Los astrocitos azulejos de la corteza cerebral uniformemente, haciendo que el análisis de su morfología compleja desafiante a nivel celular. El protocolo proporcionado aquí utiliza etiquetado multicolor basado en electroporación de útero para señalar astrocitos corticales y analizar su volumen y morfología con una canalización de análisis de imágenes fácil de usar.
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Artículo de método
En Utero Electroporación de marcadores de color multiaconsejables integradores del genoma (MAGIC) para individualizar los astrocitos corticales del ratón
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Resumen
Resumen
Los astrocitos protoplasmáticos (PrA) ubicados en la corteza cerebral del ratón están estrechamente yuxtapuestos, formando una matriz tridimensional aparentemente continua en etapas adultas. Hasta ahora, ninguna estrategia de inmunodetención puede señalarlos y segmentar su morfología en animales maduros y en el transcurso de la corticogénesis. Cortical PrA se origina a partir de progenitores ubicados en el palio dorsal y se puede dirigir fácilmente utilizando en electroporación de úteros de vectores integrativos. Aquí se presenta un protocolo para etiquetar estas células con la estrategia de marcadores de color que integra el genoma (MAGIC), que se basa en la transposición piggyBac/Tol2 y la recombinacióncre/lox para expresar estocásticamente proteínas fluorescentes distintas (azul, cian, amarillo y rojo) dirigidas a compartimentos subcelulares específicos. Esta estrategia de mapeo del destino multicolor permite marcar in situ progenitores corticales cercanos con combinaciones de marcadores de color antes del inicio de la gliogénesis y rastrear a sus descendientes, incluidos los astrocitos, desde etapas embrionarias hasta adultas a nivel celular individual. El etiquetado semitransparente logrado ajustando la concentración de vectores electroporados y contrastes de color proporcionados por los marcadores de color multiajustables que integran el genoma (MAGIC Markers o MM) permiten individualizar astrocitos y destacar su territorio y su compleja morfología a pesar de su densa disposición anatómica. Aquí se presenta un flujo de trabajo experimental completo que incluye los detalles del procedimiento de electroporación, la adquisición de pilas de imágenes multicanal mediante microscopía confocal y la segmentación tridimensional asistida por computadora que permitirá al experimentador evaluar el volumen y la morfología individuales de PrA. En resumen, la electroporación de magic markers proporciona un método conveniente para etiquetar individualmente numerosos astrocitos y obtener acceso a sus características anatómicas en diferentes etapas de desarrollo. Esta técnica será útil para analizar las propiedades morfológicas de los astrocitos corticales en varios modelos de ratón sin recurrir a cruces complejos con líneas de reportero transgénicos.
Introducción
Los astrocitos desempeñan numerosas funciones vitales en el desarrollo cerebral y la fisiología1. Además de su papel en la barrera hematoencefálica donde regulan la absorción de nutrientes y el flujo sanguíneo, contribuyen activamente a la formación y función de la sinapsis mientras producen neuromoduladores que pueden alterar la actividad neuronal y el comportamiento2. Además, la disfunción de los astrocitos contribuye a una variedad de trastornos neurológicos3. Los astrocitos ubicados en la corteza cerebral muestran una morfología elaborada que permite un contacto extensivo con procesos neuronal....
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Protocolo
Todos los procedimientos de animales descritos aquí se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales. Los protocolos de animales han sido aprobados por la junta ética de experimentación animal Charles Darwin (CEEACD/N°5).
1. Preparación de plásmidos libres de endotoxinas para marcadores MAGIC en electroporación de útero
- Transformación bacteriana
- Sobre hielo, descongele las células alfa competentes DH5 almacenadas a -70 °C.
- Calentar las placas de agar que contengan el antibiótico adecuado (ampicilina de 100 μg/ml o 50 μg/mL kanamycina) a 37 °C.
- Añadir 1 μL de 5-50 ng de ADN plásmid....
