Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Resumen

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Resumen

La identificación de interacciones específicas proteína-ADN en el genoma es importante para entender la regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se utiliza ampliamente para identificar ubicaciones de unión a todo el genoma de proteínas que unen el ADN. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por su heterogeneidad en longitud de fragmentos de ADN sonicados y ADN de fondo no específico, lo que resulta en una baja resolución cartográfica e incertidumbre en los sitios de unión al ADN. Para superar estas limitaciones, la combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) utiliza digestión exonucleasa de 5' a 3' para recortar el ADN inmunoprecipitado de tamaño heterogéneo al sitio de enlace cruzado proteína-ADN. El tratamiento con exonucleasa también elimina el ADN de fondo no específico. El ADN preparado por la biblioteca y digerido por exonuclease puede ser enviado para secuenciación de alto rendimiento. El método ChIP-exo permite una resolución de mapeo cercana al par base con mayor sensibilidad de detección y señal de fondo reducida. A continuación se describe un protocolo ChIP-exo optimizado para células de mamíferos y secuenciación de próxima generación.

Introducción

Las ubicaciones de las interacciones proteína-ADN proporcionan información sobre los mecanismos de regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se ha utilizado durante una década para examinar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma en las células vivas^1,2. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por la heterogeneidad en la fragmentación del ADN y la contaminación de ADN no entrante que conducen a una baja resolución cartográfica, falsos positivos, llamadas perdidas y señal de fondo no específica. La combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) mejora el método ChIP-seq recortando el ADN ChIP a los puntos de enlace proteína-ADN, proporcionando una resolución cercana al par base y una señal de fondo baja^3,4,5. La resolución cartográfica muy mejorada y los bajos antecedentes proporcionados por ChIP-exo permiten determinar ubicaciones precisas y completas de unión proteína-ADN en todo el genoma. ChIP-exo es capaz de revelar motivos funcionalmente distintos de unión al ADN, interacciones cooperativas entre factores de transcripción (TF) y múltiples sitios de enlace proteína-ADN en una determinada ubicación de unión genómica, no detectable por otros métodos de cartografía genómica^3,4,6,7.

ChIP-exo se utilizó inicialmente en levadura en ciernes para examinar la unión de ADN específica de secuencia de los TFs, para estudiar la organización precisa del complejo de transcripción previa a la iniciación, y la estructura sub-nucleosomal de histonas individuales a través del genoma^4,8,9. Desde su introducción en 2011^4,ChIP-exo se ha utilizado con éxito en muchos otros organismos incluyendo bacterias, ratones y células humanas^{7,10,11,12,13,14,15,16,17.} En 2016, Rhee et al.¹⁴ utilizaron ChIP-exo en neuronas de mamíferos por primera vez para entender cómo se mantuvo la expresión génica neuronal después de la regulación descendente de la programación tf Lhx3, que forma un complejo heterodímero con otra programación TF Isl1. Este estudio demostró que en ausencia de Lhx3, Isl1 es reclutado para nuevos potenciadores neuronales unidos por Onecut1 TF para mantener la expresión génica de genes efectores neuronales. En este estudio, ChIP-exo reveló cómo múltiples TFs reconocen dinámicamente el tipo de célula y los elementos reguladores de ADN específicos de la etapa celular de una manera combinatoria a la resolución de mapeo de casi nucleótidos. Otros estudios también utilizaron el método ChIP-exo para entender la interacción entre las proteínas y el ADN en otras líneas celulares de mamíferos. Han et al.⁷ utilizó ChIP-exo para examinar la organización del genoma de los TFs GATA1 y TAL1 en células eritródicas de ratón utilizando ChIP-exo. Este estudio encontró que TAL1 se recluta directamente para el ADN en lugar de indirectamente a través de interacciones proteína-proteínas con GATA1 a lo largo de la diferenciación eritroide. Estudios recientes también utilizaron ChIP-exo para perfilar las ubicaciones de unión a todo el genoma de CTCF, ARN Polymerase II y marcas de histona para estudiar mecanismos epigenómicos y transcripcionales en líneas celulares humanas^18,19.

