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Artículo de método

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

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DOI:

10.3791/61162

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16 de septiembre de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Center for Skeletal Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Resumen

Las células madre esqueléticas periósticas (P-SSC) son esenciales para el mantenimiento y la reparación ósea de por vida, lo que las convierte en un foco ideal para el desarrollo de terapias para mejorar la curación de fracturas.  Las células periósticas migran rápidamente a una lesión para suministrar nuevos condrocitos y osteoblastos para la curación de fracturas. Tradicionalmente, la eficacia de una citoquina para inducir la migración celular solo se ha llevado a cabo in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño. Con los avances en la microscopía intravital utilizando excitación multifotónica, recientemente se descubrió que 1) las P-SSC expresan el gen migratorio CCR5 y 2) el tratamiento con el ligando CCR5 conocido como CCL5 mejora la cicatrización de fracturas y la migración de P-SSCs en respuesta a CCL5. Estos resultados han sido capturados en tiempo real. Aquí se describe un protocolo para visualizar la migración de P-SSC desde el nicho de células madre esqueléticas (SSC) de sutura calvarial hacia una lesión después del tratamiento con CCL5. El protocolo detalla la construcción de una sujeción del ratón y un soporte de imágenes, la preparación quirúrgica de la calvaria del ratón, la inducción de un defecto de la calvaria y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.

Introducción

La reparación de fracturas es un proceso dinámico y multicelular que es distinto del desarrollo y la remodelación del esqueleto embrionario. Durante este proceso, la inducción de señales de lesión del tejido dañado es seguida por el rápido reclutamiento, proliferación y posterior diferenciación de las células madre/progenitoras esqueléticas, que son críticas para la estabilidad general y la fijación de las fracturas1. En particular, las primeras etapas de la cicatrización de la fractura requieren la formación de callos blandos, que se atribuye principalmente a las células residentes del periostio2. Cuando los huesos se lesionan, un subconjunto de células periósticas responden rápidamente y contribuyen a los intermedios de cartílago y osteoblastos recién diferenciados dentro del callo3, lo que implica la presencia de una población distinta de células madre/progenitoras esqueléticas dentro del periostio. Por lo tanto, la identificación y caracterización funcional de las células madre esqueléticas residentes en el periostio (CSS) constituyen un enfoque terapéutico prometedor para las enfermedades óseas degenerativas y los defectos óseos4.

Se cree que las SSC residen en múltiples ubicaciones de tejidos, incluida la médula ósea. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6.  Estas SSCs periósticas (P-SSCs) se pueden etiquetar con marcadores de linaje mesenquimal temprano (es decir, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 y Axin2-CreER8) durante el desarrollo óseo fetal4,7,8,9,10. Una limitación significativa de estos modelos de rastreo de linaje genético único es que existe una heterogeneidad sustancial dentro de las poblaciones celulares marcadas. Además, no pueden distinguir las CSS etiquetadas de su progenie in vivo. Para abordar esta limitación, recientemente desarrollamos un ratón reportero dual (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) para visualizar claramente las P-SSCs de las SSCs de médula ósea (BM-SSCs)11. Con este modelo, se ha determinado que las P-SSC están marcadas por el etiquetado dual Mx1+αSMA+, mientras que las células Mx1+ más diferenciadas residen en la médula ósea, las superficies endodesteal y perióstica, y los huesos corticales y trabeculares11,12.

Se sabe que múltiples citoquinas y factores de crecimiento regulan la remodelación y reparación ósea y han sido probados para la mejora de la reparación esquelética en defectos críticos del segmento1,13. Sin embargo, debido a la complejidad celular de los modelos de lesión generados a través de la interrupción de la barrera física del compartimento óseo, los efectos directos de estas moléculas sobre la migración endógena de P-SSC y la activación durante la curación no están claros. Las características funcionales y la dinámica migratoria de las CSS a menudo se evalúan in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño, en combinación con citoquinas o factores de crecimiento que se sabe que inducen la migración en otras poblaciones celulares. Por lo tanto, la interpretación de los resultados de estos experimentos in vitro para su aplicación en sus correspondientes sistemas in vivo es un desafío. Actualmente, la evaluación in vivo de la migración de células madre/progenitoras esqueléticas no se observa típicamente en tiempo real; más bien, se mide en puntos de tiempo fijos después de la fractura5,7,14,15,16.

