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Artículo de método

Evaluación del estrés oxidativo en muestras biológicas utilizando el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

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DOI:

10.3791/61122

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12 de mayo de 2020

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

En este artículo

Resumen

El objetivo del ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico es evaluar el estrés oxidativo en muestras biológicas midiendo la producción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído, utilizando espectrofotometría de longitud de onda visible a 532 nm. El método descrito aquí se puede aplicar al suero humano, lisados celulares y lipoproteínas de baja densidad.

Resumen

A pesar de su limitada especificidad analítica y robustez, el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) se ha utilizado ampliamente como una métrica genérica de la peroxidación lipídica en fluidos biológicos. A menudo se considera un buen indicador de los niveles de estrés oxidativo dentro de una muestra biológica, siempre que la muestra se haya manipulado y almacenado adecuadamente. El ensayo implica la reacción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído (MDA), con ácido tiobarbitúrico (TBA), lo que conduce a la formación de aductos MDA-TBA2 llamados TBARS. TBARS produce un color rojo-rosa que se puede medir espectrofotométricamente a 532 nm. El ensayo TBARS se realiza en condiciones ácidas (pH = 4) y a 95 °C. La MDA pura es inestable, pero estas condiciones permiten la liberación de MDA de MDA bis (dimetil acetal), que se utiliza como estándar analítico en este método. El ensayo TBARS es un método sencillo que se puede completar en aproximadamente 2 h. La preparación de los reactivos de ensayo se describe en detalle aquí. Los investigadores conscientes del presupuesto pueden usar estos reactivos para múltiples experimentos a un bajo costo en lugar de comprar un costoso kit de ensayo TBARS que solo permite la construcción de una sola curva estándar (y por lo tanto solo se puede usar para un experimento). La aplicabilidad de este ensayo TBARS se muestra en suero humano, lipoproteínas de baja densidad y lisados celulares. El ensayo es consistente y reproducible, y se pueden alcanzar límites de detección de 1,1 μM. Se proporcionan recomendaciones para el uso e interpretación del ensayo espectrofotométrico TBARS.

Introducción

La peroxidación lipídica es un proceso en el que los radicales libres, como las especies reactivas de oxígeno y las especies reactivas de nitrógeno, atacan los dobles enlaces carbono-carbono en los lípidos, un proceso que implica la extracción de un hidrógeno de un carbono y la inserción de una molécula de oxígeno. Este proceso conduce a una mezcla de productos complejos que incluyen, radicales peroxilo lipídicos e hidroperóxidos como productos primarios, así como malondialdehído (MDA) y 4-hidroxinonenal como productos secundarios predominantes1.

MDA ha sido ampliamente utilizado en la investigación biomédica como un marcador de peroxidación lipídica debido a su reacción fácil con el ácido tiobarbitúrico (TBA). La reacción conduce a la formación de MDA-TBA2, un conjugado que se absorbe en el espectro visible a 532 nm y produce un color rojo-rosa2. Otras moléculas derivadas de la peroxidación lipídica además de MDA también pueden reaccionar con TBA y absorber luz a 532 nm, contribuyendo a la señal de absorción general que se mide. Del mismo modo, MDA puede reaccionar con la mayoría de las otras clases principales de biomoléculas, lo que potencialmente limita su accesibilidad para la reacción con TBA3,4. Como tal, este ensayo tradicional se considera simplemente para medir "sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico" o TBARS5.

Cuando se aplica e interpreta correctamente, el ensayo TBARS generalmente se considera un buen indicador de los niveles generales de estrés oxidativo en una muestra biológica6. Desafortunadamente, como lo documentan Khoubnasabjafari y otros, el ensayo TBARS a menudo se realiza e interpreta de manera que facilita conclusiones dudosas3,4,7,8,9,10,11. Las causas de esto se basan principalmente en variables preanalíticas relacionadas con la muestra y en la falta de robustez del ensayo que prohíbe variaciones aparentemente menores en el protocolo del ensayo sin cambios sustanciales en los resultados del ensayo1,7,12,13.