Hay varias versiones del protocolo ChIP-exo disponibles^3,5,20. Sin embargo, estos protocolos ChIP-exo son difíciles de seguir para las investigaciones que no están familiarizadas con la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación. Una excelente versión del protocolo ChIP-exo fue publicada con instrucciones fáciles de seguir y un video^21,pero contenía muchos pasos enzimáticos que requieren una cantidad significativa de tiempo para completarse. Aquí informamos de una nueva versión del protocolo ChIP-exo que contiene pasos enzimáticos reducidos y tiempos de incubación, y explicaciones para cada paso enzimático²¹. Las reacciones de reparación final y relaves dA se combinan en un solo paso utilizando la enzima de preparación final. Los tiempos de incubación de los pasos de ligadura del adaptador universal y de índice se reducen de 2 h a 15 min utilizando un potenciador de ligadura. Se elimina la reacción quinasa después del paso de ligadura del adaptador de índice descrito en el protocolo ChIP-exo anterior. En su lugar, se agrega un grupo de fosfato durante la síntesis de ADN de oligo a uno de los extremos de 5' del adaptador de índice(Tabla 1),que se utilizará para el paso de digestión lambda exonuclease. Mientras que el protocolo chip-exo anterior utilizó la digestión RecJ_f exonuclease para eliminar contaminantes de ADN de una sola cadena, este paso de digestión se elimina aquí porque no es crítico para la calidad de la biblioteca ChIP-exo. Además, para purificar el ADN de enlace inverso después de la elución chip, se utiliza un método de purificación de cuentas magnéticas en lugar del método de extracción de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (PCIA). Esto reduce el tiempo de incubación de la extracción de ADN. Es importante destacar que elimina la mayoría de los atenuadores de adaptador formados durante la ligadura del adaptador de índice, lo que puede afectar a la eficiencia de la PCR mediada por ligadura.

El protocolo ChIP-exo presentado aquí está optimizado para la detección de interacciones precisas proteína-ADN en neuronas de mamíferos diferenciadas de las células madre embrionarias (ES) del ratón. Brevemente, las células neuronales cosechadas y reticuladas se miman, para permitir que la cromatina esté expuesta a la sonicación, luego sonicadas para que se obtengan fragmentos de ADN de tamaño adecuado(Figura 1). Las cuentas recubiertas de anticuerpos se utilizan para inmunoprecipitar selectivamente la cromatina fragmentada y soluble a la proteína de interés. Mientras que el ADN inmunoprecipitado todavía está en las cuentas, se realizan pasos de reparación final, ligadura de adaptadores de secuenciación, reacción de relleno y 5' a 3' pasos de digestión exonucleasa lambda. El paso de digestión exonuclease es lo que le da a ChIP-exo su alta resolución y alta relación señal-ruido. Lambda exonuclease recorta el ADN inmunoprecipitado a unos pocos pares de bases (bp) del sitio de enlace cruzado, lo que hace que el ADN contaminante se degrade. El ADN ChIP tratado con exonucleasa se eluta de las cuentas recubiertas de anticuerpos, se invierten los enlaces cruzados proteína-ADN y se degradan las proteínas. El ADN se extrae y desnaturaliza al ADN ChIP de una sola cadena, seguido de recocido de imprimación y extensión para hacer ADN de doble cadena (dsDNA). A continuación, se realiza la ligadura de un adaptador universal a los extremos tratados con exonucleasa. El ADN resultante se purifica, luego pcr amplificado, gel purificado, y sometido a secuenciación de próxima generación.

El protocolo ChIP-exo es más largo que el protocolo ChIP-seq, pero no es muy difícil técnicamente. Cualquier ADN ChIP inmunoprecipitado con éxito puede ser sometido a ChIP-exo, con varios pasos enzimáticos adicionales. Las ventajas notables de ChIP-exo, como la resolución de mapeo ultra alta, una señal de fondo reducida y la disminución de falsos positivos y negativos, con respecto a los sitios de enlace genómico, superan el costo de tiempo.

Protocolo

NOTA: Se recomienda el agua destilada y desionizada autoclavada (ddH₂O) para la fabricación de tampones y mezclas maestras de reacción. Las secciones 1-4 describen la lisis celular y la sonicación, las secciones 5-7 describen la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), las secciones 8-11 describen reacciones enzimáticas en cuentas, las secciones 12 y 13 describen la elución chip y la purificación del ADN, y las secciones 14-19 describen la preparación de la biblioteca.

1. Cosecha y reticulación de células

1. Después de diferenciar las células ES del ratón en neuronas postmitóticas, agregue un 11% de formaldehído a las células cosechadas a una concentración final del 1% (v/v). Células de roca en una plataforma de balanceo (un balancín, agitador o rotador) durante 15 min, a temperatura ambiente (RT, 25 °C).
   NOTA: Dependiendo de la proteína objetivo a cruzar, menos enlace cruzado de formaldehído (por ejemplo, una concentración final de 0,5%) o doble reticulación con glutatrato de disuccinimidilo (DSG) se puede utilizar.
2. Añadir 2,5 M de glicina a una concentración final de 150 mM para detener la reacción de enlace cruzado. Células de roca en una plataforma de balanceo en RT, durante 5 minutos.
3. Centrífuga las células reticuladas en tubos cónicos de 15 ml en RT, durante 6 min, a 1.350 x g. Aspirar la solución, luego resuspend células en 5 ml de solución salina tamponada de fosfato 1x (PBS).
   NOTA: Los pellets de celda reticulados se pueden almacenar a -80 °C después de la congelación repentina con nitrógeno líquido.

