeña pieza de tabla de corte de plástico delgada y flexible trazando alrededor de la plantilla de cartón creada en el paso 1.1 como guía general y expandiendo el área trazada en 1-2 cm en uno de los lados cortos. Corte el área trazada expandida de la tabla de corte de plástico delgada y flexible. Después del corte, asegúrese de que el plástico todavía cabe entre los tres palos artesanales de madera en el aparato de prueba, pero cuelga de un extremo por 1-2 cm.
5. (Opcional) Si es necesario crear un aspirador, ensamble un aspirador como el que se muestra en la Figura 3 cortando primero una punta de pipeta P1000 por la mitad. Inserte la pieza con un diámetro más grande en un extremo de una pieza de tubo flexible de 30 cm para servir como boquilla.

Figura 3: Un aspirador de mosca en el que las moscas se recogen con una boquilla intercambiable unida a tubos flexibles y una pipeta serológicade diámetro ancho con un tapón de gasa de algodón. El operador puede aspirar una sola mosca en la pipeta para transferirla sin anestesia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. (Opcional) Para completar el conjunto del aspirador, cubra el extremo ancho de una pipeta serológica de 10 cm con gasa para evitar que las moscas entren en el tubo e inserte primero la pipeta, gasa en el extremo abierto del tubo para servir como cámara de mosca. El aspirador debe parecerse a lo que se muestra en la Figura 3.
7. Usando un aspirador(Figura 3, pasos 3.5 y 3.6), aspirar una mosca por pozo en una placa de cultivo celular separada de 24 pocillos. Utilice el plástico flexible para cubrir cualquier pocal que contenga moscas previamente aspiradas. Registre la posición del pozo y cualquier información relevante sobre el genotipo o fenotipo de cada mosca.
8. Sostenga el plástico flexible al ras con la parte superior de la placa de cultivo celular que contiene las moscas para evitar su escape e invierta la placa en la parte superior de la placa de cultivo celular modificada con el etanol. La hoja de plástico flexible debe estar apoyada encima de las hojas de tela de queso. Alinee la placa de cultivo celular invertida que contiene moscas usando los palos artesanales para asegurar que cada pozo con etanol se alinee con cada pozo que contenga una mosca.
9. La configuración experimental debe parecerse a la Figura 2.

4. Prueba de las moscas

1. Asegúrese de que la almohadilla de iluminación esté iluminada a pleno brillo para obtener el máximo contraste visual. Comience a grabar con la cámara de vídeo.
2. Para exponer las moscas al etanol, retire cuidadosamente el plástico de entre la placa del pozo y el aparato de prueba, teniendo cuidado de no desalojar la tela de queso.
3. Terminar la grabación de vídeo una vez que todas las moscas han perdido el control postural. Una vez que se sospeche que todas las moscas han perdido el control postural, toque firmemente en el centro de la placa para asegurarse de que todas las moscas tienen pérdida completa del control postural. Si hay movimiento, continúe grabando. Continúe tocando periódicamente (cada 1-2 min) hasta que no se produzca ningún movimiento.
4. (Opcional) Para recuperar rápidamente las moscas, retire sólo el plato superior del aparato de prueba, revelando moscas sedadas apoyadas sobre la tela de queso. Aspirar moscas individuales en los contenedores elegidos para su recuperación.
5. Sustituya el etanol en las placas de cultivo celular modificadas por 1 ml de etanol fresco 100% al menos 1 veces cada hora para controlar la evaporación y humidificación del etanol y para mantener una exposición constante al etanol durante todo el ensayo. Seque la malla de la pantalla con tela de queso.
6. Repita el proceso para tantas muestras como desee.
   NOTA: Para obtener un rendimiento más alto, aspirar la siguiente ronda de moscas en nuevas placas de cultivo celular durante la grabación de vídeo. El protocolo se puede pausar aquí, ya que la grabación de vídeo se puede revisar más adelante.

5. Determinación del tiempo de sedación de la mosca

1. Grabe el tiempo de sedación para cada mosca individual viendo la grabación de vídeo. El tiempo de sedación se define como el momento en que una mosca pierde el control postural completo y la capacidad locomotora. Se recomienda ver la película en reversa y grabar el tiempo que la mosca comienza a moverse para garantizar la precisión.

Resultados

Dos placas de microtíter de 24 pocillos podrían generar datos simultáneamente en 48 moscas individuales en tan solo 10 min. La Tabla 1 enumera las mediciones de los tiempos de sedación de etanol para 48 moscas individuales, machos y hembras por separado, de dos líneas de DGRP con diferentes sensibilidades a la exposición al alcohol en el tiempo de desarrollo y viabilidad¹³. Las moscas de la línea RAL_555 eran menos sensibles que las RAL_177 de línea(Figura 4, Tabla 2; p < 0.0001, ANOVA). Los machos y las hembras de RAL_177 no mostraron ningún efecto sexualmente dimórfico(Figura 4, Tabla 2; p > 0,1, ANOVA), mientras que las hembras de línea RAL_555 eran menos sensibles a la exposición al etanol que los machos(Figura 4, Tabla 2; p < 0.006, ANOVA). El gran número de moscas que se pueden medir simultáneamente y la capacidad de medir sexos y diferentes líneas simultáneamente puede aumentar la precisión al reducir el error debido a la variación ambiental.

