La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.
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Artículo de método
Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)
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Resumen
Resumen
El estudio de la estructura y la dinámica de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. La forma en que se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y participan en la segregación cromosómica precisa es una cuestión fundamental. Se propone que CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere, y se requiere la ubicuación CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular.
Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que la ubicuidad en una lisina diferente se induce debido al etiquetado EYFP en la proteína mutante CENP-A K124R. Se identificó con éxito la ubiquilación de lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en el ANálisis de espectrometría de masas CENP-A. Una advertencia se discute en el uso de GFP/EYFP o el etiquetado de proteína de alto peso molecular como herramienta para analizar la función de una proteína. También se discute el límite técnico actual para la detección de bandas ubiquitidas, la identificación de la ubiculación específica del sitio y la visualización de la ubicuidad en células vivas o una sola célula específica durante todo el ciclo celular.
El método de análisis de espectrometría de masas presentado aquí se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes etiquetas y otras proteínas centromere-kinetochore. Estos métodos combinatorios que consisten en varios ensayos/análisis podrían recomendarse a los investigadores que estén interesados en identificar funciones funcionales de ubiculación.
Introducción
En la mayoría de los eucariotas, los microtúbulos del husillo deben adherirse a una sola región de cada cromosoma, llamado centromere. El kinetochore es un complejo de proteínas que se encuentran en el centromere. Estudiar el momento de los movimientos de la proteína centromere y kinetochore y la estructura de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. Las preguntas clave son cómo se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y cómo participan en la segregación cromosómica precisa. En la mayoría de las especies, la presencia de un nucle....
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Protocolo
1. Cultivo celular y transfección de retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A
NOTA: EYFP-CENP-A se expresa desde pBabe-EYFP-CENP-A a un nivel de proteína similar al CENP-A endógeno. La proteína CENP-A celular total se sustituye por esta EYFP-CENP-A después de la interrupción del alelo CENP-A-/F por Cre recombinase como en las células RPE-1 CENP-A-/-6.
- Preparación del sobrenadante que contiene retrovirus utilizando células de envasado 293T.
- Día 0: Extienda las celdas de embalaje 293T en la placa de cultivo de 6 pozos (1,0 x 106 celdas/pozo). Células de cultivo en DMEM ....
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Resultados
El mutante EYFP-CENP-A K124 muestra ubiculación, interacción con HJURP y ningún defecto en la localización de centromere ni la letalidad celular. Aquí se re-constituyó el sistema reportado por Fachinetti et al. (2017)6: en células humanas diploides (RPE-1) que transportaban un interrumpido y un ''floxed'' CENP-A alelo (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A se expresó desde el vector retrovirus pBabe-EYFP. En este sistema, la expresión de CENP-A endógeno del alelo
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Discusión
Aquí describimos métodos de análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. En nuestros resultados, identificamos con éxito la ubiculación en lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A a través del análisis de espectrometría de masas. El análisis de espectrometría de masas descrito aquí es.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Chao-Jun Li en el Model Animal Research Center de la Universidad de Nanjing por el análisis de espectrometría de masas. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa y a los investigadores actuales del Model Animal Research Center, Nanjing University y Greehey Children's Cancer Research Institute por su útil discusión, orientación experimental y reactivos. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago y Dawn S. Chandler por sus generosos dones de reactivos. Y.N. con el apoyo fue apoyado por el Fondo de Constr....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equpimentos/Herramientas | |||
| 0.5 ml de tubos de baja unión a proteínas | Eppendorf | 022431064 Para análisis de espectrometría de masas | |
| Placa de cultivo celular de 10 cm | BIOFIL/JET, China | 700224 | placa de cultivo de tejidos de 10 cm (Yohei lab, PN63) |
| 6 Pocillos de cultivo celular | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | Cultivo de 6 pocillos placa |
| CentriVap | LABCONCO-Concentrador | de | vacío de sobremesa para péptidos secos al vacío para análisis de espectrometría de masas |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μ m | Eksigent Technologies | 805-00120 Columna de | cromatografía líquida (RPLC) para análisis de espectrometría de masas |
| HCX PL APO 100x lente de inmersión en aceite | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X lente de inmersión |
| aceite HCX PL APO 63x lente de inmersión en aceite | Leica LEICA | HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Lente de inmersión en aceite |
| Immobilon-FL PVDF membrana de transferencia | EMD Millipore | IPVH00010 | Para Western blot |
| Microscopio de fluorescencia motorizado Leica DM IRE2 | Microscopio de fluorescencia motorizado | Leica | |
| EL6000 Fuente de luz compacta | Leica | Fuente de luz externa para excitación fluorescente | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Modelo V16-2 Aparato de electroforesis en gel de poliacrilamida | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Aparato de electroforesis en gel I para aplicar un gel SDS-PAGE |
| nanoLC.2D | más grande Eksigent | Technologies-sistema de | cromatografía líquida para análisis de espectrometría de masas |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX Los geles de proteínas Bis-Tris 4%-12% disponibles comercialmente para el análisis | |
| de espectrometría de masasMicroscopio de barrido láser confocal Olympus FLUOVIEW FV3000 | Microscopio de barrido láser Olympus-Confocal (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ descargas/#!dlOpen=%23detail847250519) | ||