2. Lisis celular

NOTA: Los siguientes pasos en este protocolo son para aproximadamente 2 x 10⁷ células neuronales diferenciadas de las células ES del ratón. Para romper las células abiertas, se utilizarán tampones de lisis que contengan varios detergentes. Añadir 50 μL de 1000x de material completo de inhibidor de la proteasa (CPI) a 50 ml de tampón justo antes de su uso.

1. Prepare los buffers de lisis 1-3 como se describe en la Tabla 2.
2. Descongelar pellets celulares cruzados en hielo, luego resuspend completamente pellets celulares en 3 ml de tampón de lisis 1 en tubos cónicos de 15 ml. Roca a 4 °C durante 15 min en una plataforma de balanceo. Centrífuga a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar sobrenadante.
3. Células peletadas completamente resuspend en 3 ml de tampón de lisis 2. Roca a 4 °C durante 10 minutos en una plataforma de balanceo. Centrífuga a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar sobrenadante.
4. Añadir 1 ml de lysis buffer 3 a cada pellet, a continuación, mantener en el hielo. Proceda inmediatamente a la sonicación.

3. Cromatina sonicizante

NOTA: Mantenga las muestras en hielo o a 4 °C durante este procedimiento de sonicación para reducir la reversión del enlace cruzado.

1. Usando una espátula estéril, agregue cuentas de sonicación(Tabla de Materiales)hasta la marca de graduación de 0,2 ml en tubos de poliestireno de 15 ml. Lave las cuentas de sonicación por vórtice en 600 μL de 1x PBS hasta que no haya manchas secas visibles. Centrífuga los tubos durante 5 s a 30 x g y aspirar 1x PBS.
   NOTA: La sonicación en tubos de poliestireno es más eficiente que la sonicación en tubos de polipropileno. Si se sonica un número menor de células (por ejemplo, <10⁶ células), utilice tubos de poliestireno de 1,5 ml sin añadir cuentas de sonicación.
2. Resuspendó a fondo los lysatos nucleares en 1 ml de lysis buffer 3 (desde el paso 2.4), luego transferir a los tubos de poliestireno de 15 ml que contienen cuentas de sonicación. Vórtice breve de los tubos de poliestireno.
3. Para fragmentar el ADN de cromatina reticulada, los lysatos nucleares sonicados a 4 °C para un número optimizado de ciclos, con amplitud de potencia a 30 W, y ciclos de sonicación ajustados en 30 s on/30 s apagados.
   NOTA: La optimización de la sonicación para cada tipo de celda y lote dará como resultado el mejor rendimiento chip-exo. Para 2 x 10⁷ células neuronales del ratón, 20-30 ciclos de sonicación en los ajustes mencionados fragmentarán la cromatina en el rango de 100-500 bp.
4. Una vez completada la sonicación, transfiera todos los sobrenadantes (lysatos sonicados), de cada muestra, a tubos de 1,5 ml. Añadir 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoxi]etanol) a cada muestra a una concentración final del 1%. Mezclar por pipeteo.
5. A los desechos de células de pellets, muestras de centrífugas a 13.500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfiera todos los lysates sonicados (sobrenadantes) de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 ml.
6. Tome 30 μL de lysato sonicado de cada muestra (~3% de lysate sonicado) y agregue a nuevos tubos de 1,5 ml para comprobar la sonicación. Almacene los liceos sonicados restantes a 4 °C hasta que estén listos para la incubación con cuentas recubiertas de anticuerpos.