Un.	Tiempo de sedación de etanol (s)						B.	Tiempo de sedación de etanol (s)
	Hembras			Machos				Hembras			Machos
	414	365	477	423	568	309		937	742	622	460	331	498
	201	384	498	411	523	626		791	619	197	467	455	562
	228	364	333	440	403	267		504	744	513	570	582	506
	440	416	404	408	422	384		970	540	369	865	533	492
	888	283	285	322	369	287		595	550	606	392	544	345
	1079	519	315	393	376	284		418	709	553	308	477	388
	718	287	432	275	206	411		366	564	558	385	576	377
	598	337	398	279	631	372		437	692	578	460	511	412
	241	398	364	347	374	808		665	729	484	532	425	354
	229	423	534	386	396	628		312	576	305	334	531	506
	388	488	451	523	322	533		682	638	420	560	548	379
	252	529	375	427	330	540		1045	741	708	832	509	472
	674	401	303	401	307	311		394	675	381	477	449	784
	303	453	351	429	525	262		540	690	520	556	495	226
	258	483	302	389	562	319		356	615	336	454	524	590
	346	426	385	416	596	287		626	678	840	634	677	509

Cuadro 1: Mediciones de los tiempos de sedación de etanol (s) de moscas individuales de (A) líneas DGRP RAL_177 y (B) RAL_555 para sexos separados (n . 48). Véase también el Cuadro 2, Figura 4.

Figura 4: Los tiempos de sedación del alcohol de las líneas de DGRP RAL_177 y RAL_555. Las barras representan las medias y las barras de error SEM (n a 48). Los tiempos de sedación para RAL_177 las moscas fueron menores que los de las moscas RAL_55 (p < 0.0001, ANOVA). Los puntos de datos individuales se indican en el Cuadro 1. En el texto y en el cuadro 2se indican diferencias estadísticamente significativas adicionales entre sexos y líneas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis	Fuente de la variación	Df	Ss	Valor F	Valor P
Modelo completo agrupado	Línea	1	769627	34.869	<0.0001
	Sexo	1	105001	4.757	0.0304
	Línea x Sexo	1	86021	3.897	0.0498
	Error	188	4149491
Reducción de las hembras modelo	Línea	1	685126	23.58	<0.0001
	Error	94	2730718
Hombres modelo reducidos	Línea	1	170522	11.3	0.0011
	Error	94	1418774
RAL_177 del modelo reducido	Sexo	1	473	0.023	0.8800
	Error	94	1943741
Modelo reducido RAL_555	Sexo	1	190549	8.12	0.0054
	Error	94	2205751

Tabla 2: Análisis de la varianza del tiempo desedación a través del sexo y la línea DGRP. El modelo utilizado fue Y á + L + S + LxS + , donde es la media general, L es el efecto fijo de la línea DGRP (RAL_177, RAL_555), S es el efecto fijo del sexo (masculino, femenino), LxS es el término de interacción (fijo), y es el término de error. Para los modelos reducidos se utilizaron los modelos Y , + L + L y Y + S + S . Línea, Sexo y el término de interacción Línea x Sexo fueron todos significativos en el modelo completo en el número < 0.05. Los modelos reducidos por sexo y la línea RAL_555 de DGRP también fueron significativos en el valor de < 0,01. Véase también el Cuadro 1, Figura 4. df - grados de libertad, SS - Sumas de cuadrados tipo I.

Discusión

Aquí, presentamos un método simple, económico y de alto rendimiento para evaluar el tiempo de sedación debido a la exposición al etanol en Drosophila melanogaster. A diferencia de muchos métodos actuales, que requieren análisis de grupo, este ensayo permite a una sola persona recopilar datos de tiempo de sedación individual para 2.000 moscas dentro de un período de trabajo de 8 horas. Encontramos que una sola persona puede anotar 48 moscas para el tiempo de sedación en aproximadamente 5 min. A este ritmo, 2.000 moscas se pueden puntuar en aproximadamente 4 h, aunque la puntuación se puede llevar a cabo más adelante. Con nuestro ensayo, el tiempo de sedación registrado para la mayoría de las moscas oscila entre 5-15 minutos a una exposición a 1 ml de etanol 100%. Las concentraciones más bajas de etanol o los volúmenes de entrega más pequeños darán lugar a tiempos de sedación más largos.

Los métodos actuales para evaluar el tiempo de sedación requieren probar un gran número de moscas sin permitir fácilmente mediciones en individuos individuales^{15,,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Muchos ensayos actuales de sedación y sensibilidad dependen de ST50^22,,23,24, el punto de tiempo en el que el 50% de las moscas se sedan como resultado de la exposición al etanol. Aunque la obtención del ST50 para grupos de moscas no fue la principal motivación para desarrollar este ensayo, las grabaciones de vídeo demuestran una mayor utilidad en comparación con los métodos actuales, ya que las grabaciones se pueden utilizar para determinar el ST50 para grupos de moscas probadas individualmente y para medir el porcentaje de moscas que satisfacen un criterio determinado (por ejemplo, pérdida de control postural) en cualquier momento. Cabe señalar que tales análisis de vídeo requerirían tiempo adicional.