Las variables preanalíticas relacionadas con el manejo y almacenamiento de bioespecímenes (p. ej., plasma sanguíneo mantenido temporalmente a -20 °C)14,15 pueden tener un impacto importante en los resultados de los ensayos TBARS16,17; tanto es así, que los resultados de los ensayos TBARS no deben compararse entre diferentes laboratorios a menos que estén justificados por datos explícitos de validación analítica entre laboratorios. Esta recomendación es similar a cómo se usan e interpretan comúnmente los western blots. Las comparaciones de densidades de banda son válidas para estudios dentro de la mancha y tal vez dentro del laboratorio, pero la comparación de densidades de banda entre laboratorios generalmente se considera una práctica inválida.

Algunos investigadores han sugerido que la MDA medida por el ensayo TBARS simplemente no cumple con los criterios analíticos o clínicos requeridos de un biomarcador aceptable3,9,10,18,19. De hecho, si el ensayo no se hubiera desarrollado hace más de 50 años, probablemente no habría ganado el uso generalizado y la aceptabilidad tácita que tiene hoy en día. Aunque existen otros ensayos con mayor sensibilidad analítica, especificidad y robustez utilizados para determinar el estrés oxidativo, el ensayo TBARS basado en la absorbancia a 532 nm sigue siendo, con mucho, uno de los ensayos más utilizados para la determinación de la peroxidación lipídica20 y, por lo tanto, la evaluación del estrés oxidativo.

El ensayo TBARS solo se puede encontrar como un kit costoso (más de 400 dólares estadounidenses), en el que las instrucciones no proporcionan información detallada sobre la mayoría de las concentraciones de los reactivos utilizados. Además, los reactivos proporcionados solo se pueden usar para un experimento, porque solo se puede hacer una curva estándar colorimétrica por kit. Esto puede ser problemático para los investigadores que tienen la intención de determinar los niveles de oxidación dentro de unas pocas muestras en diferentes puntos de tiempo, porque la misma curva estándar no se puede usar en múltiples momentos. Por lo tanto, es necesario comprar múltiples kits para múltiples experimentos. Actualmente, a menos que se compre un kit costoso, no hay un protocolo detallado disponible sobre cómo realizar un ensayo TBARS. Algunos investigadores en el pasado han descrito vagamente cómo realizar un ensayo TBARS21,22, pero no hay disponible en la literatura un protocolo completamente detallado o un video completo sobre cómo realizar el ensayo TBARS sin un kit costoso.

Aquí informamos una metodología detallada y analíticamente validada para el propósito sobre cómo realizar un ensayo TBARS de una manera simple, reproducible y económica. Los cambios en la peroxidación lipídica del suero humano, los lisados de HepG2 y las lipoproteínas de baja densidad tras el tratamiento con iones Cu(II) se demuestran como aplicaciones ilustrativas para el ensayo TBARS. Los resultados demuestran que este ensayo TBARS es consistente y reproducible en el día a día.

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Protocolo

Los especímenes de suero humano se obtuvieron de voluntarios que consintieron bajo la aprobación del IRB y de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Las muestras fueron codificadas y desidentificadas antes de su transferencia al laboratorio analítico.