Una limitación de este método es que la migración no se evalúa a nivel de una sola célula; más bien, se mide a través de cambios en las poblaciones celulares. Debido a los recientes avances en la microscopía intravital de animales vivos y la generación de ratones reporteros adicionales, ahora es posible el seguimiento in vivo de células individuales. Utilizando microscopía intravital de animales vivos, observamos la migración distinta de P-SSCs desde el nicho de sutura de calvaria a una lesión ósea dentro de las 24-48 h posteriores a la lesión en ratones Mx1 / Tomate / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 se identificó recientemente como un mecanismo regulador que influye en el reclutamiento y la activación de P-SSCs durante la respuesta temprana a la lesión. Curiosamente, no hubo detección de una migración sustancial de P-SSC en respuesta a una lesión en tiempo real. Sin embargo, el tratamiento de una lesión con CCL5 produce una migración robusta y direccionalmente distinta de P-SSC, que se puede capturar en tiempo real. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar una metodología detallada para registrar la migración in vivo de P-SSC en tiempo real después del tratamiento con CCL5.

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Protocolo

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine.

1. Preparación del ratón

  1. Cruce los ratones Mx1-Cre17 y Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (comprados en el Laboratorio Jackson) con ratones αSMA-GFP (proporcionados aquí por los doctores Ivo Kalajzic y Henry Kronenberg) para generar ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Figura 2A).
  2. Para la inducción de Mx1-Cre, inyecte a los ratones 25 mg/kg de pIpC cada dos días durante 10 días.
  3. Irradiar ratones con 9,5 Gy 1 día antes del trasplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de médula ósea entera de ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT-BMT)19.
  4. Después de 6 a 8 semanas de recuperación, someta a los ratones a las imágenes in vivo del protocolo de migración de células periósticas que se describen a continuación.
    NOTA: La irradiación y el WT-BMT de ratones Mx1-Cre son necesarios para eliminar endógenamente las células hematopoyéticas marcadas con Mx1 que pueden responder a una lesión. De seis a ocho semanas después de la irradiación, el recuento de células hematopoyéticas del huésped está en <5% y, por lo tanto, listo para la obtención de imágenes19.

2. Sujeción del ratón y montaje de imágenes

  1. Cree una sujeción del ratón con un tubo cónico de 50 ml (Figura 1A).
    1. Usando tijeras puntiagudas, haga un agujero a través de la parte inferior de la cónica. Corte desde el orificio inferior hasta la parte superior de la cónica (el lado cortado será la parte superior de la sujeción).
    2. Haga un corte de aproximadamente 4-5 cm de largo paralelo al corte anterior y hasta la mitad (~ 2 cm) de la parte superior de la sujeción. Quitar esta sección de la cónica y lisar los bordes eran necesarios.
  2. Construya un soporte de imagen de tubo cónico utilizando una placa de ángulo ajustable, un poste óptico de 0.5" y una abrazadera de ángulo recto para el poste de 0.5" Hex de 0.1875" (Figura 1B y Tabla de Materiales).
    1. Ajuste la placa angular a un ángulo de 35°. En el lado izquierdo de la placa angular, atornille el poste óptico en el segundo orificio desde la parte posterior de la placa.
    2. En el lado derecho de la placa ajustable, inserte un tornillo de pulgar de 0.25" con bloqueo hexagonal de 0.1875" cargado por resorte en el segundo orificio desde el frente y el último orificio de la placa. La abrazadera de ángulo recto se utilizará con el poste óptico para asegurar la sujeción cónica del ratón en su lugar.

