Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canales de iones hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados de proteínas, para monitorear y diseccionar los fundamentos celulares y moleculares de las enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Modelar enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad en Caenorhabditis elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
La lucha contra las patologías neurodegenerativas humanas y la gestión de su impacto socioeconómico generalizado se está convirtiendo en una prioridad mundial. A pesar de sus efectos perjudiciales sobre la calidad de vida humana y el sistema sanitario, la mayoría de los trastornos neurodegenerativos humanos siguen siendo incurables y no prevenibles. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas contra tales enfermedades se está convirtiendo en una urgencia apremiante. El deterioro y la función neuronales asociados a la edad se conserva evolutivamente en organismos tan diversos como el humilde gusano Caenorhabditis elegans y los seres humanos, lo que significa similitudes en los mecanismos celulares y moleculares subyacentes. C. elegans es un modelo genético altamente maleable, que ofrece un sistema nervioso bien caracterizado, transparencia corporal y un diverso repertorio de técnicas genéticas y de imagen para evaluar la actividad neuronal y el control de calidad durante el envejecimiento. Aquí, introducimos y describimos metodologías que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canal de iones hiperactivado (por ejemplo, deg-3(d) y mec-4(d)) y agregado de proteínas (por ejemplo, neurotoxicidad inducida por é-syunclein y poli-glutamato), para monitorear y diseccionar los elementos celulares moleculares y discretos de la descomposición celular y relacionada con la edad. Una combinación de estos modelos de neurodegeneración animal, junto con las pantallas genéticas y farmacológicas para los moduladores de muerte celular conducirá a una comprensión sin precedentes de la descomposición de la función neuronal relacionada con la edad y proporcionará conocimientos críticos con amplia relevancia para la salud humana y la calidad de vida.
Introducción
Durante las últimas dos décadas, C. elegans ha sido ampliamente utilizado como un organismo modelo para investigar los mecanismos moleculares de la muerte celular necrótica. C. elegans ofrece un sistema nervioso excepcionalmente bien caracterizado y mapeado, una estructura corporal transparente y un diverso repertorio de métodos genéticos y de imagen para monitorear la función celular in vivo y la supervivencia durante todo el envejecimiento. Por lo tanto, varios modelos genéticos de C. elegans de neurodegeneración ya han sido desarrollados para evaluar la viabilidad neuronal. En particular, los modelos de nematodos bien descritos y usados incluyen la necrosis inducida por el canal deioneshiperactivos 1 ,2,3 y la muerte celular desencadenada por el aumento de la agregación de proteínas4,5,6,7,8,9,10 y la carrera de calor11,12, entre otros.,
La exposición a corto plazo a temperaturas sub letales confirió resistencia a la muerte de células necróticas, provocada por una posterior tensión térmica tanto en nematodos como en neuronas de mamíferos11. Curiosamente, el preacondicionamiento diario de nematodos a una temperatura elevada suave protege contra la neurodegeneración, que es infligida por diversos estímulos, tales como desequilibrio iónico (por ejemplo, mec-4(u231) y/o deg-3(u662)) y la agregación de proteínas (por ejemplo, sinucleína y poliQ40)11,13.
Aquí, describimos metodologías versátiles utilizando C. elegans para monitorear y evaluar la neurodegeneración dependiente de la edad en modelos bien establecidos de enfermedades humanas, como la muerte celular desencadenada por excitotoxicidad, el Parkinson y la enfermedad de Huntington. Además, subrayamos el papel neuroprotector del preacondicionamiento térmico en varios modelos de neurodegeneración. Una combinación de estas técnicas junto con pantallas genéticas y/o farmacológicas dará lugar a la identificación y caracterización de nuevos moduladores de muerte celular, con potencial interés terapéutico.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Células necróticas inducidas por canales iónicos hiperactivos
NOTA: Las mutaciones de ganancia de función en la familia genética de degenerinas, incluyendo mec-4 y deg-3 entre otros, dan como resultado la generación de canales de iones hiperactivos que desencadenan la muerte de células necróticas de seis neuronas receptoras táctiles necesarias para la mecanosensación en gusanos3. La necrosis inducida por la estimulación aberrante de degenerinas muestra varias similitudes mecanicistas y morfológicas con la excitotoxicidad en mamíferos. El mantenimiento del metabolismo energético y la homeostasis de calcio tiene un papel crucial en la supervivencia neuronal durante la necrosis11. Las siguientes cepas se pueden utilizar para monitorear la muerte de células necróticas desencadenadas por canales de iones hiperactivos, mec-4(u231)X y deg-3(u662)V.
- Mantenimiento, sincronización y preparación de gusanos mutantes para el examen de la muerte de células necróticas
- Día 1: Escoja larvas L4 de nematodos mutantes mec-4(u231) o deg-3(u662) en los medios de crecimiento de nematodos (NGM; Tabla 1) placas sembradas con Escherichia coli (OP50) usando un estereomicroscopio diseccionador.
- Colocar 10 nematodos L4 por placa NGM sembrada y cultivarlos a la temperatura estándar de 20 oC.