1. Preparación de la muestra

  1. Lisados de células HepG2
    1. Sembrar alrededor de 10 x 106 células HepG2 por matraz en 16 matraces T75 con 14 ml de medios EMEM suplementados con suero bovino fetal al 10% (FBS) y células de crecimiento durante 2 días.
    2. Prepare el tampón RIPA: en un tubo de 50 ml, agregue 1.5 ml de NaCl de 5 M, 2.5 ml de Tris-HCl de 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL de reactivo NP-40, luego lleve el volumen final a 50 ml con agua DI.
    3. Preparar tampón de lisis: alícuota 20 ml de tampón RIPA en un tubo de 50 ml y agregue 200 μL de una solución inhibidora de la proteasa 100x para inhibir la degradación de proteínas y lípidos. Conservar a 4 °C.
      NOTA: El búfer de lisis es compatible con los reactivos TBARS y no interfiere con la absorbancia a 532 nm. Si planea usar un tampón de lisis diferente o agregar ingredientes adicionales al tampón de lisis, se deben realizar estudios de validación preliminares para verificar que los componentes del tampón de lisis sean compatibles con el ensayo TBARS.
    4. Retire los medios que contengan 10% de FBS y lave las células 2x con 5 ml de PBS frío y estéril 1x.
    5. Agregue 1 ml de tampón de lisis a los matraces T75 que contienen las células e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) con remolinos constantes para garantizar que el tampón esté bien distribuido.
    6. Recoger los lisados en tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 ml debidamente etiquetados e incubar en hielo durante 10 min.
    7. Gire los lisados a 5.000 x g durante 10 minutos en RT para recoger los restos celulares y aspire los sobrenadantes en un solo tubo de 15 ml.
    8. Concentre el sobrenadante de lisado celular cuatro veces usando un Speed Vac a 50 °C y 3 mbar y haga alícuotas de 94 μL cada una en tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 mL. Almacene las muestras a -80 °C hasta que se utilicen para la oxidación in vitro y/o el ensayo TBARS.
      NOTA: Para evitar concentrar el sobrenadante de lisado celular, las células también se pueden separar usando 3 ml de 1x tripsina, neutralizarse con 6 ml de medios y lavarse 2 veces con 5 ml de PBS frío. Los gránulos celulares se pueden reconstituir en 250 μL de tampón de lisis, y luego se pueden realizar los pasos 1.1.6 y 1.1.7.
    9. Preparar una solución madre de CuCl2 de 35 mM en ácido acético (pH = 4).
      1. Preparar solución de ácido acético (pH = 4): Diluir 1 μL de ácido acético glacial en 100 mL de agua DI (el pH debe ser aproximadamente 4 pero confirmar esto con un medidor de pH). Agregue más agua o ácido acético para ajustar el pH a 4.
      2. Pesa alrededor de 0,1936 g de cloruro de cobre II y disuelve en 10 ml de la solución de ácido acético (pH = 4) para hacer un stock de CuCl2 de 144 mM. Alícuota 490 μL de esta solución y añádala a 1.510 μL de ácido acético (pH = 4) para hacer una solución de CuCl2 de 35 mM.
    10. Alícuota 6 μL de la solución madre de CuCl2 de 35 mM y agréguela a seis muestras que contengan 94 μL de lisado celular para obtener una concentración final de CuCl2 de aproximadamente 2 mM. Añadir 6 μL de una solución de ácido acético (pH = 4) que no tenga CuCl2 a seis muestras que contengan 94 μL de lisados celulares para usar como controles. El volumen final de lisado celular debe ser de 100 μL, que es lo que se utilizará para el ensayo TBARS.
      NOTA: Hacer la solución madre de CuCl2 de 35 mM en ácido acético (pH = 4) es necesario para evitar la precipitación de hidróxido de cobre.
    11. Incubar muestras en un horno a 37 °C durante 24 h y realizar un ensayo TBARS en cada muestra que contenga un volumen final de 100 μL.
    12. Repita los pasos 1.1.9 y 1.1.11 2x en días separados para comprobar la reproducibilidad del ensayo TBARS para lisados de células HepG2.
  2. Lipoproteínas de baja densidad