3. Procedimiento quirúrgico preoperatorio

  1. Anestesia de ratón
    1. Para el manejo del dolor, inyecte subcutáneamente al ratón buprenorfina de liberación sostenida (1 mg/kg de peso corporal) 30-60 minutos antes de la cirugía.
    2. Anestesiar ratones utilizando anestesia combinada de CCM de roedor III (combo III) que contiene 37,5 mg/ml de ketamina, 1,9 mg/ml de xilazina y 0,37 mg/ml de acepromazina. La dosis adecuada para ratones es de 0,75 a 1,50 ml por 1 kg de peso corporal. La dosis durará de 30 a 45 minutos.
    3. Una vez que el ratón esté anestesiado, aplique ungüento oftálmico en los ojos con un hisopo de algodón estéril para prevenir la deshidratación ocular.
    4. Para imágenes a largo plazo (>45 min), administre anestesia nuevamente para mantener la profundidad anestésica adecuada de la siguiente manera.
      1. Prepare una jeringa de 1 ml con una cantidad suficiente de combo III para mantener la anestesia durante la duración planificada de la imagen (0,75 ml/kg de peso corporal por 30 minutos de sedación adicional). Conecte un juego de infusión de aguja de mariposa de 25 G con tubo de 12"a la jeringa y empuje el anestésico a través del tubo y la aguja.
      2. Inserte la aguja de mariposa por vía intraperitoneal y, a continuación, coloque la aguja con cinta adhesiva en su lugar.
        NOTA: Así es como se administrará el combo III adicional durante la toma de imágenes, de modo que no haya necesidad de mover al animal o interrumpir el plano de visión.
    5. Proporcione soporte térmico con una almohadilla térmica mantenida a 37 ° C durante todo el procedimiento. Para imágenes prolongadas (>1 hora) será necesario un soporte adicional de líquido.  Se pueden proporcionar líquidos suplementarios I.P. con Combo III adicional durante la toma de imágenes o 33 ml / kg de solución salina (0.9 NaCl) por vía subcutánea.
  2. Sujeción del ratón y preparación del sitio quirúrgico
    1. Use cortapelos para eliminar la mayor cantidad de vello posible de la parte superior de la cabeza. Aplique crema depilatoria en el área afeitada para eliminar el vello restante en el sitio quirúrgico.
    2. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado por la falta de respuesta a los pellizcos de los dedos de los pies. Después de 15 min, si el ratón no está completamente anestesiado, administre una segunda dosis más pequeña de combo III (<0,75 ml/kg de peso corporal).
    3. Coloque el ratón en la cola de sujeción primero, deslizándolo lo suficientemente hacia atrás como para que la nariz cuelgue ligeramente sobre el borde de la cónica.
    4. Pega las patas delanteras con cinta adhesiva a la parte inferior del tubo cónico con cinta médica.
    5. Coloque el tubo cónico con el ratón en un soporte de imagen que se ajuste en un ángulo de 35 ° y se asegure con la abrazadera de ángulo recto (Figura 1C).
    6. Una vez que el ratón esté seguro en el soporte de imágenes, limpie el sitio quirúrgico 3 veces con exfoliantes alternos de exfoliante de betadina y alcohol isopropílico al 70%. Nuevamente, verifique que el animal esté completamente sedado.
    7. Mueva el ratón a una almohadilla absorbente limpia y coloque una cortina sobre el ratón para crear un gran campo estéril.

4. Procedimiento quirúrgico

  1. Incisión de apertura
    1. Usando pinzas de punta fina, recoja la piel inmediatamente medial hasta la oreja derecha. Con tijeras de microdisección, corte la piel sujeta por las pinzas.
      NOTA: Iniciar la incisión utilizando el método descrito anteriormente crea una incisión redondeada que es más adecuada para suturar después del procedimiento.
    2. Haga una incisión transversal a partir de la incisión inicial hacia el oído izquierdo (<1 cm).  Haga otra incisión, a partir de la incisión inicial, hacia la nariz del animal (~ 2-3 mm más allá del ojo derecho).
    3. Separe la piel del periostio usando las pinzas y las tijeras para cortar suavemente el tejido conectivo que separa la piel del calvario periostio.
    4. Usando un hisopo de algodón estéril, aplique un poco de ungüento oftálmico en la parte superior del colgajo de la piel.  Tome suavemente el colgajo de la piel y dóblelo sobre el ojo izquierdo. La intersección de las suturas sagital y coronal debe estar claramente expuesta (Figura 1E).
      NOTA: El ungüento oftálmico se usa para mantener el colgajo de la piel en su lugar.
    5. Enjuague la superficie abierta con PBS estéril para limpiar el área de cualquier sangre y cabello residual.
      NOTA: Si es necesario, use pinzas de punta fina para eliminar los pelos que quedan después del enrojecimiento, pero tenga cuidado de no dañar el periostio.
  2. Microfractura
    1. Para generar microfracturas en la calvaria, retire el émbolo de una jeringa de insulina de 29 G y corte el extremo posterior de la jeringa, alrededor de las marcas de 300-400 uL.
      NOTA: Este paso hace que sea más fácil maniobrar bajo un endoscopio de disección al producir la lesión.
    2. Coloque la punta de un bisel (uno o dos anchos de aguja) hacia la nariz desde la sutura coronal y uno o dos anchos de aguja a la derecha de la sutura sagital (Figura 1E).
    3. Gire suavemente la jeringa en el sentido de las agujas del reloj, luego en sentido contrario a las agujas del reloj varias veces.
      NOTA: En ratones jóvenes, se necesita una cantidad muy pequeña de presión hacia abajo para crear una microfractura circular. Tenga cuidado de no dejar que la aguja penetre en el cerebro, ya que esto causará sangrado e interferirá con las imágenes.
    4. Use una aguja de 27 G para ensanchar la microfractura a ~ 0.4 mm. Si quedan fragmentos de hueso en la microfractura, enjuague el área con PBS. Si los fragmentos de hueso aún permanecen en la microfractura, use la aguja de 29 G para sacarlos suavemente.
    5. Repita los pasos 4.2.1–4.2.4 para crear una lesión en el lado izquierdo de la sutura sagital.
      NOTA: En este punto, hay dos opciones: 1) proceder inmediatamente al tratamiento con CCL5 (sección 4.3) y a la obtención de imágenes (sección 5); o 2) cerrar el sitio quirúrgico después de los procedimientos postoperatorios de la sección 6. A las 24 h posteriores, anestesiar de nuevo al ratón, reabrir la vista quirúrgica, tratar la lesión con CCL5 (sección 4.3) y realizar imágenes intravitales (sección 5) y cuidados postoperatorios (sección 6).
  3. Tratamiento CCL5
    1. A partir de un stock de RANTES (100 ng/mL), hacer una solución de 10 ng/mL utilizando la matriz de membrana basal (Tabla de Materiales). Mantenga esta solución en hielo para mantener la matriz en forma líquida.
    2. Trate cada lesión con 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) utilizando una pipeta de 2-20 μL (esta punta de pipeta tiene un diámetro mayor, que es más efectivo cuando se usa un líquido viscoso). Permita que la matriz se solidifique.
    3. Una vez que la matriz se haya solidificado, cubra suavemente la calvaria con el colgajo de la piel para asegurarse de que el tejido no se deshidrate. Incubar durante 1 h antes de la toma de imágenes.