A diferencia de los ensayos de inebriómetro actuales, el método que describimos no requiere herramientas especializadas para configurar y se puede realizar en cualquier laboratorio utilizando materiales comunes. Usando este método, hemos obtenido tiempos de sedación confiables y consistentes para moscas individuales. En principio, el ensayo puede ampliarse para evaluar los efectos de la exposición a cualquier sustancia volátil. El ensayo también se puede aplicar para medir los efectos de la toxicidad aguda de los volátiles en otros insectos, incluidas otras especies de moscas. Los datos de tiempo de sedación individual es para evaluar el grado de variación fenotípica dentro de una población, como la DGRP.

Utilizamos pequeñas mallas de pantalla de insectos para evitar el contacto directo con la solución de etanol, al tiempo que permitimos que cantidades adecuadas de vapores de etanol lleguen a la mosca. La capa de tela de queso blanco en la parte superior de la malla de la pantalla proporciona contraste visual entre la mosca y la superficie de abajo y asegura que las moscas no queden atrapadas en la malla de la pantalla, lo que podría conducir a una determinación ambigua de la pérdida del control postural. Las membranas disponibles comercialmente que son porosas para el agua y el aire dieron resultados inconsistentes y eran insuficientemente penetrables a los vapores de etanol. Usamos intencionalmente una pequeña malla de pantalla de insectos porque es un material uniformemente poroso que minimiza la variación en la exposición al etanol como resultado de la posición de la mosca dentro de un pozo. Se pueden hacer modificaciones en este protocolo sobre la base de los materiales disponibles, aunque recomendamos una cámara de comportamiento controlada, acceso a etanol del 90% al 100% cerca de la mosca y una exposición uniforme al etanol.

La posición de la mosca dentro de las placas de cultivo celular debe ser aleatoria entre réplicas para evitar el sesgo posicional. Para experimentos más grandes que requieren el uso de este ensayo a lo largo de varios días y por lo tanto están sujetos a variaciones ambientales que podrían influir en los resultados del ensayo (por ejemplo, cambios en la presión barométrica)^27,recomendamos encarecidamente que las moscas se prueben a la misma hora cada día y se aletimen tanto dentro como a lo largo de los días, especialmente si se deben comparar diferentes líneas y/o sexos entre sí.

El método que desarrollamos es el más adecuado para medir el efecto de la exposición aguda al alcohol, pero no es adecuado para obtener datos de consumo o modelar la adicción. Sin embargo, los datos de sensibilidad a la sedación alcohólica obtenidos de este ensayo pueden integrarse con otras medidas de fenotipos relacionados con el alcohol. Una limitación del sistema es que la altura vertical de las placas de cultivo celular estándar permite el movimiento de la mosca vertical que no se puede rastrear fácilmente por vídeo para una evaluación detallada de la actividad general o la locomoción. Sin embargo, esta limitación no afecta a la evaluación precisa del tiempo de sedación. Cuando se utilizan moscas de diferentes genotipos (por ejemplo, en poblaciones de razas derivadas de LA DGRP²⁸), este ensayo también permite la recuperación de moscas individuales para recoger piscinas de moscas con fenotipos en contraste para la secuenciación de ADN a granel y mapeo QTL extremo^29,,30. En general, este ensayo permite una recopilación rápida y barata de datos de sedación alcohólica en un gran número de moscas individuales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo celular de 24 pocillos	Corning	3526	de fondo plano; albergará moscas durante todo el ensayo
Aspirador
Gasa	Genesee Scientific	53-100	Ampliamente disponible.
Etanol	Decon Labs	V1001	Ampliamente disponible.
Tabla de cortar de plástico flexible (cubierta de plato)	Walmart	550098612	Cualquier plástico plano que pueda deslizarse fácilmente y cubrir completamente una placa de 24 pocillos. La tabla de cortar de plástico flexible funciona bien.
Gasa (para aspirador)	Honeywell North	67622	Ampliamente disponible.
Almohadilla de iluminación	Amazon (AGPtek)	ASIN B00YA9GP0G	Cualquier almohadilla de luz para proporcionar contraste es adecuada.
Palitos de manualidades gigantes	Michaels 10334892		Cualquier palo de manualidades de al menos 7 cm de largo es adecuado.
Punta de pipeta P1000 (para aspirador)	Genesee Scientific	24-165RL	Cualquier punta de pipeta P1000 es adecuada.
Pipeta serológica (para aspirador)	Genesee Scientific	12-104
Malla mosquitera pequeña	Lowe's (Saint-Gobain ADFORS)	89322	Cualquier malla mosquitera pequeña es adecuada.
Cámara de pruebas Dimensión			espacio interior lo suficientemente grande como para abarcar una almohadilla de luz. Se puede construir a partir de una caja de poliestireno.
Tubo Tygon (para aspirador)	Grainger	9CUG7	Ampliamente disponible.
Cámara de video	Canon	1959C001AA	Cualquier cámara de video es adecuada.