    NOTA: Por lo general, la lipoproteína de baja densidad (LDL) prepurificada contiene cierta cantidad de EDTA. Las muestras de LDL utilizadas aquí contienen 0.01% de EDTA. El EDTA puede inhibir la oxidación in vitro mediada por Cu(II) de LDL. Por lo tanto, puede ser necesario eliminar el EDTA de las muestras de LDL antes de los experimentos o análisis. Los pasos 1.2.1–1.2.5 describen este proceso.
    PRECAUCIÓN: El hidróxido de sodio es corrosivo y causa irritación en la piel y los ojos. Use el equipo de protección personal adecuado.
    1. Alícuota de 24 μL de un stock de LDL de 5,51 mg/ml (concentración de proteína determinada por el método de Lowry modificado utilizando BSA como estándar) en tubos de polipropileno de tapa a presión de 1 ml debidamente etiquetados. Hacer tantas alícuotas como sea necesario y almacenar a 4 °C hasta su uso en el ensayo de oxidación y/o TBARS.
    2. Prepare un tampón HEPES de 10 mM en NaCl de 0,15 M ajustado a pH = 7 con perlas de NaOH: disuelva 4,39 g de NaCl en 0,49 L de agua, luego agregue 1,19 g de HEPES. Disolver bien con una barra de agitación. Agregue perlas de hidróxido de sodio hasta que el pH sea 7. Diluir a 0,5 L con agua. Guarde el tampón a 4 °C y úselo en un plazo de 3 meses.
    3. Añadir 476 μL del tampón HEPES de 10 mM en 0,15 M NaCl (pH = 7) a las muestras de LDL alicitadas para llevar el volumen final a 500 μL. Agregue una muestra de LDL diluida a un dispositivo de filtro de espín centrífugo de 0,5 ml con un límite de peso molecular de 100 K.
    4. Girar muestras a 14.000 x g durante 10 min en RT, dejando un volumen de retentura final de aproximadamente 30 μL. Reconstituir muestras en 480 μL del tampón HEPES de 10 mM en NaCl de 0,15 M (pH = 7) y girar de nuevo a 14.000 x g durante 10 min en RT. Realice este paso 2x para un total de cuatro giros.
    5. Coloque el dispositivo de filtro boca abajo en un nuevo tubo de polipropileno de tapa a presión de 2 ml y centrífuga a 1000 x g durante 2 minutos para recolectar la muestra de LDL (volumen final = aproximadamente 30 μL).
    6. Muestre alícuota en un tubo de 1 ml debidamente etiquetado y agregue 20 μL de agua a cada muestra para lograr un volumen final de 50 μL.
    7. Preparación de 200 μM de solución madre de CuCl2 en ácido acético (pH = 4)
      1. Preparar la solución de ácido acético (pH = 4): ver paso 1.1.9.1.
      2. Preparar una solución madre de CuCl2 de 144 mM (ver paso 1.1.9.2), luego alícuota 5.5 μL del caldo de CuCl2 de 144 mM y disolver en un volumen final de 4 mL de ácido acético (pH = 4) para hacer la solución de 200 μM.
    8. Alícuota 2,7 μL de la solución madre de CuCl2 de 200 μM y agréguela a seis muestras que contengan 50 μL de LDL para lograr una concentración final de CuCl2 de ~10 μM. Añadir 2,7 μL de una solución de ácido acético (pH = 4) que no contenga CuCl2 a seis muestras que contengan 50 μL de LDL que se utilizarán para los controles.
    9. Incubar muestras de LDL durante 2 h en un horno a 37 °C. Después de 2 h, llevar el volumen final a 100 μL para cada muestra con un tampón HEPES de 10 mM en 0,15 M de NaCl (pH = 7). Realice inmediatamente un ensayo TBARS.
    10. Repita los pasos 1.2.3–1.2.9 2x en dos días diferentes para probar la reproductividad del ensayo TBARS.
  3. Suero humano
    1. A partir de una muestra de suero humano, haga alícuotas de 94 μL cada una en tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 ml y almacene las muestras a -80 °C.
    2. Preparar una solución madre de CuCl2 de 35 mM en ácido acético (pH = 4): ver paso 1.1.9.
    3. Alícuota 6 μL de la solución madre de CuCl2 y agréguela a seis muestras que contengan 94 μL de suero humano para obtener una concentración final de CuCl2 de aproximadamente 2 mM. Añadir 6 μL de una solución de ácido acético (pH = 4) que no tenga CuCl2 a seis muestras que contengan 94 μL de suero humano para usar como controles.
    4. Incubar muestras de suero humano durante 24 h en un horno a 37 °C y determinar los niveles de oxidación con el ensayo TBARS (sección 4).
    5. Repita los pasos 1.3.2–1.3.4 2x en dos días separados para determinar la reproducibilidad del ensayo TBARS.