4. Comprobación de la sonicación

1. Hacer 20 ml de tampón K proteico 2x añadiendo 2 ml de Tris-HCl de 0,5 M (pH 8.0), 2 ml de 0,5 M EDTA, 10 ml de sulfato de dodecilo sódico (SDS) y 6 ml de ddH₂O autoclavado. No agregue IPC a este búfer. Conservar en tubo de 50 ml en RT.
2. Para revertir el enlace cruzado proteína-ADN, mediante la eliminación de las proteínas, tome los 30 μL de cromatina sonicada de cada muestra (del paso 3.6), agregue 166 μL de ddH₂O autoclavado, 200 μL de 2x tampón de proteína K y 4 μL de 20 mg/ml de proteinasa K. V. Vórtice brevemente las muestras, y luego incubar a 65 °C durante 1-3 h a 24 x g.
3. NOTA: Los lysates sonicados se pueden reenreconectar a 65 °C durante la noche.
4. Extraer ADN usando PCIA (25:24:1) y método de precipitación de etanol de la siguiente manera.
   PRECAUCIÓN: PCIA es tóxico. Utilícenlo bajo una campana de humo con equipo de protección personal estándar (EPI).
   1. Añadir 400 μL de PCIA a cada muestra en tubos de 1,5 ml, ajustar el vórtice a la velocidad máxima y muestras de vórtice durante 20 s. Centrífuga a 18.400 x g durante 6 minutos en RT. Se observarán dos fases. Transfiera cuidadosamente la capa acuosa superior (fase clara) de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 ml.
   2. Añadir 1 μL de 10 mg/ml de RNase A. Incubar muestras a 37 °C durante 30 min.
   3. Añadir 1 μL de glucógeno de 20 mg/ml a cada muestra, luego precipitar con 1 ml de etanol frío al hielo al 100% (almacenado en un congelador de -20 °C). Mezcle brevemente y luego incuba muestras en un congelador de -80 °C durante 30 min a 1 h. Muestras de centrífuga a 18.400 x g durante 10 minutos a 4 °C y verter cuidadosamente 100% etanol.
   4. Lave pellets con 500 μL de etanol frío en hielo al 70% (almacenado en un congelador de -20 °C). Centrífuga a 18.400 x g durante 5 minutos a 4 °C. Vierta cuidadosamente un 70% de etanol.
   5. Incubar muestras en tubos de 1,5 ml a 50 °C hasta que se evapore el etanol restante. Pellets de ADN resuspend en 15 μL de ddH_{autoclavado 2}O o ddH₂O sin nucleasa.
   6. Ejecute las muestras de ADN extraídas, junto con una escalera de ADN, en un gel de agarose del 1,5% a 120-180 V y compruebe el tamaño del ADN sonicado.

5. Incubación de anticuerpos con cuentas

NOTA: Los siguientes pasos en este protocolo son para aproximadamente 2 x 10⁷ células neuronales diferenciadas de las células ES del ratón. No congele y descongele cuentas magnéticas en ningún momento durante el protocolo ChIP-exo, ya que las cuentas pueden agrietarse causando contaminación de la muestra o el rendimiento del anticuerpo puede verse comprometido.

1. Después de la lisis celular y la sonicación, preparar cuentas magnéticas de proteína G(tabla de materiales)para chIP, mezclar cuentas magnéticas hasta que sean homogéneas, luego añadir 25 μL de cuentas magnéticas a 2 tubos de unión bajo en proteínas de 2 ml.
   NOTA: El tipo de cuentas magnéticas utilizadas dependerá de las especies de anticuerpos.
2. Lavar cuentas con 1 ml de solución de bloqueo(Tabla 2),mezclar bien, luego colocar en un bastidor magnético durante 1 min. Mientras esté todavía en un estante magnético, retire el sobrenadante una vez que esté claro.
3. Añadir 1 ml de solución de bloqueo a las cuentas magnéticas. Tubos de roca durante 10 minutos a 4 °C en una plataforma de balanceo. Gire brevemente, luego coloque los tubos en un bastidor magnético y retire el sobrenadante.
4. Repita el paso 5.3 dos veces más.
5. Añadir 500 μL de solución de bloqueo a cuentas magnéticas. Gire brevemente el anticuerpo contra Isl1 (0,04 μg/μL, Tabla de Materiales),luego agregue 4 μg de anticuerpo a los correspondientes tubos de unión bajo en proteínas de 2 ml que contengan las cuentas magnéticas en la solución de bloqueo.
6. Repita el paso 5.5 sin anticuerpo (es decir, el control sin anticuerpos para ChIP).
   NOTA: La cantidad de anticuerpos a añadir se puede determinar empíricamente teniendo en cuenta la calidad del anticuerpo y el número de células utilizadas para ChIP.
7. Muestras de roca a 4 °C para 6-24 h en una plataforma de balanceo.

6. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

1. Lave cuentas recubiertas de anticuerpos del paso 5.8 con 1 ml de solución de bloqueo. Coloque las muestras en una plataforma de balanceo a 4 °C durante 5 minutos. Retire el sobrenadante.
2. Repita el paso 6.1 dos veces más.
3. Resuspend cuentas recubiertas de anticuerpos en 50 μL de solución de bloqueo, luego transferir a nuevos tubos de unión bajo en proteína de 2 ml. Para cada muestra de ChIP, agregue lysatos sonicados (~1,0 ml desde el paso 3,6) a cuentas recubiertas de anticuerpos en tubos de unión bajos en proteínas de 2 ml.
4. Incuba cada muestra en una plataforma de mecedora durante la noche a 4 °C.

