Fabricación de guías de onda de modo cero para microscopía de molécula única de alta concentración

Resumen

Aquí se describe un método de litografía de la nanoesfera para la fabricación paralela de guías de onda de modo cero, que son matrices de nanoaperturas en un cubrebocas de microscopía de vidrio revestido de metal para imágenes de una sola molécula en concentraciones nano a micromolar de fluoróforos. El método aprovecha el autoensamblaje de cristal coloidal para crear una plantilla de guía de onda.

Resumen

En la enzimología de fluorescencia de molécula única, la fluorescencia de fondo de sustratos etiquetados en solución a menudo limita la concentración de fluoróforos a rangos pico- a nanomolares, varios órdenes de magnitud menos que muchas concentraciones fisiológicas de ligandos. Las nanoestructuras ópticas llamadas guías de onda de modo cero (ZMWs), que son aperturas de 100−200 nm de diámetro fabricadas en un metal conductor delgado como el aluminio o el oro, permiten obtener imágenes de moléculas individuales a concentraciones micromolares de fluoróforos al limitar la excitación de la luz visible a volúmenes efectivos de zeptolitros. Sin embargo, la necesidad de equipos de nanofabricación costosos y especializados ha impedido el uso generalizado de ZMWs. Por lo general, las nanoestructuras como ZMWs se obtienen por escritura directa utilizando litografía de haz de electrones, que es secuencial y lenta. Aquí, la litografía coloidal o nanoesfera se utiliza como una estrategia alternativa para crear máscaras a escala nanométrica para la fabricación de guías de onda. Este informe describe el enfoque en detalle, con consideraciones prácticas para cada fase. El método permite que miles de ZMWs de aluminio u oro se hagan en paralelo, con diámetros de guía de onda finales y profundidades de 100−200 nm. Solo se requiere un equipo de laboratorio común y un evaporador térmico para la deposición de metales. Al hacer que los ZMWs sean más accesibles para la comunidad bioquímica, este método puede facilitar el estudio de los procesos moleculares a concentraciones y tasas celulares.

Introducción

Las técnicas de molécula única como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) o la espectroscopia de correlación de fluorescencia de molécula única (FCS) son herramientas poderosas para la biofísica molecular, permitiendo el estudio de movimientos dinámicos, conformaciones e interacciones de biomoléculas individuales en procesos como la transcripción^1,2,3,traducción^4,5,6,y muchos otros^7. Para smFRET, la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es un método común porque muchas moléculas atados pueden seguirse con el tiempo, y la onda evanescente generada por TIR se limita a una región de 100−200 nm adyacente a la cubierta^8. Sin embargo, incluso con esta restricción en el volumen de excitación, los fluoróforos de interés todavía necesitan ser diluidos a rangos de pM o nM para detectar señales de una sola molécula por encima de la fluorecencia de fondo⁹. Dado que las constantes de Michaelis-Menten de las enzimas celulares están típicamente en el rango de μM a mM^10,las reacciones bioquímicas en los estudios de moléculas individuales suelen ser mucho más lentas que las de la célula. Por ejemplo, la síntesis de proteínas ocurre a 15−20 aminoácidos por segundo en E. coli^11,12,mientras que la mayoría de los ribosomas procariotas en experimentos smFRET se traducen a 0,1−1 aminoácidos por segundo^13. En la síntesis de proteínas, las estructuras cristalinas y smFRET en ribosomas estancados mostraron que los ARN de transferencia (ARNt) fluctúan entre los estados 'híbrido' y 'clásico' antes de la etapa de translocación de ARNt-ARNm^14,15. Sin embargo, cuando las concentraciones fisiológicas del factor de translocación GTPasa, EF-G, estuvo presente, se observó una conformación diferente, intermedia entre los estados híbrido y clásico, en smFRET^6. El estudio de procesos moleculares dinámicos a tasas y concentraciones similares a las de la célula es importante, pero sigue siendo un desafío técnico.