2. Preparación de reactivos

PRECAUCIÓN: El ácido tiobarbitúrico causa irritación de la piel y los ojos y puede ser dañino por inhalación o absorción de la piel. El ácido acético puede dañar los órganos internos si se inhala. Prepare todas las soluciones ácidas en una campana extractora de humos.

  1. Preparación de solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 8,1% (p/v)
    1. Pesa 32,4 g de SDS y disuelve en 350 ml de agua DI en un vaso de precipitados. Use una barra de agitación magnética para disolver suavemente el SDS y evitar hacer burbujas. Lleve el volumen final a 400 ml con agua DI y almacene la solución SDS en RT.
      NOTA: Aquí, se prepara una solución SDS al 8,1% en exceso; sin embargo, para 96 muestras, solo se necesitan aproximadamente 20 ml de la solución SDS al 8,1%. Prepare esta solución de acuerdo con el número de muestras que se están analizando.
  2. Preparación de tampón de acetato de sodio 3.5 M (pH = 4)
    1. Diluya 100 ml de ácido acético glacial en 350 ml de agua DI en un vaso de precipitados. Use una barra de agitación magnética para disolverlo suavemente.
    2. Prepare una solución de NaOH de 6,5 M utilizando perlas de hidróxido de sodio en agua. Disolver 13 g de perlas de NaOH en 40 mL de agua DI y llevar a un volumen final de 50 mL con agua DI.
    3. Agregue lentamente aproximadamente 46 ml de la solución de NaOH de 6.5 M a la solución de ácido acético mientras se mezcla con la barra de agitación (esto debería elevar el pH a 4, pero confirme agregando lentamente la solución de NaOH mientras mide con un medidor de pH).
    4. Lleve el volumen final a 500 ml con agua DI y almacene el tampón de acetato de sodio en RT.
  3. Preparación de solución acuosa al 0,8% de ácido tiobarbitúrico (ajustada a pH = 4)
    NOTA: En este paso, la preparación del ácido tiobarbitúrico está optimizada para grandes volúmenes, ya que se va a analizar un gran número de muestras (108 muestras, sin incluir los estándares). Prepare esta solución en función del número de muestras previstas para el análisis.
    1. Prepare una solución de hidróxido de sodio de 5 M utilizando perlas de hidróxido de sodio y agua: disuelva 4 g de perlas de hidróxido de sodio en un volumen final de 20 ml de agua. Almacenar en un recipiente de plástico. Esta solución debe estar recién preparada para cada lote.
    2. Pesa 4 g de ácido tiobarbitúrico y añade 450 ml de agua DI. Use una barra de agitación magnética para disolverlo suavemente.
      NOTA: Esta solución eventualmente se llevará a un volumen total de 500 ml.
    3. Mientras disuelve el ácido tiobarbitúrico con una barra de agitación, agregue (lentamente y de manera superficial) aproximadamente 3 ml de la solución de NaOH de 5 M en incrementos de 100 μL. Después de agregar la solución de NaOH, las partículas de ácido tiobarbitúrico comenzarán a disolverse.
    4. Si las partículas de ácido tiobarbitúrico aún no se han disuelto por completo, agregue más de la solución de NaOH de 5 M en incrementos de 100 μL hasta que todas las partículas de ácido tiobarbitúrico se disuelvan por completo. Para este volumen particular de solución, se agrega un total de 4 ml de la solución de NaOH de 5 M para disolver completamente las partículas de ácido tiobarbitúrico.
      NOTA: A esta concentración, el ácido tiobarbitúrico no se disolverá completamente a menos que el pH sea de casi 4.
    5. Deje de agregar NaOH después de que todo el ácido tiobarbitúrico se haya disuelto por completo. Evite exceder un pH de 4. El pH final se puede verificar tomando 1 μL de la solución de ácido tiobarbitúrico mezclada y colocándola sobre papel de pH.
    6. Lleve el volumen final a 500 ml con agua DI y almacene la solución acuosa de ácido tiobarbitúrico al 0,8% en RT.