7. ChIP lava

NOTA: Mantenga las muestras en hielo o a 4 °C para mantener el enlace cruzado proteína-ADN durante los lavados chip.

1. Haga un búfer de lavado de sal alto, tampón de lavado LiCl y tampón Tris-HCl de 10 mM (pH 7.4) como se describe en la Tabla 3. Conservar en tubos de 50 ml a 4 °C. Añadir 50 μL de 1000x stock CPI a todos los buffers justo antes de su uso.
2. Gire brevemente muestras en tubos de unión bajo en proteínas de 2 ml para recoger líquido de las tapas, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta.
3. Para los lavados ChIP, agregue 1 ml de tampón de lisis 3 (a 4 °C) a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
4. Agregue 1 ml de tampón de lavado de sal alta en frío a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
5. Agregue 1 ml de búfer de lavado LiCl frío a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
6. Agregue 1 ml de búfer Tris-HCl frío de 10 mM (pH 7.4) a cada tubo. Mezcle en una plataforma de mecedora a 4 °C durante 5 minutos. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: El búfer Tris-EDTA (pH 8.0) se puede utilizar en lugar del búfer Tris-HCl (pH 7.4).
7. Repita los pasos 7.4−7.6 tres veces.
8. Transfiera las cuentas de muestra con 500 μL de tampón Tris-HCl (pH 7.4) a tubos frescos de 1,5 ml. Gire brevemente las muestras, luego colóquelos en un estante magnético durante 1 minuto y retire el sobrenadante con una pipeta.

8. Finalizar la reparación y la reacción de dA-tailing en cuentas

NOTA: La sonicación a menudo genera dsDNA final no contundente. Se requiere una reacción de reparación final para hacer ADN contundente antes de la reacción de relaves dA seguida del paso de ligadura del adaptador de índice. Para la ligadura de ADN final pegajoso con ADN del adaptador de índice, dATP se añade al extremo de 3' de un fragmento dsDNA contundente por la reacción de relaves dA. La mezcla de reacción de preparación final contiene dATP.

1. Después de lavar chip, añadir 38 μL de ddH₂O autoclavado a las cuentas de muestra en tubos de 1,5 ml para la reparación final y la reacción dA-tailing.
2. Añadir 5,6 μL de mezcla de reacción de preparación final y 2,4 μL de mezcla de enzimas de preparación final(tabla de materiales)a cada muestra (volumen de reacción total: 46 μL). Incuba muestras a 20 °C durante 30 min.
3. Lave las cuentas como se describe en los pasos de lavado chip anteriores 7.4−7.6.

9. Ligadura del adaptador de índice en cuentas

NOTA: El adaptador de índice tiene 6-10 bases de secuencias de índice con código de barras, que son específicas de una muestra determinada utilizada para multiplexar varias muestras en secuenciación de alto rendimiento. Las secuencias de ADN del adaptador de índice se describen en la Tabla 1.

1. Para la ligadura del adaptador de índice, agregue 27 μL de búfer Tris-HCl frío de 10 mM (pH 7.4) a las cuentas de muestra. Añadir 2 μL de adaptador de índice de 15 μM, 0,5 μL de potenciador de ligadura y 15 μL de mezcla maestra de ligalosa(tabla de materiales)a cada muestra (volumen de reacción total: 44,5 μL).
2. Incuba muestras a 20 °C durante 15 min. Lave las cuentas como se describe en los pasos 7.4−7.6.

10. Reacción de relleno en cuentas

NOTA: Después de la ligadura del adaptador, no hay unión de fosfodiester entre el extremo de 5' del adaptador y el extremo de 3' del ADN ChIP. El nick puede ser reparado por una reacción de relleno.

1. Añadir 47 μL de búfer tris-HCl frío de 10 mM (pH 7.4) a las cuentas de muestra.
2. Haga la mezcla de reacción de relleno(Tabla 4 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
3. Añadir 11,1 μL de mezcla de relleno a cada muestra (volumen de reacción total: 58,1 μL). Incuba muestras a 30 °C durante 20 min. Lave las cuentas como se describe en los pasos 7.4−7.6.

11. Digestión exonuclease lambda en cuentas

1. Después de la reacción de relleno en las cuentas, agregue 50 μL de ddH₂O autoclavado en frío a las cuentas de muestra.
2. Para digerir el ADN chip en la dirección de 5' a 3', añadir 6 μL de 10x tampón lambda exonuclease y 2 μL de 5 U/μL exonuclease lambda(Tabla de materiales,volumen de reacción total: 58 μL). Incuba muestras a 37 °C durante 30 min. Lave las cuentas como se describe en los pasos 7.4−7.6.

