Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

Resumen

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Resumen

Las células madre esqueléticas periósticas (P-SSC) son esenciales para el mantenimiento y la reparación ósea de por vida, lo que las convierte en un foco ideal para el desarrollo de terapias para mejorar la curación de fracturas.  Las células periósticas migran rápidamente a una lesión para suministrar nuevos condrocitos y osteoblastos para la curación de fracturas. Tradicionalmente, la eficacia de una citoquina para inducir la migración celular solo se ha llevado a cabo in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño. Con los avances en la microscopía intravital utilizando excitación multifotónica, recientemente se descubrió que 1) las P-SSC expresan el gen migratorio CCR5 y 2) el tratamiento con el ligando CCR5 conocido como CCL5 mejora la cicatrización de fracturas y la migración de P-SSCs en respuesta a CCL5. Estos resultados han sido capturados en tiempo real. Aquí se describe un protocolo para visualizar la migración de P-SSC desde el nicho de células madre esqueléticas (SSC) de sutura calvarial hacia una lesión después del tratamiento con CCL5. El protocolo detalla la construcción de una sujeción del ratón y un soporte de imágenes, la preparación quirúrgica de la calvaria del ratón, la inducción de un defecto de la calvaria y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.

Introducción

La reparación de fracturas es un proceso dinámico y multicelular que es distinto del desarrollo y la remodelación del esqueleto embrionario. Durante este proceso, la inducción de señales de lesión del tejido dañado es seguida por el rápido reclutamiento, proliferación y posterior diferenciación de las células madre/progenitoras esqueléticas, que son críticas para la estabilidad general y la fijación de las ^fracturas1. En particular, las primeras etapas de la cicatrización de la fractura requieren la formación de callos blandos, que se atribuye principalmente a las células residentes del periostio2. Cuando los huesos se l....

Protocolo

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine.

1. Preparación del ratón

1. Cruce los ratones ^Mx1-Cre17 y Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)¹⁸ (comprados en el Laboratorio Jackson) con ratones αSMA-GFP (proporcionados aquí por los doctores Ivo Kalajzic y Henry Kronenberg) para generar ratones reporteros Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato+α SMA-GFP

Resultados

Se ha propuesto que los progenitores esqueléticos tienen potencial migratorio o ^{circulatorio20}. Recientemente, se generaron ratones reporteros Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato+α SMA-GFP⁺ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), en los que los P-SSC están marcados por el etiquetado dual Mx1⁺α SMA⁺ (Figura 2A,B). La migración sustancial de Mx1⁺α .......

Discusión

Durante la cicatrización ósea, las células periósticas son la principal fuente de condrocitos y osteoblastos recién diferenciados dentro de un callo ^lesionado3. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6. La evaluación de las características funcionales endógenas de P-SSC es técnicamente un desafío. A menudo, la dinámica migratoria de la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
y frac12; ” poste óptico	ThorLabs	TR2	Para montaje de imagen
jeringa de 1 mL	BD	309659
aguja de 27G	BD PercisionGlide	305111
jeringa de insulina de 29G	McKesson	102-SN05C905P
tubo de conicol de 50 mL	Falcon	352098	Para la sujeción del ratón
Placa de ángulo ajustable	Renishaw	R-PCA-5023-50-20	Para montaje de imágenes
Toallitas con alcohol Coviden		6818
Betadine quirúrgica	Henry Schen	67618-151-16
Buprenorfina SR-LAB	ZooPharm		1 mg/mL Combo de liberación sostenida
III	Obtenido del veterinario del personal	N/A	37,6 mg/mL Ketamina; 1,9 mg/mL Xilacina; 0,37 mg/mL Acepronazina
Cobertor	Fisher	12-545-87	24 x 40 premium superslip
Boquilla fina FST		11254-20
Ketamina	KetaVed	50989-161-06	100 mg/mL
Leica TCS SP8MP con DM6000CFS	Leica Microsystems	N/A
Matrigel	R & D Systems	344500101
Cinta médica	McKesson 100199		3" x 10 yardas (7,6 cm x 9,1 m)
Metocelulosa	Microscopía Electrónica Ciencias	19560
Tijeras de microdisección	FST	1456-12
Etapa motorizada	Anaheim automatización	N/A
Portaagujas	FST	12500-12
Suturas no absorbibles	McKesson	S913BX	monofilamento nylon 5-0 suturas no absorbibles con aguja de corte inverso C-1 adjunta
Pomada oftálmica	Rugby	0536-1086-91
RANTES	Biolegend	594202	10 µ g/50 y micro; L
Abrazadera de ángulo recto para ½ ” poste, 3/16" Hexagonal	ThorLabs	RA90	Para montaje de imágenes
Accionado por resorte de 3/16" Bloqueo hexagonal y frac14; ” tornillo de mariposa	ThorLabs	TS25H	Para montaje de imágenes
Bastoncillos de algodón estériles	Henry Schen	100-9249
DPBS estériles (1x)	Corning	21-030-CV
Paños estériles	McKessen	25-517
	McKessen	3158VA
Pomada antibiótica triple	Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.	51672-2120-2
Vacutainer set de extracción de sangre	BD	REF 367298	25G set de infusión de agujas de mariposa con tubo de 12"

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