Aquí se describe un protocolo para estudiar cómo el extracto de humo de cigarrillo afecta la colonización bacteriana en las células epiteliales pulmonares.
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Artículo de método
Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares
En este artículo
Resumen
Resumen
El tabaquismo es la principal causa etiológica para el enfisema pulmonar y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Fumar cigarrillos también promueve la susceptibilidad a las infecciones bacterianas en el sistema respiratorio. Sin embargo, los efectos del tabaquismo en infecciones bacterianas en células epiteliales pulmonares humanas aún no se han estudiado a fondo. Aquí se describe un protocolo detallado para la preparación de extractos para fumar cigarrillos (CSE), tratamiento de células epiteliales pulmonares humanas con EEB, y la determinación de infecciones bacterianas e infecciones. CSE se preparó con un método convencional. Las células epiteliales pulmonares fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células tratadas con CSE fueron, entonces, infectadas con Pseudomonas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las cargas bacterianas de las células fueron determinadas por tres métodos diferentes. Los resultados mostraron que la EEB aumentó la carga de Pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este protocolo, por lo tanto, proporciona un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.
Introducción
El tabaquismo afecta la salud pública de millones de personas en todo el mundo. Muchas enfermedades notorias, incluyendo el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se han notificado relacionadas con el tabaquismo1,2. Fumar cigarrillos aumenta la susceptibilidad a las infecciones microbianas agudas en el sistema respiratorio3,4,5. Además, la creciente evidencia demuestra que fumar cigarrillos mejora la patogénesis de muchos trastornos crónicos6,,
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Protocolo
1. Preparación 100% CSE
- Dibuje 10 ml de medios de cultivo celulares libres de suero (DMEM/F12 para células BEAS-2B; medio basal de células epiteliales de las vías respiratorias para células HSAEC) en una jeringa de 60 ml.
- Fi reversely attach an appropriately trimmed 1 mL pipette tip to the nozzle of the syringe as an adapter to hold the cigarette (3R4F).
- Retire el filtro del cigarrillo. Coloque un cigarrillo en el adaptador de punta y peina el cigarrillo.
- Dibuje 40 ml de aire que contenga humo en 10 ml de medios libres de suero. Mezclar el humo con el medio agitando vigorosamente (30 s por dibujo).
- Repita el paso 1.4 a....
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Resultados
Un diagrama se utiliza para ilustrar el protocolo en la figura 1. Las células EPIteliales pulmonares BEAS-2B fueron tratadas con CSE y desafiadas con Pseudomonas. Pseudomonas en el medio de cultivo fueron asesinados por la gentamicina añadida y las células fueron sometidas al ensayo de placa de caída, la detección RT-qPCR de Pseudomonas ribosoma 16S ARN, y la citometría de flujo. En comparación con el control, el tratamiento con EEB aumentó sustancialmente la infec.......
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Discusión
La invasión bacteriana en células epiteliales pulmonares es un paso crucial en la patogénesis de las infecciones bacterianas. El proceso de invasión bacteriana en las células se puede dividir en los tres pasos siguientes: En primer lugar, las bacterias entran en contacto y se adhieren a la superficie de la célula epitelial utilizando su flagelo. En segundo lugar, las bacterias se someten a interiorización o penetran en la membrana celular. Finalmente, las bacterias replican y colonizan las células si escapan con éxito de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud R01 HL125435 y HL142997 (a CZ).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de 50 ml | BD Biosciences | ||
| ATCC | PCS-300-030 | ||
| Agitador de bacterias | ThermoFisher Scientific | ||
| kit de crecimiento de células epiteliales bronquiales | ATCC | PCS-300-040 | |
| Contador de células | Bio-Rad | ||
| CFX96 Sistema | de PCR en tiempo realBio-Rad | ||
| KIT de ARN a ADN de alta capacidad | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medio | ATCC ATCC | 30-2004 | |
| células BEAS-2B humanas | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas primarias humanas | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| Citómetro de flujo LSRII | BD Biosciences | ||
| Microscopio confocal Nikkon | Nikkon | ||
| OD Imprimaciones | científicas | ||
| PCR | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Cigarrillos de grado de investigación (3R4F) | Universidad de Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Inserto | Corning Costar | ||
| Caldo de soja tríptico | BD Biosciences |
Referencias
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P.
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Reimpresiones y permisos