12. Elución y reticulación inversa

1. Realice el búfer de elución ChIP como se describe en la Tabla 5.
   NOTA: No agregue CPI al búfer de elución ChIP.
2. Para obtener muestras chip de las cuentas, resuspend muestras en 75 μL de tampón de elución ChIP e incubar a 65 °C durante 15 min a 130 x g.
3. Añadir 2,5 μL de 20 mg/ml de proteinasa K(Tabla de Materiales)a las muestras. Vórtice breve, luego incubar las muestras durante la noche a 65 °C.

13. Extracción de ADN

1. Después de que las muestras hayan incubado durante la noche a 65 °C, gire brevemente muestras, colóquelos en un bastidor magnético durante 1 minuto y luego transfiera el sobrenadante de cada muestra a nuevos tubos de 1,5 ml.
2. Añadir 1 μL de 10 mg/ml RNase A a las muestras. Vórtice breve, luego incubar las muestras a 37 °C durante 30 min. Añadir ~25 μL de ddH autoclavado₂O a volumen de hasta 100 μL.
3. Purificar el ADN utilizando cuentas magnéticas(Tabla de Materiales). ADN elute con 16 μL de ddH autoclavado₂O o ddH₂O sin nucleasa.

14. Desnaturalización, recocido de imprimación y extensión de imprimación

1. Después de la elución ChIP y el reticulación inversa, transfiera 16 μL de las muestras de ADN extraídas del paso 13.3 a los tubos PCR.
2. Hacer mezcla de desnaturalización y recocido de imprimación(Tabla 6 y Tabla de Materiales)sobre hielo. Añadir 1,2 μL de mezcla de desnaturalización y recocido de imprimación a cada muestra (volumen total de reacción: 17,2 μL). Ejecute muestras utilizando el programa descrito en la Tabla 6 para desnatura y imprimaciones de recocido en el ADN de la plantilla.
3. Haga la mezcla de extensión de imprimación(Tabla 7 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
4. Una vez finalizado el programa de desnatura y recocido, añada 3 μL de mezcla de extensión de imprimación a las muestras (volumen total de reacción: 20,2 μL). Ejecute ejemplos utilizando el programa para la extensión de imprimación descrito en la Tabla 7.
5. Proceda inmediatamente a la reacción de dA-tailing.

15. Reacción de dA-tailing

NOTA: Para la ligadura de ADN final pegajoso con ADN de adaptador universal, dATP se añade al extremo de 3' de contundente, dsDNA por la reacción dA-tailing.

1. Hacer mezcla de dA-tailing(Tabla 8 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
2. Añadir 4,1 μL de mezcla de relaves dA a cada muestra (volumen total de reacción: 24,3 μL). Ejecute muestras utilizando el programa para dA-tailing (Tabla 8).
3. Proceda inmediatamente a la ligadura universal del adaptador.

16. Ligadura universal del adaptador

NOTA: El adaptador universal incluye secuencias específicas de secuenciación de alto rendimiento para el reconocimiento de muestras de ADN para la química de secuenciación. Las secuencias de ADN del adaptador universal se describen en la Tabla 1.

1. Después de la reacción del dA-tailing, haga la mezcla de ligadura del adaptador universal(Tabla 9 y Tabla de Materiales)para la ligadura universal del adaptador.
2. Añadir 21,5 μL a cada muestra (volumen total de reacción: 45,8 μL) e incubar muestras durante 15 min a 20 °C.

17. Limpieza del ADN

1. Purificar el ADN utilizando cuentas magnéticas(Tabla de Materiales). ADN elute con 21 μL de ddH_{autoclavado 2}O o ddH₂O libre de nucleasa.
2. Almacene muestras a -20 °C hasta que estén listas para realizar la purificación de PCR (LM-PCR) y PCR mediada por ligaduras.

18. PCR mediado por ligamentos

NOTA: Las secuencias de imprimación LM-PCR se describen en la Tabla 1.

1. Después de la limpieza del ADN, haga la mezcla LM-PCR(Tabla 10 y Tabla de Materiales)sobre hielo.
2. Añadir 29 μL de mezcla LM-PCR a cada muestra (volumen total de reacción: 50 μL) y ejecutar muestras utilizando el programa para LM-PCR (Tabla 10).
3. Proceda inmediatamente a la purificación en gel del ADN amplificado de PCR, seguido de la purificación del ADN para la secuenciación de alto rendimiento.

