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Artículo de método

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

1.9K vistas

DOI:

10.3791/61162

16 de septiembre de 2020

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Resumen

Las células madre esqueléticas periósticas (P-SSC) son esenciales para el mantenimiento y la reparación ósea de por vida, lo que las convierte en un foco ideal para el desarrollo de terapias para mejorar la curación de fracturas.  Las células periósticas migran rápidamente a una lesión para suministrar nuevos condrocitos y osteoblastos para la curación de fracturas. Tradicionalmente, la eficacia de una citoquina para inducir la migración celular solo se ha llevado a cabo in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño. Con los avances en la microscopía intravital utilizando excitación multifotónica, recientemente se descubrió que 1) las P-SSC expresan el gen migratorio CCR5 y 2) el tratamiento con el ligando CCR5 conocido como CCL5 mejora la cicatrización de fracturas y la migración de P-SSCs en respuesta a CCL5. Estos resultados han sido capturados en tiempo real. Aquí se describe un protocolo para visualizar la migración de P-SSC desde el nicho de células madre esqueléticas (SSC) de sutura calvarial hacia una lesión después del tratamiento con CCL5. El protocolo detalla la construcción de una sujeción del ratón y un soporte de imágenes, la preparación quirúrgica de la calvaria del ratón, la inducción de un defecto de la calvaria y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.

Introducción

La reparación de fracturas es un proceso dinámico y multicelular que es distinto del desarrollo y la remodelación del esqueleto embrionario. Durante este proceso, la inducción de señales de lesión del tejido dañado es seguida por el rápido reclutamiento, proliferación y posterior diferenciación de las células madre/progenitoras esqueléticas, que son críticas para la estabilidad general y la fijación de las fracturas1. En particular, las primeras etapas de la cicatrización de la fractura requieren la formación de callos blandos, que se atribuye principalmente a las células residentes del periostio2. Cuando los huesos se l....

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Protocolo

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine.

1. Preparación del ratón

  1. Cruce los ratones Mx1-Cre17 y Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (comprados en el Laboratorio Jackson) con ratones αSMA-GFP (proporcionados aquí por los doctores Ivo Kalajzic y Henry Kronenberg) para generar ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-TomatoSMA-GFP

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Resultados

Se ha propuesto que los progenitores esqueléticos tienen potencial migratorio o circulatorio20. Recientemente, se generaron ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), en los que los P-SSC están marcados por el etiquetado dual Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migración sustancial de Mx1+α .......

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Discusión

Durante la cicatrización ósea, las células periósticas son la principal fuente de condrocitos y osteoblastos recién diferenciados dentro de un callo lesionado3. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6. La evaluación de las características funcionales endógenas de P-SSC es técnicamente un desafío. A menudo, la dinámica migratoria de la.......

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Divulgaciones

L.C.O. y D.P. divulgan una patente pendiente titulada "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Los autores restantes no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Bone Disease Program of Texas Award, el Caroline Wiess Law Fund Award y el NIAMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P.  Agradecemos a M.E. Dickinson y T.J. Vadakkan en el BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core y bcM Advanced Technology Cores con fondos de NIH (AI036211, CA125123 y DK056338).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
y frac12; ” poste ópticoThorLabsTR2Para montaje de imagen
jeringa de 1 mLBD309659
aguja de 27GBD PercisionGlide305111
jeringa de insulina de 29GMcKesson102-SN05C905P
tubo de conicol de 50 mLFalcon352098Para la sujeción del ratón
Placa de ángulo ajustableRenishawR-PCA-5023-50-20Para montaje de imágenes
Toallitas con alcohol Coviden6818
Betadine quirúrgicaHenry Schen67618-151-16
Buprenorfina SR-LABZooPharm1 mg/mL Combo de liberación sostenida
IIIObtenido del veterinario del personalN/A37,6 mg/mL Ketamina; 1,9 mg/mL Xilacina; 0,37 mg/mL Acepronazina
CobertorFisher12-545-8724 x 40 premium superslip
Boquilla fina FST11254-20
KetaminaKetaVed50989-161-06100 mg/mL
Leica TCS SP8MP con DM6000CFSLeica MicrosystemsN/A
MatrigelR & D Systems344500101
Cinta médicaMcKesson 1001993" x 10 yardas (7,6 cm x 9,1 m)
MetocelulosaMicroscopía Electrónica Ciencias19560
Tijeras de microdisecciónFST1456-12
Etapa motorizadaAnaheim automatizaciónN/A
PortaagujasFST12500-12
Suturas no absorbiblesMcKessonS913BXmonofilamento nylon 5-0 suturas no absorbibles con aguja de corte inverso C-1 adjunta
Pomada oftálmicaRugby0536-1086-91
RANTESBiolegend59420210 µ g/50 y micro; L
Abrazadera de ángulo recto para ½ ” poste, 3/16" HexagonalThorLabsRA90Para montaje de imágenes
Accionado por resorte de 3/16" Bloqueo hexagonal y frac14; ” tornillo de mariposaThorLabsTS25HPara montaje de imágenes
Bastoncillos de algodón estérilesHenry Schen100-9249
DPBS estériles (1x)Corning21-030-CV
Paños estérilesMcKessen25-517
McKessen3158VA
Pomada antibiótica tripleTaro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Vacutainer set de extracción de sangreBDREF 36729825G set de infusión de agujas de mariposa con tubo de 12"
Guantes quirúrgicos

Referencias

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. ....

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Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Tratamiento con la quimiocina CCL5microscop a intravitalmodelo de defecto de calvariaim genes de lapso de tiemporatones reporteros Mx1 Tomato Alpha SMA GFPexcitaci n multifot nicaseguimiento de la migraci n celularcuraci n de fracturas seassitio de lesi n por sutura