- Día 5: Lavar las placas con 1 ml de tampón M9(Tabla 1) y recoger los animales en un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 10.000 g durante 30 s y retire el sobrenadante.
- Añadir 0,5 ml de solución de blanqueo (7 ml de H2O, 1 ml de 5 N NaOH y 2 ml de lejía).
NOTA: La solución de blanqueo pierde gradualmente su eficiencia; por lo tanto, debe prepararse diariamente. - Vórtice y monitoree periódicamente hasta que los gusanos se hayan disuelto.
NOTA: Evite el blanqueo durante períodos superiores a 5 minutos porque la viabilidad de los embriones se verá afectada. - Centrifugar a 10.000 g durante 30 s y retire el sobrenadante.
- Lavar dos veces el pellet (huevos) con 1 ml de tampón M9.
- Después de lavar, resuspender los huevos en 200 l de tampón M9 e incubarlos durante 25 minutos a 34 oC en un baño de agua.
- Mantener un grupo separado de muestra de control (huevos) a 20 oC.
- Pipetear 100 l de huevos de control o de calor tratados con choque y colocarlos en placas NGM no sesgados. Cada plato contiene al menos 100-200 huevos.
- Incubar los huevos a 20oC hasta la eclosión.
- Montaje de larvas L1 para el examen utilizando contraste de interferencia diferencial (DIC; Nomarsky) microscopía
- Prepare almohadillas de agarosa del 2%.
- Utilice 1 ml de tampón M9 para lavar las placas y recoger nematodos larvanos L1 en tubos de 1,5 ml.
- Centrífuga a 10.000 g para 30 s.
- Retire el sobrenadante y conserve el pellet (nematodos).
- Añadir 100 l de 20 mM de tampón M9/levamisole para anestesiar los nematodos.
NOTA: Evite el azida sódica como anestésico. El azida sódica desencadena daño mitocondrial y estrés oxidativo que conduce eventualmente a la inducción de la muerte celular - Pipetear 10 l de tampón M9/levamisole que contenga gusanos L1 y montarlos en almohadillas de agarosa del 2% (Tabla 1).
- Coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la muestra.
NOTA: Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para preservar la humedad durante todo el proceso de toma de imágenes. - Observe los gusanos utilizando contraste de interferencia diferencial (DIC; Nomarsky).
- Puntuar la neurodegeneración de las seis neuronas receptoras táctiles mediante el recuento de las células con la apariencia vacuolada característica por nematodo.
2. Neurodegeneración inducida por agregados de proteínas
NOTA: Las siguientes cepas se pueden utilizar para investigar la neurotoxicidad inducida por agregados proteicos investigados: (A) sobreexpresión de la sinucleína humana en neuronas dopaminérgicas, UA44: Es[baIn1; pdat-1á-syn, pdat-1GFP] y (B) sobreexpresión de proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan-neuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Mantenimiento, sincronización y preparación de nematodos transgénicos para ensayo de neurodegeneración
- Utilice un estereomicroscopio diseccionado para monitorear el desarrollo y crecimiento de C. elegans.
- Día 1: Sincronice la población de nematodos transgénicos recogiendo y transfiriendo 15-20 larvas L4 de cada cepa en placas NGM recién sembradas de OP50.
NOTA: Utilice al menos tres placas de cada cepa por condición. - Incubar y dejar que los nematodos crezcan a una temperatura estándar de 20oC.
- Día 2: Realizar el preacondicionamiento diario durante 30 minutos transfiriendo las placas en una incubadora establecida a 34oC. A continuación, devuelva los nematodos preacoso a la temperatura estándar de 20 oC.
NOTA: Diferentes antecedentes genéticos pueden ser sensibles a las altas temperaturas durante largos períodos de exposición. - (A) Si se investiga la sobreexpresión de la sínucleina humana en las neuronas dopaminérgicas, UA44: Es[baIn1; pdat-1-syn,pdat-1GFP]: el día 9, controlar los nematodos transgénicos de 7 días de edad para la muerte celular neuronal dopaminérgica.
- (B) Si investiga la sobreexpresión de la proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan neuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: el día 5, mida los agregados de PoliQ neuronales en la región principal de animales transgénicos de 4 días de edad que expresen Q40::YFP.
- Montaje de las muestras para el examen microscópico
- Preparar almohadillas de agarosa del 2% (Tabla 1).
- Añadir 10 l de 20 mM M9/levamisole buffer drop en el centro de la almohadilla de agarosa.
- Escoja los respectivos nematodos transgénicos y transeúncialos en una gota M9/levamisole.
NOTA: Coloque 20-30 nematodos por gota. - Coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la muestra.
NOTA: Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para preservar la humedad durante todo el proceso de toma de imágenes. - Proceda al examen microscópico de las muestras respectivas.
- Proceso de adquisición y análisis de datos de nematodos transgénicos que co-expresan la sinucleína y la GFP citosólica en las neuronas dopaminérgicas
- Utilice un microscopio de epifluorescencia combinado con una cámara (por ejemplo, EVOS FL Auto 2).
