Evaluación del estrés oxidativo en muestras biológicas utilizando el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

Resumen

El objetivo del ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico es evaluar el estrés oxidativo en muestras biológicas midiendo la producción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído, utilizando espectrofotometría de longitud de onda visible a 532 nm. El método descrito aquí se puede aplicar al suero humano, lisados celulares y lipoproteínas de baja densidad.

Resumen

A pesar de su limitada especificidad analítica y robustez, el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) se ha utilizado ampliamente como una métrica genérica de la peroxidación lipídica en fluidos biológicos. A menudo se considera un buen indicador de los niveles de estrés oxidativo dentro de una muestra biológica, siempre que la muestra se haya manipulado y almacenado adecuadamente. El ensayo implica la reacción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído (MDA), con ácido tiobarbitúrico (TBA), lo que conduce a la formación de aductos MDA-TBA2 llamados TBARS. TBARS produce un color rojo-rosa que se puede medir espectrofotométricamente a 532 nm. El ensayo TBARS se realiza en condiciones ácidas (pH = 4) y a 95 °C. La MDA pura es inestable, pero estas condiciones permiten la liberación de MDA de MDA bis (dimetil acetal), que se utiliza como estándar analítico en este método. El ensayo TBARS es un método sencillo que se puede completar en aproximadamente 2 h. La preparación de los reactivos de ensayo se describe en detalle aquí. Los investigadores conscientes del presupuesto pueden usar estos reactivos para múltiples experimentos a un bajo costo en lugar de comprar un costoso kit de ensayo TBARS que solo permite la construcción de una sola curva estándar (y por lo tanto solo se puede usar para un experimento). La aplicabilidad de este ensayo TBARS se muestra en suero humano, lipoproteínas de baja densidad y lisados celulares. El ensayo es consistente y reproducible, y se pueden alcanzar límites de detección de 1,1 μM. Se proporcionan recomendaciones para el uso e interpretación del ensayo espectrofotométrico TBARS.

Introducción

La peroxidación lipídica es un proceso en el que los radicales libres, como las especies reactivas de oxígeno y las especies reactivas de nitrógeno, atacan los dobles enlaces carbono-carbono en los lípidos, un proceso que implica la extracción de un hidrógeno de un carbono y la inserción de una molécula de oxígeno. Este proceso conduce a una mezcla de productos complejos que incluyen, radicales peroxilo lipídicos e hidroperóxidos como productos primarios, así como malondialdehído (MDA) y 4-hidroxinonenal como productos secundarios ^{predominantes1}.

MDA ha sido ampliamente utilizado en la investigación biomédica como un....

Protocolo

Los especímenes de suero humano se obtuvieron de voluntarios que consintieron bajo la aprobación del IRB y de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Las muestras fueron codificadas y desidentificadas antes de su transferencia al laboratorio analítico.

1. Preparación de la muestra

1. Lisados de células HepG2
   1. Sembrar alrededor de 10 x ¹⁰⁶ células HepG2 por matraz en 16 matraces T75 con 14 ml de medios EMEM suplementados con suero bovino fetal al 10% (FBS) y células de crecimiento durante 2 días.
   2. Prepare el tampón RIPA: en un tubo de 50 ml, agregue 1.5 ml de ....

Resultados

En condiciones ácidas (pH = 4) y a 95 °C, el malondialdehído (MDA) bis(dimetil acetal) produce ^MDA23. MDA y congéneres químicos estrechamente relacionados reaccionan con dos moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para producir compuestos llamados sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dan un color rojo-rosa y tienen una absorbancia _λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando MDA bis (dimetil acetal) como .......

Discusión

A pesar de sus limitaciones1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 y la falta de idoneidad para la comparación entre laboratorios, el ensayo TBARS es uno de los más

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x PBS estéril pH 7.4 1 L	VWR, PA	--262	reactivo de lisis celular
50 mL tubo de centrífuga autónomo	Corning, NY	CLS430897	Material general
Placa de 96 pocillos, sin tratar, transparente, con tapa, no estéril	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Para medir la absorbancia
Amicon Ultra-0.5 100 kD Dispositivo de filtro centrífugo de rotación Fisher	Scientific, NH	UFC510024	Purificación de LDL
Tapones para tubos de vidrio	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	para ensayo TBARS
Cloruro de cobre II	SIGMA, MO	222011-250G	para inducir oxidación
Tubos de cultivo, desechables, con acabado de tapón de rosca, vidrio de borosilicato (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	para ensayo TBARS
Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065 Medios de	célula HepG2
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL	Eppendorf, NY		22363204 Material general
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	Material general
Suero fetal bovino Fuente US Omega	Scientific, CA	FB-11	para cultivo celular
Ácido Acético Glacial	SIGMA, MO	27225-1L-R	Reactivo TBARS
Cóctel de inhibidor de la proteasa Halt (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	reactivo de lisis celular
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	Solvente LDL
Células HepG2	ATCC, VA	HB-8065 Prototipo de	matriz biológica
Ácido clorhídrico (HCl)	Fisher Scientific, NH	Reactivo
de lisis celular A144-212Legend Micro 17 Centrífuga	Thermo Scientific, MA	75002431	Material general
Lipoproteína de baja densidad, plasma humano	Athens Research & Tecnología, GA	12-16-120412	Prototipo de matriz biológica
Barras de agitación magnéticas, Octágono 6-Surtido	VWR, PA	58948-025	Material general
Malondialdehído bis (dimetilacetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS
Espectrofotómetro de microplaca Multiskan Go estándar	Fisher Scientific, NH	51119200	Para medir la absorbancia
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	reactivo de lisis celular
Cloruro de sodio	SIGMA, MO	S7653-1KG	reactivo de lisis celular
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reactivo
Hidróxido de sodio	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reactivo
SpeedVac Concentrador	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	para matraz de lisados de células concentradas
T-75, tratamiento con cultivo de tejidos, 250 mL, con tapa de filtro	USA Scientific, FL	658175	cultivo celular
Ácido tiobarbitúrico	SIGMA, MO	T5500-100G	Reactivo TBARS TRIS
base Fluka	, GA	93362	reactivo de lisis celular
Tripsina (1x)	VWR, PA	16777-166	Para separar células HepG2