Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.
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Artículo de método
Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético
En este artículo
Resumen
Resumen
Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares liberadas por prácticamente todas las células y secretadas en todos los fluidos biológicos. Se han desarrollado muchos métodos para el aislamiento de estas vesículas, incluida la ultracentrifugación, la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión por tamaño. Sin embargo, no todos son adecuados para la purificación y caracterización de exosomas a gran escala. A continuación se describe un protocolo para establecer cultivos de fibroblastos primarios aislados de músculos esqueléticos de ratones adultos, seguido de la purificación y caracterización de exosomas de los medios de cultivo de estas células. El método se basa en el uso de pasos secuenciales de centrifugación seguidos de gradientes de densidad de sacarosa. A continuación, se valida la pureza de las preparaciones exosomales mediante análisis de Western blot utilizando una batería de marcadores canónicos (es decir, Alix, CD9 y CD81). El protocolo describe cómo aislar y concentrar exosomas bioactivos para microscopía electrónica, espectrometría de masas y experimentos de captación para estudios funcionales. Puede ampliarse o reducirse fácilmente y adaptarse para el aislamiento de exosomas de diferentes tipos de células, tejidos y fluidos biológicos.
Introducción
Los exosomas son vesículas extracelulares heterogéneas que varían en tamaño de 30 a 150 nm. Se han establecido actores clave en los procesos fisiológicos y patológicos, dada su distribución ubicua en tejidos y órganos 1,2. Los exosomas transportan una carga compleja de proteínas, lípidos, tipos de ADN y tipos de ARN, que varían según el tipo de células de las que se derivan 1,2,3. Los exosomas están enriquecidos en proteínas que tienen diferentes funciones (es decir, las tetraspaninas, incluidas CD9 y CD63) son respon....
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Protocolo
Todos los procedimientos en ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos con animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del St. Jude Children's Research Hospital y las pautas de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Preparación de soluciones y medios
- Prepare la solución de digestión mezclando 15,4 ml de PBS con 2,5 ml de 20 mg/ml de colagenasa P (concentración final de 5 mg/ml), 2 ml de 11 U/ml de dispasa II (concentración final de 1,2 U/ml) y 100 μl de 1,0 M de CaCl2 (concentración final de 5 mM).
- Prepare 500 mL de medio de fibroblastos primarios (DMEM completo) mezcla....
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Resultados
Este protocolo es adecuado para la purificación de exosomas a partir de grandes volúmenes de medio acondicionado de una manera rentable. El procedimiento es altamente reproducible y consistente. La Figura 1 muestra la imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de exosomas purificados del medio de cultivo de fibroblastos primarios de ratón. La Figura 2 muestra el patrón de expresión proteica de los marcadores exosomales canónicos y la ausencia de cont.......
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Discusión
Un paso crítico para el aislamiento exitoso de los exosomas de los medios de cultivo, como se describe en este protocolo, es el establecimiento y mantenimiento adecuados de cultivos primarios de fibroblastos de ratón a partir de músculo esquelético adulto. Estos cultivos deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar condiciones similares a las fisiológicas (el nivel de O2 en el músculo esquelético es de ~2,5%)15. Los fibroblastos primarios cambiarán de características cuan.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Alessandra d'Azzo es titular de la Cátedra de Genética y Terapia Génica de Jewelers for Children (JFC). Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de los NIH R01GM104981, RO1DK095169 y CA021764, la Fundación Asís de Memphis y las Caridades Asociadas Sirio-Libanesas Estadounidenses.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Platos de 10 cm | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| platos de 15 cm | Midwest Scientific | TP93150 | |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Albúmina sérica bovina Fracción V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrífuga 5430R con rotores FA-35-6-30/ FA-45-48-11 Sistema de | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP | BioRad | 12003154 | |
| Colagenasa P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete cóctel de inhibidores de proteasa | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter con electrodos de placa | BioRad | ||
| Criterion TGX gel proteico sin tinción | BioRad | 5678034 | 10% 18 pocillos, midi-gel |
| Criterion célula de electroforesis vertical (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispasa II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | proteasa neutra, grado II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco' s Modificación Águilas Medianas | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato | Corning | 21-031-CV | |
| Etanol a prueba de 200 | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL tubos de centrífuga cónicos | Corning | 352070 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega lector de microplacas multimodo | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX suplemento | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Ácido clorhídrico | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Membranas de transferencia | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli tampón de muestra (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Solución de acetato de magnesio | Sigma | 63052-100ml | |
| Leche en polvo desnatada | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubadora | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10.000 U/ml |
| Tubos de microcentrífuga premium | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1,7 mL |
| Bisturíes desechables | protegidosFisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Tampón de funcionamiento | BioRad | 1610732 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Sistema de filtración al vacío estéril de liberación rápida-GP | Millipore S2GPU05RE | 500 mL | |
| Filtro de células estériles (70 mm) | Fisher Scientific, marca Fisher | 22-363-548 | |
| Sacarosa | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Tubos de polipropileno de pared delgada | Beckman Coulter | 326823 | |
| Tampón de transferencia | BioRad | 16110734 | |
| Ácido tricloroacético | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solución | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | Rojo sin fenol |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultracentrífuga Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Tubo ultra claro (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tubos ultratransparentes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Baño de agua Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Referencias
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H.
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Reimpresiones y permisos