Una estrategia para aumentar la concentración de sustrato fluorescente es el uso de aperturas de longitud de onda sub-visibles basadas en metal, llamadas guías de onda de modo cero (ZMWs), para generar campos de excitación confinados que excitan selectivamente las biomoléculas localizadas dentro de las aperturas¹⁶ (Figura 1). Las aperturas son típicamente 100−200 nm de diámetro y 100−150 nm de profundidad^17. Por encima de una longitud de onda de corte relacionada con el tamaño y la forma de los pozos (λ_c ≈ 2,3 veces el diámetro para las guías de onda circulares con agua como el medio dieléctrico^18),no se permiten modos de propagación en la guía de onda, de ahí el término guías de onda de modo cero. Sin embargo, un campo electromagnético oscilante, denominado onda evanescente, que decae exponencialmente en intensidad todavía hace túneles a corta distancia en la guía de onda^18,19. Aunque son similares a las ondas evanescentes TIR, las ondas evanescentes ZMW tienen una constante de decaimiento más corta, lo que resulta en una región de excitación efectiva de 10−30 nm dentro de la guía de onda. En las concentraciones micromolares de ligands fluorescente etiquetados, solamente una o algunas moléculas están simultáneamente presentes dentro de la región de la excitación. Esta restricción del volumen de excitación y la consiguiente reducción de la fluorescencia de fondo permite la obtención de imágenes de fluorescencia de moléculas individuales a concentraciones biológicamente relevantes. Esto se ha aplicado a muchos sistemas^20,incluyendo mediciones fcs de difusión de proteína única^21,mediciones fret de molécula única de ligando de baja^{afinidad-proteína 22} e interacciones proteína-proteína^23,y mediciones espectro-electroquímicas de eventos de recambio molecular único^24.

Los ZMWs se han producido modelando directamente una capa metálica utilizando fresado de haz de iones^25,26 o litografía de haz de electrones (EBL) seguida de grabado por plasma^16,27. Estos métodos de litografía sin máscara crean guías de onda en serie y normalmente requieren acceso a instalaciones especializadas de nanofabricación, lo que impide la adopción generalizada de la tecnología ZMW. Otro método, la litografía ultravioleta nanoimprint lift-off²⁸, utiliza un molde de deslizamiento de cuarzo para presionar una plantilla ZMW inversa sobre una película de resistencia como un sello. Si bien este método es más simplificado, todavía requiere EBL para la fabricación del molde de cuarzo. Este artículo presenta el protocolo para un método de fabricación con plantilla simple y económico que no requiere EBL o fresado de haz de iones y se basa en el cierre de embalaje de nanoesferas para formar una máscara litográfica.

La nanoesfera o litografía "natural", que fue propuesta por primera vez en 1982 por Deckman y Dunsmuir^29,30,utiliza el autoensamblaje de partículas coloidales monodisperse, que van desde decenas de nanómetros hasta decenas de micrómetros^31,para crear plantillas para el modelado de superficies a través de grabado y / o deposición de materiales. Las matrices periódicas extendidas bidimensionales (2D) o tridimensionales (3D) de partículas coloidales, denominadas cristales coloidales, se caracterizan por una iridiscencia brillante de dispersión y difracción³². Aunque se utiliza menos que el haz de electrones o la fotolitografía, esta metodología de enmascaramiento es simple, de bajo costo y se reduce fácilmente para crear tamaños de entidad por debajo de 100 nm.

Dirigir el autoensamblaje de partículas coloidales determina el éxito del uso de cristales coloidales como máscaras para el modelado de superficies. Si el tamaño y la forma de las partículas son homogéneos, las partículas coloidales pueden autoensamblarse fácilmente con empaquetamiento hexagonal, impulsado por el agotamiento entrómico³³. La evaporación del agua después del recubrimiento de gota es una ruta efectiva para sedimentar las partículas coloidales, aunque otros métodos incluyen el recubrimiento por inmersión^34,el recubrimiento de espín^35,la deposición electroforética³⁶y la consolidación en una interfaz aire-agua^37. El protocolo que se presenta a continuación se basa en el método de sedimentación por evaporación, que fue el más sencillo de implementar. Los intertices triangulares entre perlas de poliestireno empaquetadas de cerca forman aberturas en las que platear un metal de sacrificio, formando postes (Figura 2 y Figura suplementaria 1). El breve recocido de las cuentas antes de este paso ajusta la forma y el diámetro de estos postes. Se retiran las cuentas, se deposita una capa de metal final alrededor de los postes y luego se retiran los postes. Después de que los dos pasos de deposición de metal en la nanomáscara coloidal, la eliminación de los postes intermedios, y la modificación de la química de la superficie para la pasivación y el atado, matrices ZMW están listas para su uso para la obtención de imágenes de una sola molécula. Una caracterización más extensa de las propiedades ópticas de ZMW después de la fabricación se puede encontrar en un artículo^{adjunto 38.} Además de un evaporador térmico para la deposición de vapor de los metales, no se requieren herramientas especializadas.