3. Preparación estándar de muestras de malondialdehído bis (dimetil acetal)

NOTA: El malondialdehído (MDA) es inestable y no está disponible comercialmente. Sin embargo, hay diferentes formas químicas de MDA que están disponibles comercialmente, como la sal de tetrabutilamonio MDA, MDA bis (dimetil acetal) y MDA bis (dietil acetal). De estas tres formas químicas, MDA bis(dimetil acetal) se utiliza aquí, porque la mayoría de los estudios utilizan este mismo estándar21,22. Si se opta por utilizar las otras dos formas químicas de MDA, se debe llevar a cabo una validación previa de su idoneidad.

  1. Prepare una solución madre de MDA bis(dimetilacetal) de 550 μM diluyendo 92 μL de MDA bis(dimetil acetal) puro en 1 L de agua DI. Use una barra de agitación magnética para mezclar bien la solución durante 10 minutos. Guarde la solución a 4 °C y úsela en un plazo de 1 mes.
  2. Preparar un 200 μM MDA bis(dimetil acetal) diluyendo 726 μL de la cepa de 550 μM MDA bis(dimetil acetal) en 1274 μL de agua DI. Esta solución de 200 μM MDA bis(dimetil acetal) debe prepararse fresca cada vez que se realice un ensayo TBARS.
  3. Preparación de la curva estándar: tome ocho tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 ml y etiquételos con letras A a H. Agregue MDA bis (dimetil acetal) del stock de 200 μM y diluya en agua como se describe en la Tabla 1.
  4. Tome ocho tubos de vidrio (13 mm x 100 mm) y etiquételos de la A a la H, luego agregue 100 μL de estándar a los tubos correspondientes. Realice seis réplicas para el estándar en blanco (muestra A) para calcular los límites de detección del ensayo TBARS.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí por no más de 1 h.

4. Ensayo TBARS

NOTA: Una vez que se inicia el ensayo TBARS, debe terminarse sin detenerse.

  1. Tome tantos tubos de vidrio como sea necesario para el número de muestras a analizar y etiquételos con los nombres de las muestras. Luego, agregue 100 μL de cada muestra preparada (como se describió anteriormente) a cada tubo de vidrio.
  2. Agregue 200 μL de SDS al 8.1% a cada muestra y haga girar suavemente el tubo de vidrio en un movimiento circular para mezclar la muestra.
  3. Agregue 1.5 ml del tampón de acetato de sodio de 3.5 M (pH = 4) a cada muestra y estándar.
  4. Añadir 1,5 ml de la solución acuosa de ácido tiobarbitúrico al 0,8% (pH = 4) a cada muestra y estándar.
  5. Lleve el volumen final a 4 ml para cada muestra y estándar agregando 700 μL de agua DI.
  6. Tapa herméticamente cada tubo de vidrio e incuba en un bloque calefactor a 95 °C durante 1 h. Cubra los tubos de vidrio con papel de aluminio para evitar la condensación en la parte superior de los tubos.
  7. Retire los tubos de vidrio del bloque de calentamiento e incube en hielo durante 30 minutos.
  8. Muestras de centrífugas y estándares a 1500 x g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, mantenga los tubos de vidrio que contienen las muestras y los estándares en RT.
    NOTA: Mantener las muestras en hielo o a 4 °C hará que toda la muestra o estándar precipite.
  9. Inmediatamente después de la centrifugación, alícuota 150 μL de sobrenadante de cada tubo y colóquelo en un pozo separado de una placa de 96 pocillos.
  10. Retire las burbujas de cada pozo con una punta de pipeta.
    NOTA: La presencia de burbujas producirá lecturas de absorbancia inconsistentes, lo que llevará a una alta imprecisión del ensayo.
  11. Absorbancias de lectura a 532 nm. Reste la lectura de absorbancia promedio de las muestras en blanco de todas las demás lecturas de absorbancia.
  12. Cree una curva estándar trazando las lecturas de absorbancia restadas en blanco a 532 nm frente a la concentración conocida de cada estándar. Ajuste los puntos de datos mediante regresión lineal. Calcular concentraciones de muestra desconocidas utilizando la ecuación de la línea de regresión lineal obtenida de la curva estándar.