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Resultados
La electroporación de marcadores MAGIC en progenitores corticales embrionarios permite el etiquetado de astrocitos desde etapas tempranas hasta tardías de desarrollo de corteza cerebral (Figura 1). Estos astrocitos se encontraron en todas las capas corticales en varias etapas postnatales (P4, P7, P21) mientras se dispersaban ampliamente en toda la corteza cerebral. Fueron evaluados con imágenes confocales en mosaico adquiridas con un objetivo de 20x 0.8 NA (o NA superior) y ensamblados como .......
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Discusión
En la electroporación utero (IUE) de MAGIC Markers en progenitores corticales(Figura 1)permitió el etiquetado de astrocitos a lo largo de la corteza cerebral posnatal en diferentes etapas posnatales (P4-P7-P21, Figura 2). Curiosamente, la etapa de la IUE no es crítica, ya que la electroporación realizada de E13.5 a E15.5 produce patrones de etiquetado similares relativos a los astrocitos corticales14. Sin embargo, la ubicación de las neur.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a S. Fouquet y a las instalaciones de imágenes y núcleos animales del Institut de la Vision y el Institut des Neurosciences de Montpellier (RMN y RAM) por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por becas de Région Ile-de-France y La Fundación ARC pour la Recherche sur le Cancer a S.C, y de la Université Paris-Saclay (Iniciativas Doctorales Interdisciplinaires) a Los Ángeles, financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC-SG 336331, PI J. Valette) a E.H., por Agence Nationale de la Recherche bajo los contratos ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , por Fundación pour ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1.1 Transformación de bacterias | |||
| Euromedex | EU0400-C | ||
| Células alfa competentes DH5 | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Caja de hielo | Dutscher 139959 | ||
| Kanamicina | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| Medio: SOC | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Placa de Petri estéril - 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Baño de agua | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Cultivo de plásmidos | |||
| 14 ml tubo de cultivo | Dutscher 187262 | ||
| Vidrio erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Preparación de ADN plasmídico | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparación de las soluciones | |||
| 26 G x 1/2 aguja | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 aguja | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Jeringa de polipropileno de un solo uso, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparación del material quirúrgico | |||
| Pinzas Adson - Patrón DeBakey- 12,5 cm | FST | 11617-12 | |
| Pinzas de punta arqueada - 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Esterilizador de perlas de vidrio Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Micropipeta de vidrio 1 mm diámetro | FHC | 10-10-L | |
| Pinzas Graefe - Titanio 1 mm Puntas Ligera Curva- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Pinzas Graefe - Titanio 1 mm Puntas Rectas- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Tijeras Iris - Delicadas Rectas- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Cinta de laboratorio | Microinyector Fisher Scientitic | 11730454 | |
| INJECT+MATIC | Sin número | ||
| de catálogo Portaagujas Olsen-Hegar - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Fibra óptica | VWR | 631-1806 | |
| Papel blanco plastificado | Gel | Signagel 700103 | |
| Free-Med | 15-60 | de | |
| Petri estéril - 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Esterilizador, perla seca de vidrio, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparación de la hembra embarazada almohadilla | |||
| Alcomed | 1731000 | ||
| Buprecare | Axience | 0,3 mg/ml | |
| Compresa | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamina | Merial | Imalgene 1000 | |
| Gel ocular | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS ratones | Janvier Labs | ||
| Vetadine, solución al 10% | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Almohadilla térmica | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xilacina | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporación | |||
| Sutura absorbible Tamaño 4-0 45 cm Sutura 1 aguja 19 mm Longitud 3/8 círculo inverso | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Pipetas de transferencia estériles (envueltas individualmente) | Dutscher | 043202S | |
| Pinzas con electrodos de disco de platino de 3 mm | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Extracción y corte de tejidos | |||
| placa de 24 pocillos | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Cubreobjetos | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), sin calcio, sin magnesio | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Esmalte | de uñas EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Imagen confocal multicanal | |||
| 20X óleo NA 0.85 | Microscopio | ||
| Carl Zeiss | LSM880 | ||
| Microscopio de barrido láser confocal | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Segmentación del volumen territorial de astrocitos | |||
| IMARIS 8.3 y versiones posteriores | Bitplane | ||
| 7. Paquete de software de análisis asistido por visualización > | |||
| 3D (Vaa3D) |
Referencias
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit acti....
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Reimpresiones y permisos