- Detecte y capture imágenes de la pila z de la región principal con un aumento de 20 veces.
- Guarde y recopile las imágenes de proyección de intensidad máxima.
- Proceder al análisis de las imágenes adquiridas.
- Examine los gusanos transgénicos en busca de neurodegeneración puntuando las siguientes características celulares, (i) pérdida de fluorescencia por parte de las neuronas que expresan GFP bajo el promotor de las neuronas dat-1,ii) que muestran soma y/o blebbing axonal, crecimientos o pérdida dendrítica.
- Importe y analice los datos mediante un paquete de software (por ejemplo, Excel).
3. Proceso de adquisición y análisis de datos de nematodos transgénicos que expresan pan-neuronalmente PolyQ40 fusionado con YFP
- Utilice un microscopio de epifluorescencia combinado con una cámara (por ejemplo, EVOS FL Auto 2).
- Detecte y capture imágenes de la pila z de la región principal con un aumento de 20 veces.
- Guarde y recopile las imágenes de proyección de intensidad máxima.
- Proceder al análisis de las imágenes adquiridas mediante el uso de software de Fiji.
- Abrir imágenes con el programa Fiji14.
- Seleccione el comando Dividir canales a través del menú desplegable Imagen y color.
NOTA: Mantenga la imagen del canal verde. - Utilice la herramienta de selección a mano alzada para establecer manualmente la región fluorescente de interés (ROI; por ejemplo, cabeza).
- Agregue el ROI respectivo en ROI Manager a través del menú desplegable Analizar y herramientas.
- Restar el fondo al 50% seleccionando Procesar y Restar fondo.
- Configurar y aplicar valores de umbral a través del comando de menú Imagen ? Ajustar ? Umbral. Mantenga y establezca los mismos valores de umbral a lo largo del análisis de imágenes de todo el experimento.
- Seleccione el ROI respectivo en ROI Manager.
- Analice el número de agregados de proteínas mediante el comando de menú Analizar y analizar partículas.
- Repita los pasos 3.5-3.12 para cada imagen adquirida.
- Copie los valores de visualización de la ventana Resultados independiente.
- Pegue/Importe y analice los resultados utilizando un paquete de software.
4. Informe de análisis estadístico
- Utilice al menos 30 nematodos para cada condición experimental. Realice tres réplicas biológicas.
- Utilice software de análisis estadístico para realizar la prueba t-de los estudiantes (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con p < 0.05 como significativo.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Muerte celular necrótica inducida por canales iónicos hiperactivos
Utilizando los procedimientos presentados aquí, los embriones mutantes mec-4(u231) y deg-3u662) fueron incubados durante 25 min a 34 oC o mantenidos a una temperatura estándar de 20 oC. Tras la eclosión, el número de cadáveres celulares neuronales se determinó en la etapa larval L1 de ambos grupos. La muerte celular necrótica disminuye en los nematodos que eclosionaron a causa de los huevos preacobidos por choque de c...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles para el crecimiento, sincronización y examen microscópico de algunos modelos versátiles de C. elegans que investigan la neurodegeneración dependiente de la edad. En particular, evaluamos y diseccionamos los fundamentos celulares y moleculares de la descomposición neuronal relacionada con la edad mediante el uso de necrosis inducida por canales iónicos hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados deproteínas 1
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Chaniotakis M. y Kounakis K. por la grabación y edición de vídeo. K.P. está financiado por una subvención de la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (HFRI) y la Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT). N.T. está financiado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC – GA695190 – MANNA), los Programas Marco de la Comisión Europea y el Ministerio de Educación de Grecia.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarosa | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Cloruro de calcio deshidratado (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Colesterol | SERVA Electroforesis | 17101.01 | |
| grados-3(u662)V o grados-3(d) | Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) | animales a 20 & grados; | |
| Microscopio C DIC (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Microscopio estereoscópico de disección | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Microscopio de epifluorescencia | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 cepa | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri platos (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| software de análisis de imágenes | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X o mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | animales a 20 & grados; C | |
| Portaobjetos de microscopio (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Cubreobjetos de microscopio (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Paquete de software Excel | Microsoft Corporation, Redmond, EE. UU | ||
| . Na2HPO4 | EMD Millipore | 1.06.586 | |
| Placas de agar del medio de crecimiento de nematodos (NGM) | |||
| nistatina | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptona | BD, Bacto 211677 | ||
| Tampón | |||
| Cloruro de sodio (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Equipo estándar para la preparación de placas de agar ( autoclave, placas de Petri, etc.) | |||
| Equipo estándar para el mantenimiento de lombrices (pico de alambre de platino, incubadoras, etc.) | |||
| software de análisis estadístico | GraphPad Software Inc., San Diego, EE. UU. | Paquete de software GraphPad Prism | |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Clorhidrato de tetramisol | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | A pedido: G. Caldwell (Universidad de Alabama, Tuscaloosa AL) |
Referencias
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
