Reconstrucción de firmas de fluorescencia innata unicelular mediante microscopía confocal

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para extraer y catalogar ópticamente firmas de fluorescencia celular innata (es decir, autofluorescencia celular) de cada célula viva individual distribuida en un espacio tridimensional. Este método es adecuado para estudiar la firma de fluorescencia innata de diversos sistemas biológicos a una resolución de una sola célula, incluidas las células de bacterias, hongos, levaduras, plantas y animales.

Resumen

Aquí se describe el análisis de fluorescencia innata de una sola célula (CRIF) asistido por microscopía confocal, un método mínimamente invasivo para reconstruir la firma de fluorescencia celular innata de cada célula viva individual en una población distribuida en un espacio tridimensional (3D). La firma de fluorescencia innata de una célula es una colección de señales de fluorescencia emitidas por varias biomoléculas dentro de la célula. Estudios previos establecieron que las firmas de fluorescencia innata reflejan diversas propiedades celulares y diferencias en el estado fisiológico y son una rica fuente de información para la caracterización e identificación celular. Las firmas de fluorescencia innata se han analizado tradicionalmente a nivel poblacional, lo que requiere un cultivo clonal, pero no a nivel unicelular. CRIF es particularmente adecuado para estudios que requieren resolución 3D y / o extracción selectiva de señales de fluorescencia de células individuales. Debido a que la firma de fluorescencia es una propiedad innata de una célula, CRIF también es adecuado para la predicción sin etiquetas del tipo y / o estado fisiológico de células intactas y individuales. Este método puede ser una herramienta poderosa para el análisis celular simplificado, donde el fenotipo de cada célula individual en una población heterogénea puede evaluarse directamente por su firma de autofluorescencia bajo un microscopio sin etiquetado celular.

Introducción

Diversas biomoléculas dentro de una ^célula1 emiten señales de autofluorescencia, y la firma de fluorescencia innata de una célula consiste en el ensamblaje de estas señales. Esta fluorescencia característica refleja varias propiedades celulares y también diferencias en el estado fisiológico. El análisis de la fluorescencia innata es mínimamente invasivo y puede complementar las sondas microbiológicas tradicionales y más invasivas que dejan una gama de rastros desde una modificación metabólica leve hasta la destrucción celular completa. Si bien las técnicas tradicionales como la extracción de ADN o contenido ^celular2,3

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Coloque una junta de silicona de 1 mm de espesor con pocillos en un portaobjetos de vidrio.
2. Coloque una losa de agarosa de 1 mm de espesor al 0,8% (p/v) en el pozo de la junta de silicona.
3. Diluir la densidad celular de un cultivo celular microbiano arbitrario a una densidad óptica a 600 nm (_OD660) = 1.0.
4. Coloque una alícuota de 5 μL de suspensión celular en la losa de agarosa.
5. Cubra suavemente con una funda de vidrio.

2. Configuración de un microscopio

NOTA: La técnica CRIF combina microscopía de reflexión confocal (CRM)....

Resultados

La Figura 1A muestra la firma típica de fluorescencia de una sola célula de una célula bacteriana presentada como una gráfica de espectro tradicional (arriba) y como un mapa de calor (medio). La Figura 1B muestra el resultado de una segmentación celular 2D precisa superpuesta sobre la imagen CRM original de una población de bacterias del suelo (Pseudomonas putida KT2440)¹². Las firmas de fluorescencia innata resultantes para la p.......

Discusión

Hay dos puntos críticos en este método que deben seguirse de cerca para obtener resultados reproducibles: 1) mantener la salida de potencia del láser bajo el objetivo del microscopio consistente a través de longitudes de onda de excitación y experimentos, y 2) realizar una segmentación celular precisa.

El primer punto es particularmente importante cuando se compara la firma de fluorescencia innata entre diferentes experimentos. Evite simplemente aplicar la misma configuración de "porcentaje de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa	Wako Chemicals	312-01193
Divisores de haz	Carl Zeiss, Nikon		MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 o MBS 488/543/633 divisores de haz (Carl Zeiss)
Microscopio confocal	Carl Zeiss, Nikon		Modelo LSM 880 (Carl Zeiss), Modelo A1R (Nikon)
Cubrecubiertas	Matsunami Glass C024601
Correderas de vidrio	Matsunami Glass	S011120
Espejo de semirreflexión	Carl Zeiss, Nikon		NT80/20
Medidor de potencia láser	Thorlabs	PM400 (consola de medidor de potencia) y S175C (sensor)
			MATLAB versión 2019a o posterior, se necesita Image Processing Toolbox
Objetivo de microscopio	Carl Zeiss, Nikon	440762-9904	p. ej. plan 63x Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Software de microscopio	Carl Zeiss, Nikon		ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)	Wako Chemicals	166-23555
Lenguaje			de programaciónPython y las bibliotecas, los módulos (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) son necesarios para ejecutar el script PCA proporcionado.
Junta de silicona	ThermoFisher Scientific	P24744
Workstation			Se recomienda una estación de trabajo de alto rendimiento con GPU discretas.
Extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) medio de agar	Sigma-Aldrich	Y1500-250G	Para el cultivo de levadura
medio YPD	Sigma-Aldrich	Y1375-250G

LB Caldo Nacalai tesque 20066-95 Para el cultivo de bacterias Software de análisis de imágenes The MathWorks