Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Resumen

Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Resumen

El correcto plegamiento y ensamblaje de proteínas y complejos proteicos es esencial para la función celular. Las células emplean vías de control de calidad que corrigen, secuestran o eliminan las proteínas dañadas para mantener un proteoma saludable, asegurando así la proteostasis celular y previniendo un mayor daño proteico. Debido a las funciones redundantes dentro de la red de proteostasis, la detección de fenotipos detectables mediante el derribo o mutaciones en genes que codifican chaperonas en el organismo multicelular Caenorhabditis elegans da como resultado la detección de fenotipos menores o nulos en la mayoría de los casos. Hemos desarrollado una estrategia de detección dirigida para identificar las chaperonas necesarias para una función específica y, por lo tanto, cerrar la brecha entre el fenotipo y la función. Específicamente, monitoreamos las nuevas interacciones de chaperonas utilizando pantallas de interacción sintética de ARNi, derribando la expresión de chaperonas, una chaperona a la vez, en animales portadores de una mutación en un gen que codifica chaperona o sobreexpresando una chaperona de interés. Al interrumpir dos chaperonas que individualmente no presentan fenotipo grueso, podemos identificar chaperonas que agravan o exponen un fenotipo específico cuando ambas perturban. Demostramos que este enfoque puede identificar conjuntos específicos de chaperonas que funcionan juntas para modular el plegamiento de una proteína o complejos de proteínas asociados con un fenotipo dado.

Introducción

Las células hacen frente al daño de las proteínas mediante el empleo de maquinarias de control de calidad que reparan, secuestran o eliminan cualquier proteína dañada^1,2. El plegamiento y el ensamblaje de complejos de proteínas están respaldados por chaperonas moleculares, un grupo diverso de proteínas altamente conservadas que pueden reparar o secuestrar proteínas dañadas^3,4,5,6,7. La eliminación de proteínas dañadas está mediada por el sistema ubi....

Protocolo

1. Preparación de placas de medios de crecimiento de nematodos para RNAi

1. A una botella de 1 L, agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptona, 17 g de agar y agua destilada hasta 1 L y autoclave.
2. Enfríe la botella a 55 °C.
3. Añadir 25 mL de 1 M KH₂PO₄, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, y 1 mL de solución de colesterol (Tabla 1) para hacer nematodos medios de crecimiento (NGM).
4. Añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 0,5 ml de 1 M de IPTG (Tabla 1) para hacer la solución de NGM-ARNi.
   NOTA: La bacteria E. coli HT115 (DE3) de uso común ....

Resultados

Uso de mutaciones sensibles a la temperatura en UNC-45 para detectar interacciones agravantes o de alivio en condiciones permisivas o restrictivas, respectivamente
El ensamblaje y mantenimiento muscular ofrece un sistema eficaz para estudiar las interacciones de chaperonas específicas del tejido. La unidad funcional de los músculos contráctiles, el sarcómero, presenta una disposición cristalina de proteínas estructurales y reguladoras. La estabilidad de la proteína motora miosina y su incorporación en.......

Discusión

Sigue faltando una imagen integrada de la red de proteostasis que refleje cómo está organizada y funciona en diferentes células y tejidos metazoarios. Para abordar esta deficiencia, se requiere información específica sobre las interacciones de varios componentes de esta red, como las chaperonas moleculares, en tejidos específicos durante el curso del desarrollo y el envejecimiento. Aquí, mostramos cómo el uso de perturbaciones específicas del tejido nos permitió examinar la red de chaperonas en un tejido dado. Para explo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de 12 pocillos	SPL	BA3D16B
placas de 40 mm	Greiner Bio-one	627160
Placas de 60 mm	Greiner Bio-one	628102
placas de 6 pocillos	Thermo Scientific	140675
96 pocillos 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicilina	Formedium	69-52-3
azul de bromofenol	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Cámara	Qimaging	q30548
Colesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filtro (0.22 y micro; m)	Sigma	SCGPUO2RE
Microscopio estereoscópico fluorescente	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Regalo del laboratorio Morimoto
Myosin MHC A (Myo-3) anticuerpo	hibridoma	5-6
Na2HPO4· 7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptona	Merck	61930705001730
Bomba de vertido de placas	Integra	lo hace p920
RNAi Biblioteca de chaperonas	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß- mercaptoetanol	Bio world	41300000-1
microscopio estereoscópico	Leica	MZ6
Tetraciclina	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500

Banco de