Protocolo

NOTA: Todos los pasos se pueden completar en el espacio de laboratorio general.

1. Limpieza de cubrebocas de vidrio

1. Para proporcionar una superficie limpia para la deposición evaporativa de partículas coloidales, coloque 24 x 30 mm de tapas de vidrio de borosilicato óptico (0,16−0,19 mm de espesor) dentro de las inserciones acanaladas de un frasco de tinción de vidrio coplin para su limpieza.
   NOTA: Asegúrese de que las tapas estén erguidas y bien separadas para que todas las superficies estén claramente expuestas durante el proceso de limpieza.
2. Vierta suficiente acetona en el frasco de tinción para cubrir las cubiertas, coloque la cubierta y sonice durante 10 minutos a 40 ° C.
3. Vierta la acetona y enjuague las tapas llenando el frasco de tinción con H₂O destilado y vertiendo el agua. Repita 2 veces más.
4. Repita la sonicación de acetona (pasos 1.2 y 1.3) una vez más.
5. Vierta suficiente KOH de 200 mM en el frasco para cubrir los cubrebocas y sonicar, cubierto, durante 20 minutos a 40 ° C.
   NOTA: El KOH graba ligeramente el vidrio.
6. Enjuague los cubrebocas con H₂O destilado 6 veces.
7. Agregue etanol para cubrir las cubiertas, agregue la tapa y sonice durante 10 minutos a 40 ° C.
8. Enjuague los cubrebocas con H₂O 3 veces destilado.
9. Recoja cada cubrebocas en el borde usando pórceps suaves y seque las cubiertas con gas N_2. Toque sólo los bordes de la cubierta. Coloque cada uno de los cubrebocas secos y limpios en una placa de Petri limpia individual.