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Resultados

En condiciones ácidas (pH = 4) y a 95 °C, el malondialdehído (MDA) bis(dimetil acetal) produce MDA23. MDA y congéneres químicos estrechamente relacionados reaccionan con dos moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para producir compuestos llamados sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dan un color rojo-rosa y tienen una absorbancia λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando MDA bis (dimetil acetal) como ...

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Discusión

A pesar de sus limitaciones1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 y la falta de idoneidad para la comparación entre laboratorios, el ensayo TBARS es uno de los más

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia u otros conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

La investigación reportada aquí fue apoyada en parte por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio no. R33 CA217702 y el programa iniciativa para maximizar el desarrollo estudiantil (IMSD). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBS estéril pH 7.4 1 LVWR, PA--262reactivo de lisis celular
50 mL tubo de centrífuga autónomoCorning, NYCLS430897Material general
Placa de 96 pocillos, sin tratar, transparente, con tapa, no estérilThermo Fisher Scientific, MA280895Para medir la absorbancia
Amicon Ultra-0.5 100 kD Dispositivo de filtro centrífugo de rotación FisherScientific, NHUFC510024Purificación de LDL
Tapones para tubos de vidrioThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Dpara ensayo TBARS
Cloruro de cobre IISIGMA, MO222011-250Gpara inducir oxidación
Tubos de cultivo, desechables, con acabado de tapón de rosca, vidrio de borosilicato (13 x 100 mm)VWR, PA53283-800para ensayo TBARS
Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM)ATCC, VAHB-8065 Medios decélula HepG2
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mLEppendorf, NY22363204 Material general
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mLGenesee Sceitific, CA22363352Material general
Suero fetal bovino Fuente US OmegaScientific, CAFB-11para cultivo celular
Ácido Acético GlacialSIGMA, MO27225-1L-RReactivo TBARS
Cóctel de inhibidor de la proteasa Halt (100x)Thermo Scientific, MA87786reactivo de lisis celular
HEPESSIGMA, MOH3375-250GSolvente LDL
Células HepG2ATCC, VAHB-8065 Prototipo dematriz biológica
Ácido clorhídrico (HCl)Fisher Scientific, NHReactivo
de lisis celular A144-212Legend Micro 17 CentrífugaThermo Scientific, MA75002431Material general
Lipoproteína de baja densidad, plasma humanoAthens Research & Tecnología, GA12-16-120412Prototipo de matriz biológica
Barras de agitación magnéticas, Octágono 6-SurtidoVWR, PA58948-025Material general
Malondialdehído bis (dimetilacetal)SIGMA, MO8207560250TBARS
Espectrofotómetro de microplaca Multiskan Go estándarFisher Scientific, NH51119200Para medir la absorbancia
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLreactivo de lisis celular
Cloruro de sodioSIGMA, MOS7653-1KGreactivo de lisis celular
Dodecil sulfato de sodio (SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS Reactivo
Hidróxido de sodioSIGMA, MO367176-2.5KGTBARS Reactivo
SpeedVac ConcentradorThermo Scientific, MASC250EXPpara matraz de lisados de células concentradas
T-75, tratamiento con cultivo de tejidos, 250 mL, con tapa de filtroUSA Scientific, FL658175cultivo celular
Ácido tiobarbitúricoSIGMA, MOT5500-100GReactivo TBARS TRIS
base Fluka, GA93362reactivo de lisis celular
Tripsina (1x)VWR, PA16777-166Para separar células HepG2
101642

Referencias

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