19. Adn purificación del ADN amplificado LM-PCR

1. Ejecute las muestras de ADN amplificadas LM-PCR, junto con una escalera de ADN, en un gel de agarose del 1,5% a 120-180 V y bandas de 200-400 bp.
2. Purificar el ADN del gel excado utilizando un kit de extracción de gel(Tabla de Materiales).
3. Después de la purificación del ADN, compruebe la concentración(Tabla de Materiales)de cada muestra de la biblioteca ChIP-exo. Envíe ejemplos para secuenciación de alto rendimiento para secuenciación de lectura única.
   NOTA: La longitud de lectura preferida para la secuenciación de una sola lectura es de al menos 35 bp, lo que es suficiente para alinear de forma única las lecturas de secuenciación con el genoma de referencia en ratones o células humanas. Para la mayoría de los factores de transcripción en ratones o células humanas, 10-20 millones de lecturas por muestra chip-exo son suficientes para identificar sus ubicaciones de unión genómica. Se requieren al menos 30 millones de lecturas por muestra para mapear regiones genómicas enriquecidas con marcas de histona en células de mamíferos.

Resultados

La Figura 2A ilustra los resultados de sonicación después de la lisis celular y la sonicación, con varios ciclos, de células de neuronas motoras diferenciadas de las células ES del ratón. El número óptimo de ciclos de sonicación (por ejemplo, 12 ciclos en la Figura 2A)generó una fuerte intensidad de ADN en fragmentos de ADN de 100-400 bp. Las bibliotecas ChIP-exo de alta calidad se basan en el tamaño y la cantidad de ADN de cromatina fragmentada. Por lo tanto, s...