5. Imágenes intravitales

  1. Ajustes del microscopio
    1. Encienda el láser multifotón (láser de titanio-zafiro de femtosegundo). Ajuste la longitud de onda a 880 nm y ajuste la potencia para obtener imágenes de segunda generación armónica (SHG) (440 nm) del hueso.
    2. Encienda los láseres de estado sólido de 488 nm y 561 nm para la excitación de las células que expresan GFP y tdTomato, respectivamente.
    3. Encienda los detectores PMT (tubo fotomultiplicador) para señales de segunda generación armónica (detección de 405–455 nm) y GFP (detección de 505–550 nm). Encienda el detector HyD 3 para la señal de tomate (detección de 590–620 nm).
  2. Montura
    1. Antes de mover el ratón al endoscopio, compruebe el plano visual de la calvaria presionando suavemente la parte posterior de la cabeza del ratón. Si el plano no está nivelado, ajuste la posición girando suavemente la sujeción del ratón hacia la izquierda o la derecha.
      NOTA: Este es un paso crítico para garantizar una calidad de imagen suficiente.
    2. Aplique metilcelulosa estéril al 2% en agua (p/v) para cubrir toda la calvaria y el colgajo de la piel y evitar el secado del tejido.
    3. Coloque el ratón en la etapa de microscopio motorizado del eje XYZ (Figura 1G). Usando la luz epifluorescente, alinee el ratón de modo que 1) esté mirando hacia el microscopio y 2) la intersección de las suturas coronal y sagital sea el punto de referencia centrado de la etapa.
    4. Coloque la cubierta de vidrio en el área de imágenes y verifique la alineación (Figura 1H).
  3. Imágenes de lapso de tiempo
    1. Use una lente de bajo aumento (objetivo de inmersión en agua 25x con NA = 0.95) para escanear la calvaria. Adquirir una imagen de referencia de la intersección de sutura sagital y coronal.
    2. Utilizando las señales SHG y fluorescentes de las células, localice cada vista de lesión y registre las coordenadas XYZ, así como las distancias de las suturas sagital y coronal (Figura 2B).
    3. Elija una ubicación en las suturas coronales o sagitales para obtener imágenes a largo plazo. Tome una imagen detallada de la pila Z de esta área de referencia durante la toma de imágenes.
      NOTA: Dado que las suturas representan un nicho conocido de P-SSC, aquí es donde las células migrarán en respuesta a la lesión de la calvaria.
    4. Utilice la configuración del software de lapso de tiempo para grabar una imagen cada 1 minuto durante al menos 1 h. En el tiempo transcurrido entre instantáneas, compare el campo de visión actual con el campo de visión inicial. Si son diferentes, utilice la imagen de la pila Z para determinar en qué dirección debe ajustarse el campo de visión.