2. Deposición evaporativa de perlas de poliestireno

1. Para crear la máscara de cristal coloidal para la matriz ZMW, centrífuga 50 μL de 1 μm de diámetro, perlas de poliestireno no funcionalizadas (2,5% p/v en agua) a 15.000 x g,25 °C durante 5 min.
   NOTA: Antes de pipetear las perlas, la solución común debe ser brevemente vórtice en caso de que las cuentas se hayan asentado en el fondo de la botella.
2. Deseche el sobrenadante, dejando la menor agua restante posible.
   NOTA: El agua residual puede cambiar las propiedades de evaporación de la resuspensión de etanol^39,por lo que la eliminación de una pequeña cantidad de perlas para eliminar toda el agua es aceptable.
3. Resuspend las cuentas del paso 2.2 en 50 μL de 1:400 TritonX-100:solvente de etanol. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar a fondo las cuentas con el disolvente.
   NOTA: TritonX-100: el disolvente de etanol debe sellado con película de parafina después de su uso y prepararse fresco una vez al mes. Las cuentas tienden a adherirse a los lados de un recipiente de plástico, como un tubo de microcentrífuga, por lo que la pipeta a lo largo de los lados para asegurarse de que todas las cuentas se resuspended.
4. Para configurar una cámara de humedad para la deposición, coloque 6 placas de Petri, cada una con un cubrebocas, en un banco en una línea con tapas ligeramente entreabiertas. En cada plato, mueva el cubrebocas a la región abierta para que los cubrebocas se expongan al ambiente cuando la humedad aumente en el siguiente paso.
5. Coloque un higrómetro y un pequeño ventilador eléctrico centrado detrás de las placas de Petri.
6. Registre la humedad relativa inicial (RH) en el laboratorio. Llene un beaker de 200 mL con 150−200 mL de agua de ~75 °C y colóquelo detrás del ventilador.
7. Encienda el ventilador y cubra las placas de Petri, el ventilador, el casto y el higrómetro con un recipiente de almacenamiento de plástico transparente y volcado (66 cm x 46 cm x 38 cm).
8. Deje que el DERECHO en la cámara se eleve a 70−75%, lo que típicamente toma 5−10 min.
   NOTA: Si el RH del laboratorio ambiental es bajo (por debajo de ~ 50%), deje que la cámara alcance un RH más alto, pero no superior al 80%, para compensar la pérdida de humedad durante la deposición (ver más abajo).
9. Cuando el RH alcance el 70−75%, registre el RH y levante ligeramente el recipiente de almacenamiento de plástico para colocar rápidamente las cubiertas en las placas de Petri, lo que evita la humectación excesiva de los cubrebocas.
   NOTA: La temperatura en la cámara será ligeramente más cálida que la temperatura ambiente, típicamente 25−26 °C, como resultado de la humidificación. Si la humedad es visible en las cubiertaslipos, entonces las superficies de vidrio están demasiado húmedas. Una guantera comercial podría simplificar esta parte del protocolo.
10. Que el RH en la cámara siga subiendo hasta el 85%. En ese momento, registre el RH en la cámara de humedad y la pipeta 5 μL de la suspensión de perlas en el centro de cada cubrebocas.
11. Cierre la cámara y las placas de Petri después de cada deposición para minimizar la pérdida de humedad. Trate de terminar las 6 deposiciones dentro de 2 min.
12. Registre el RH en la cámara después de la deposición.
    NOTA: El RH después de la deposición ayudará a medir la rapidez con la que se perdió la humedad durante la deposición, lo que depende de las condiciones ambientales del laboratorio. Para una ejecución típicamente exitosa, la cámara comenzará en 85% HR antes de la deposición y terminará en 70−75% RH después de la deposición.
13. Deje que las gotas de cuentas se extiendan y se sequen durante 5 min.
    NOTA: Si los cristales coloidales tienen muchos agujeros o regiones de varias capas, entonces la cámara era probablemente demasiado húmeda o seca, respectivamente. Ajuste la humedad relativa a la que cerrar las placas de Petri y comience las deposiciones (consulte la sección de resultados para obtener más información sobre la optimización).

3. Recocido de cuentas para reducir el tamaño de los poros en la plantilla de cristal coloidal

1. Para proporcionar una superficie de temperatura uniforme para el recocido de las perlas de poliestireno, que estrecha los intercondidos de las inter-perlas y redondea las esquinas de los interstices, coloque una placa de aluminio plana y fresada en la parte superior de una placa caliente de cerámica estándar.
2. Ajuste la temperatura de la placa caliente a 107 °C, la temperatura de transición vítrea de poliestireno⁴⁰.
   NOTA: Para obtener una temperatura estable y precisa, se mantuvo una sonda de termopar en un agujero de 2−3 mm de ancho y 4−5 mm de profundidad en la placa de aluminio.
3. Coloque un cubrebocas que contenga la plantilla de perlas en la placa de aluminio caliente y el recocido durante 20 s (consulte la sección de discusión para obtener una explicación del tiempo de fusión).
4. Después de calentar, retire el cubrebocas de la placa de aluminio y colócalo rápidamente en otra superficie de aluminio a temperatura ambiente para enfriarlo.
   NOTA: Es útil hacer que las cubiertas cuelguen ligeramente sobre el borde de la placa o fresar canales poco profundos (ver el video que lo acompaña) en la placa para facilitar la recogida de las cubiertas.