Discusión

En este protocolo, chip seguido de digestión exonuclease se utiliza para obtener bibliotecas de ADN para la identificación de interacciones proteína-ADN en células de mamíferos a resolución cartográfica ultra alta. Muchas variables contribuyen a la calidad del experimento ChIP-exo. Los parámetros experimentales críticos incluyen la calidad de los anticuerpos, la optimización de la sonicación y el número de ciclos LM-PCR. Estos parámetros experimentales críticos también son lo que puede limitar los experimentos chip-exo y...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa,	UltraPure Invitrogen	16500	Comprobación de la sonicación (sección 4.3.6) y purificación en gel del ADN amplificado por LM-PCR (sección 19.1)
Albúmina, suero bovino (BSA), libre de proteasas, aislamiento por choque térmico, mín. 98%	BioShop	ALB003	Anticuerpo de solución bloqueante
contra Isl1	DSHB	39.3F7	Incuación de anticuerpos con perlas (Sección 5.6)
Bioruptor Pico& nbsp;	Diagenode	B01060010	cromatina sonicante (Sección 3.3)
Albúmina sérica bovina (BSA), Grado de biología molecular	Nueva Inglaterra BioLabs	B9000S	Reacción de relleno en perlas (Sección 10.2) y desnaturalización, recocido de cebadores y extensión de imprimación (Sección 14.2)
Centrífuga 5424 R	Eppendorf	5404000138	cromatina sonicante (Sección 3.5), control de la sonicación (secciones 4.3.1, 4.3.3 y 4.3.4)
Centrífuga 5804 R	Eppendorf	22623508	Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.3), Lisis celular (Sección 2.2 y 2.3), Cromatina sonicante (Sección 3.1)
Cóctel de inhibidores de proteasa completo, mini, sin EDTA	Roche	4693159001	Añadido a todos los tampones, excepto al tampón de proteinasa K y al tampón de elución ChIP
Solución de dATP New	England BioLabs	N0440S	dA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Ácido desoxicólico Sal de sodio	Fisher Scientific	BP349	Tampón de lisis 3, tampón de lavado con alto contenido de sal y tampón de lavado LiCl
Mezcla dNTP, Grado de biología molecular	Thermo Scientific	R0192	Reacción de relleno en perlas (Sección 10.2) y desnaturalización, recocido de imprimación y extensión de imprimación (Sección 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x	PCR	K1081	(sección 18.1)
EDTA, 0,5 m, solución estéril, pH 8,0	BioShop	EDT111	Tampón de lisis 1-3, control de sonicación (sección 4.1), tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado LiCl y tampón de elución ChIP
Alcohol etílico anhidro, 100%	Alcoholes comerciales	P006EAAN	control de la sonicación (sección 4.3.3)
Formaldehído, 36,5-38%, contiene 10-15% metanol	Sigma	F8775	Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.1)
Glicerol, grado reactivo, min 99.5%	BioShop	GLY002	Tampón de lisis 1
glicina, grado biotecnológico, min. 99%	BioShop	GLN001	Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.2)
Glucógeno, grado de ARN	Thermo Scientific	R0551	Sonicación de control (Sección 4.3.3)
HEPES, 1 M Solución Filtrada Estéril, pH 7.3	BioShop	HEP003	Tampón de lisis 1, tampón de lavado con alto contenido de sal
Fragmento de Klenow (3->5 exo-)	New England BioLabs	M0212S	dA-Tailing Reaction (Sección 15.1)
Lambda exonucleasa	New England BioLabs	M0262S	Digestión de Lambda Exonucleasa en Perlas (Sección 11.2)
Ligase Enhancer	New England BioLabs	E7645S	Kit de biblioteca de ADN NEBNext Ultra II. Ligadura de adaptador de índice en cuentas (Sección 9.1) y Ligadura de adaptador universal (Sección 16.1)
Ligase Master Mix	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Ligadura de adaptador de índice en perlas (Sección 9.1) y Ligadura de adaptador universal (Sección 16.1)
Cloruro de litio (LiCl), grado reactivo	Bioshop	LIT704	LiCl Tampón de lavado
Perlas magnéticas para ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (perlas magnéticas para ChIP)	Dynabeads Protein G (perlas magnéticas para ChIP)Incubación	anticuerpos con perlas (Sección 5)
Perlas magnéticas para la purificación del ADN (AMPure XP Beads)	Beckman Coulter	A63880	Extracción de ADN (Sección 13.3) y limpieza de ADN (Sección 17.1)
Bastidor magnético (Imán DynaMag-2)	Invitrogen	12321D	Se utiliza en muchos pasos en las Secciones: 5 - 11, 13
MinElute Kit de extracción de gel	Qiagen	28604	Purificación en gel de ADN amplificado por PCR (Sección 19.2)
Solución de sal sódica de N-lauroilsarcosina, solución acuosa al 30%, ≥ 97.0% (HPLC)	Sigma	61747	Tampón de lisis 3
Etoxilato de octilfenol (IGEPAL CA630)	BioShop	NON999	Tampón de lisis 1 y tampón de lavado LiCl
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico, grado biotecnológico (25:24:1)	BioShop	PHE512	Comprobación de la sonicación (Sección 4.3.1)
phi29 ADN polimerasa	Nueva Inglaterra BioLabs	M0269L	Reacción de relleno en cordones (sección 10.2) y desnaturalización, recocido de imprimación y extensión de imprimación (sección 14.3 y 14.4)
solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x	Corning	21040CV	Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.3) y cromatina sonicante (Sección 3.1), Incuación de anticuerpos con perlas (Sección 5.1)
Fuente de alimentación básica PowerPac	BioRad	1645050	control de sonicación (Sección 4.3.6) y purificación en gel de ADN amplificado LM-PCR (Sección 19.1)
Sistema de PCR ProFlex	Applied Biosystems	Sistema	de PCR ProFlexUtilizado en las secciones: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 y 18.2
Tubo LoBind de proteínas, 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Incubación de anticuerpos con perlas (Sección 5.2) e inmunoprecipitación de cromatina (Sección 6.3)
Solución de proteinasa K,	25530049	Invitrogen	Sonicación (Sección 4.2) y elución y reticulación inversa (Sección 12.3)
Qubit 4.0 Fluorímetro	Invitrogen	Q33226	Purificación en gel de ADN amplificado por PCR (Sección 19.3)
Ensayo Quibit dsDNA BR	kit Invitrogen	Q32853	Purificación en gel de ADN amplificado por PCR (Sección 19.3)
Libre de ARNASA A, Dnasa y proteasa	Thermo Scientific	EN0531	Control de sonicación (Sección 4.3.2) y extracción de ADN (Sección 13.2)
Cloruro de sodio (NaCl), Biorreactivo	Sigma	S5886	Tampón de lisis 1-3, tampón de lavado con alto contenido de sal
sulfato de dodecilo de sodio (SDS), grado de electroforesis	BioShop	SDS001	control de sonicación (sección 4.1), tampón de lavado con alto contenido de sal y tampón de elución ChIP
perlas de sonicación y tubos Bioruptor de 15 mL	Diagenode	C01020031	cromatina sonicante (sección 3.1 y 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Sección 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 y 16.2
Solución de clorhidrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 7.4	Sigma	T2194	10 mM Tampón Tris-HCl
Solución de clorhidrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 8.0	Sigma	T2694	Tampón de lisis 2, tampón de lisis 3, comprobación de la sonicación (sección 4.1), tampón de lavado LiCl y tampón de elución ChIP
Módulo de reparación final/relaves de dA Ultra II (24 rxn -> 120 rxn)	E7546S	New England BioLabs	y mezcla de enzimas de preparación final. Reparación final y reacción de cola dA en cordones (Sección 8.2)
Balancín de minitubo VWR, velocidad variable	VWR	10159-752	Se utiliza en muchos pasos en las secciones: 1, 2, 5, 6 y 7
2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol, Triton X-100, tampón	1 BioShop	TRX506	, cromatina sonicante (sección 3.4) y tampón de lavado con alto contenido de sal