| Cámara CCD ORCA-R2 Degital | Hamamatsu | C10600-10B | Cámara CCD |
| PAP | Pen Sitio de unión | AD100.1 | Para una barrera repelente al agua en la tinción inmunofluorescente |
| TEJIDO PLACAS DE CULTIVO 10 CM | VWR | 25382-166 Placa de cultivo de | tejidos de 10 cm |
| Electroforesis vertical para funcionamiento en gel (tamaño grande) | Junyi, China | JY-SCZ6 + | Aparato de electroforesis de gel II para aplicar gel SDS-PAGE más grande (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro portaobjetos |
| Anticuerpos primarios | |||
| Anticuerpo anti-CENP-A | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Anticuerpo monoclonal de ratón |
| Anticuerpo anti-CENP-B | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Anticuerpo monoclonal de ratón |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Anticuerpo |
| policlonal de conejoanticuerpo anti-GFP | ANTI #76 (anticuerpo casero) | Anticuerpo policlonal de conejo | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat anticuerpo monoclonal |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283– 1-AP | Anticuerpo policlonal de conejo |
| anti-Ubiquitina | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Anticuerpo policlonal |
| de conejo | |||
| Ensayo de proteínas Bio-Rad Bio-Rad | 500-0006 | Reactivo de ensayo de proteínas comercial I para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS al 0,1%) | |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicador Microtip Step, sólido, roscado 9,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Bocina disruptora para sonicación |
| Branson Ultrasonics sonicador Microtip Tapered 6,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Micropunta para tampón de sonicación |
| A1 | - | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM de NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desoxicolato; 0,5% SDS; 1 mM de EDTA; reactivo inhibidor de proteasa completo sin EDTA |
| Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA | Roche | 11-873-580-001 | Reactivo inhibidor de proteasa completo sin EDTA para tampón A1 |
| Coomassie azul brillante R-250 | BBI Ciencias de la vida | CAS 6104-59-2 Solución azul de | Coomassie para análisis de espectrometría de masas |
| Solución de violeta cristalino (2,3% violeta cristalino, 0,1% oxilato de amonio, 20% etanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | Para la tinción de colonias |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | Para la tinción nuclear |
| DMEM: F12 Medio | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medio |
| Suero fetal bovino, certificado, calor inactivado, de origen estadounidense | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (suero fetal bovino) |
| DMEM con alto contenido de glucosa (Dulbecco' Águila modificada' s medio) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | DMEM de alta glucosa |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Reactivo de transfección I para transfección química |
| Lipofectamin 3000, solución P3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Reactivo de transfección II para transfección química |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fijación Leche |
| en polvo descremada (sustituto aprobado de la leche en polvo de clavel) | Fisher Scientific NC9255871 | (Pedido Nº 190915; Lote # 90629) | Leche descremada descremada |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Medio sérico reducido |
| p-fenilendiamina | SIGMA-SLDRICH | P6001 | Para el medio de montaje |
| Penicilina, estreptomicina; Líquido | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicilina-estreptomicina |
| Poli-L-lisina SOLUCIÓN | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lisina, 0,1% p/v, en agua |
| Polietileneimina [PEI]; 1,0 mg/ml | Polysciences | 23966– 2 | Reactivo de transfección III para la transfección química |
| Férulas de proteína A sefarosa CL-4B | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Proteínas A perlas de sefarosa CL-4B para ensayos de ubiquitilación in vivo utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore tampón de decapado de Western Blot | Thermo Scientific | PI21059 | tampón de decapado de Western Blot I |
| Tripsina de grado de secuenciación | Promega | V5111 | Para el análisis de espectrometría de masas |
| SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad | Thermo | 34095 | Sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) ultrasensible |
| Agua destilada ultrapura | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Agua estéril de grado de cultivo de tejidos |
| Tampón de decapante Western Blot II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoetanol) | - | - | Tampón de eliminación de Western Blot II |
| fuerte>Anticuerpos secundarios | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus-Sofware | C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ descargas/#!dlOpen=%23detail847250519) | |
| Análisis FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ descargas/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus-Sofware | C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) | |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences-Software | D | |
| Generador de imágenes moleculares Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | Generador de imágenes de quimioluminiscencia para la detección de inmunoblot |
| Odyssey CLx Sistema de imágenes infrarrojas | LI-COR Biosciences-Sistema | de imágenes infrarrojas para la detección de inmunoblot | |
| OpenCFU saftware | - | - | Para el recuento de colonias (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab versión 5.5.2. Software de imagen científica | Improvision/PerkinElmer-Software | A | |
| ProteinPilot Software versión 4.5 | AB SCIEX-Software | F para el análisis de espectrometría de masas | |
| Cantidad Un software de análisis 1-D | Bio-Rad-Software | E | |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX-Instrumento | ||
| de espectrometría de masasVolocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Volocity Acquisition) | PerkinElmer-Software | B1 | |
| Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Cuantificación de volocity) | PerkinElmer-Software | B2 |
Referencias
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell<....
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Reimpresiones y permisos