4. Nanofabricación de guías de onda de modo cero de aluminio utilizando la plantilla de cristal coloidal

1. Usando la deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 300 nm de cobre a 2 Å/s sobre la plantilla de cristal coloidal para generar postes en los interstices entre las perlas.
2. Retire el exceso de metal en la parte superior de las cuentas presionando suavemente la superficie con cinta adhesiva. Pelar lentamente la cinta para sacar el metal.
   NOTA: Algunos pequeños parches de exceso de metal reflectante pueden permanecer después de la extracción de la cinta, y estos a menudo pueden ser eliminados por una corriente de gas N_2. Si quedan parches sustanciales de exceso de metal reflectante después de la extracción de la cinta, intente remojar las plantillas en tolueno durante 2 h para disolver parcialmente las perlas de poliestireno. Lavar las tapas con agua destilada, secar con_N2, y repetir la cinta tire. El remojo adicional no debe disolver completamente las cuentas, ya que las cuentas ayudan a proteger los postes de daños durante la extracción de la cinta.
3. Para disolver las cuentas de poliestireno, coloque las plantillas de cuentas en tolueno y remoje durante la noche.
   PRECAUCIÓN: Los humos de tolueno pueden ser tóxicos. Trabaje con tolueno bajo una capucha bien ventilada y use equipo de protección personal, incluidos guantes, anteojos de seguridad y una bata de laboratorio. El tolueno debe almacenarse en armarios ventilados designados para líquidos inflamables.
4. Después de la incubación de tolueno, enjuague las plantillas una vez con cloroformo y dos veces con etanol. Maneje los cubrebocas con cuidado en este punto porque los delicados postes de metal de 200-300 nm de altura ahora están expuestos. Seque las plantillas con N2 y elimine el_polímero residual y los contaminantes en un limpiador de plasma de oxígeno durante 30 min.
   PRECAUCIÓN: Los humos de cloroformo pueden ser tóxicos. Trabaje con cloroformo bajo una capucha bien ventilada y use equipo de protección personal, incluidos guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. El cloroformo debe almacenarse en armarios ventilados lejos de otros disolventes inflamables.
5. Usando deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 3 nm de una capa de adhesión de titanio a 1 Å/s seguida de 100−150 nm de aluminio a 4 Å/s alrededor y encima de los postes de cobre.
   NOTA: Uno puede usar un revestimiento más grueso para obtener guías más profundas y una mejor atenuación de la fluorescencia de fondo, pero esto también disminuye el rendimiento después de exponer y disolver los postes en el siguiente paso (consulte la sección de discusión).
6. Para disolver los postes metálicos, remoje las cubiertas en grabador de cobre (a base de ácido cítrico; Tabla de Materiales) para 2 h.
   PRECAUCIÓN: El grabador de metal puede causar quemaduras en la piel. Trabaje con grabados bajo una capucha bien ventilada y use equipo de protección. Lávese bien las manos después de manipular. El grabador metálico debe almacenarse en armarios ventilados designados para líquidos corrosivos.
7. Enjuague los cubrebocas con agua destilada, seque con N_2,y enjuague suavemente la superficie del revestimiento metálico con papel de lente para exponer cualquier poste que todavía esté cubierto de revestimiento. Coloque las tapas de nuevo en grabador de cobre durante otras 2 h, luego enjuague de nuevo con agua destilada y seque con_N2.
   NOTA: Las diapositivas ZMW deben almacenarse en placas de Petri cubiertas y limpias para mantenerlas libres de contaminantes.

5. Nanofabricación de guías de onda de modo cero de oro utilizando la plantilla de cristal coloidal

NOTA: El método para fabricar ZMWs de oro(Figura suplementaria 1),que refleja el protocolo para fabricar ZMWs de aluminio, se proporciona en esta sección.