6. Cuidado postoperatorio de animales

  1. Después de la toma de imágenes, enjuague la calvaria expuesta con PBS estéril para eliminar la metilcelulosa.
  2. Para cerrar la incisión, coloque suavemente el colgajo de piel sobre la calvaria. Use hisopos de algodón estériles para eliminar el ungüento oftálmico residual y secar el sitio de la incisión.
  3. Usando suturas no absorbibles de nylon monofilamento de tamaño 5-0 con una aguja de corte inversa C-1 adjunta, cierre el sitio quirúrgico. Use un hisopo de algodón estéril para aplicar ungüento antibiótico triple a la incisión cerrada.
    NOTA: La cicatrización se reduce con técnicas de sutura de alta calidad y sangrado mínimo.
  4. Coloque el ratón en una jaula limpia sobre una superficie cálida y verifique cada 15 minutos hasta que se logre la reclinación esternal.
  5. Administrar una segunda dosis de buprenorfina de liberación sostenida 72 h después de la cirugía.
  6. Controle diariamente el comportamiento de acurrucamiento, el pelaje con volantes y / o la falta de deambulación hasta que se retiren las suturas (~ 1 semana).

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Resultados

Se ha propuesto que los progenitores esqueléticos tienen potencial migratorio o circulatorio20. Recientemente, se generaron ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), en los que los P-SSC están marcados por el etiquetado dual Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migración sustancial de Mx1+α ...

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Discusión

Durante la cicatrización ósea, las células periósticas son la principal fuente de condrocitos y osteoblastos recién diferenciados dentro de un callo lesionado3. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6. La evaluación de las características funcionales endógenas de P-SSC es técnicamente un desafío. A menudo, la dinámica migratoria de la...

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Divulgaciones

L.C.O. y D.P. divulgan una patente pendiente titulada "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Los autores restantes no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Bone Disease Program of Texas Award, el Caroline Wiess Law Fund Award y el NIAMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P.  Agradecemos a M.E. Dickinson y T.J. Vadakkan en el BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core y bcM Advanced Technology Cores con fondos de NIH (AI036211, CA125123 y DK056338).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
y frac12; ” poste ópticoThorLabsTR2Para montaje de imagen
jeringa de 1 mLBD309659
aguja de 27GBD PercisionGlide305111
jeringa de insulina de 29GMcKesson102-SN05C905P
tubo de conicol de 50 mLFalcon352098Para la sujeción del ratón
Placa de ángulo ajustableRenishawR-PCA-5023-50-20Para montaje de imágenes
Toallitas con alcohol Coviden6818
Betadine quirúrgicaHenry Schen67618-151-16
Buprenorfina SR-LABZooPharm1 mg/mL Combo de liberación sostenida
IIIObtenido del veterinario del personalN/A37,6 mg/mL Ketamina; 1,9 mg/mL Xilacina; 0,37 mg/mL Acepronazina
CobertorFisher12-545-8724 x 40 premium superslip
Boquilla fina FST11254-20
KetaminaKetaVed50989-161-06100 mg/mL
Leica TCS SP8MP con DM6000CFSLeica MicrosystemsN/A
MatrigelR & D Systems344500101
Cinta médicaMcKesson 1001993" x 10 yardas (7,6 cm x 9,1 m)
MetocelulosaMicroscopía Electrónica Ciencias19560
Tijeras de microdisecciónFST1456-12
Etapa motorizadaAnaheim automatizaciónN/A
PortaagujasFST12500-12
Suturas no absorbiblesMcKessonS913BXmonofilamento nylon 5-0 suturas no absorbibles con aguja de corte inverso C-1 adjunta
Pomada oftálmicaRugby0536-1086-91
RANTESBiolegend59420210 µ g/50 y micro; L
Abrazadera de ángulo recto para ½ ” poste, 3/16" HexagonalThorLabsRA90Para montaje de imágenes
Accionado por resorte de 3/16" Bloqueo hexagonal y frac14; ” tornillo de mariposaThorLabsTS25HPara montaje de imágenes
Bastoncillos de algodón estérilesHenry Schen100-9249
DPBS estériles (1x)Corning21-030-CV
Paños estérilesMcKessen25-517
McKessen3158VA
Pomada antibiótica tripleTaro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Vacutainer set de extracción de sangreBDREF 36729825G set de infusión de agujas de mariposa con tubo de 12"
Guantes quirúrgicos

Referencias

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
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Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Tratamiento con la quimiocina CCL5microscop a intravitalmodelo de defecto de calvariaim genes de lapso de tiemporatones reporteros Mx1 Tomato Alpha SMA GFPexcitaci n multifot nicaseguimiento de la migraci n celularcuraci n de fracturas seassitio de lesi n por sutura
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