1. Utilizando la deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 3 nm de una capa de adhesión de titanio a 1 Å/s seguida de 300 nm de aluminio a 4 Å/s.
2. Retire el exceso de metal en la parte superior de las cuentas presionando suavemente la superficie con cinta adhesiva. Pelar lentamente la cinta para sacar el metal.
3. Para disolver las cuentas de poliestireno, coloque las plantillas de cuentas en tolueno y remoje durante la noche.
4. Después de la incubación de tolueno, enjuague las plantillas una vez con cloroformo y dos veces con etanol. Seque las plantillas con_N2 y elimine los contaminantes poliméricos residuales en un limpiador de plasma de oxígeno durante 30 min.
5. Utilizando la deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 100−150 nm de oro a 5 Å/s alrededor y encima de los postes de aluminio.
6. Para disolver los postes metálicos, remoje las cubiertas en grabador de aluminio (a base de ácido fosfórico; Tabla de Materiales) para 1 h.
7. Enjuague los cubrebocas con agua destilada, seque con N_2,y enjuague suavemente la superficie del revestimiento metálico con papel de lente para exponer cualquier poste que todavía esté cubierto de revestimiento. Coloque las tapas de nuevo en grabador de aluminio durante 1 h, luego enjuague de nuevo con agua destilada y seque con N_2.
   NOTA: Las diapositivas ZMW deben almacenarse en placas de Petri cubiertas y limpias.

Resultados

El autoensamblaje de las partículas coloidales de poliestireno a través de la sedimentación evaporativa (pasos 2.1−2.13) puede producir una gama de resultados ya que requiere el control de la tasa de evaporación del disolvente. Sin embargo, debido a que las deposiciones son rápidas (10−15 min por ronda), el procedimiento se puede optimizar rápidamente para diferentes condiciones ambientales de laboratorio. La Figura 3A muestra una plantilla coloidal bien formada después de la deposición y la...

Discusión

Para el autoensamblaje coloidal (sección de protocolo 2), el uso de etanol en lugar de agua como disolvente de suspensión acelera el proceso de evaporación para que las plantillas estén listas en 2−3 min después de la deposición en lugar de 1−2 h como en los métodos anteriores^48,49. El protocolo de sedimentación evaporativa presentado aquí también es más simple que los protocolos de sedimentación anteriores que requieren controlar la inclinación de la superficie,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1. Limpiador de cubreobjetos de vidrio
acetona	Sigma	32201	1 L
Tarro de tinción de vidrio Coplin	Fisher Scientific	08-817	Tarro de tinción con 8 ranuras y tapa de vidrio moldeado
Cubreobjetos	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Etanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Placas de Petri de hidróxido de potasio
	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm de diámetro, 15 mm de profundidad
Sonicator	Branson	Z245143	Limpiador ultrasónico de sobremesa, 5510
2. Deposición evaporativa de perlas de poliestireno
Contenedor de almacenamiento transparente	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 pulg.
Ventilador de escritorio	O2Cool	FD05001A	Cualquier ventilador de escritorio pequeño (~5 pulgadas) funcionará
Vaso de precipitados de vidrio	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Medidor de humedad	Fisher Scientific	11-661-19
Tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Microesferas de poliestireno	Polysciences	18602-15	1.00 y micro; m de diámetro, no funcionalizado
Triton X-100 deturgente	Sigma	X100	100 mL
3. Recocido de cordones para reducir el tamaño de los poros en el cristal coloidal PlantillaPlaca de
aluminio	Fisher Scientific	AA11062RY	Personalizada internamente a 14 cm x 14 cm
Placa calefactora de cerámica	Fisher Scientific HP88857100		13 x 8,2 x 3,8 pulg.
Controlador de temperatura	McMaster-Carr	38615K71	Lectura de temperatura con sonda de termopar
Sonda de termopar	McMaster-Carr	9251T93	Tipo K, sonda
de superficie4/5. Nanofabricación de guías de onda de modo cero utilizando la plantilla de cristal coloidal
aluminio	fuerte Transene	tipo A
Pellets de aluminio	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	Para la evaporación por haz de electrones
Cloroformo	Sigma 288306		1 L
Grabador de cobre	Transene	49-1
Pellets de cobre	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	Para la evaporación por haz de electrones
Pellets de oro	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	Para la evaporación por haz de electrones
Papel para lentes	Thorlabs	MC-5
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Grapas de	cinta adhesiva	MMM119
Sistema de deposición de película delgada	Kurt J. Lesker	PVD-75	El sistema de evaporación térmica de mesa también funcionará
Pellets de titanio	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	Para la evaporación por haz de electrones
Tolueno	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Divisor espectral de doble vista	Photometrics, Inc.