Aprendizaje automático supervisado para la semi-cuantificación del ADN extracelular en glomerulonefritis

Resumen

El ADN extracelular (ADNC) liberado durante la muerte celular es proinflamatorio y contribuye a la inflamación. La medición del ADNc en el lugar de la lesión puede determinar la eficacia del tratamiento terapéutico en el órgano diana. Este protocolo describe el uso de una herramienta de aprendizaje automático para automatizar la medición de ECDNA en el tejido renal.

Resumen

La muerte celular glomerular es una característica patológica de la vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos con mieloperoxidasa (MPO-AAV). El ácido desoxirribonucleico extracelular (ADNc) se libera durante diferentes formas de muerte celular, incluyendo apoptosis, necrosis, necroptosis, trampas extracelulares de neutrófilos (NELL) y piroptosis. La medición de esta muerte celular consume mucho tiempo con varios biomarcadores diferentes necesarios para identificar las diferentes formas bioquímicas de muerte celular. La medición del ADNc generalmente se lleva a cabo en suero y orina como sustituto del daño renal, no en el órgano diana real donde se produce la lesión patológica. La dificultad actual para investigar el ADC en el riñón es la falta de métodos para el tejido incrustado de parafina fija de formalina (FFPE) tanto experimentalmente como en biopsias renales humanas archivadas. Este protocolo proporciona un resumen de los pasos necesarios para manchar para ecDNA en el tejido FFPE (tanto humano como murino), apagar la autofluorescencia y medir el ECDNA en las imágenes resultantes utilizando una herramienta de aprendizaje automático de la segmentación de Weka de código abierto disponible públicamente. La segmentación entrenable de Weka se aplica a ecDNA dentro de los glomérulos, donde el programa aprende a clasificar el ECDNA. Este clasificador se aplica a las imágenes renales adquiridas posteriores, lo que reduce la necesidad de anotaciones manuales de cada imagen individual. La adaptabilidad de la segmentación entrenable de Weka se demuestra aún más en el tejido renal de la glomerulonefritis experimental murina anti-MPO (GN), para identificar NETs y ecMPO, contribuyentes patológicos comunes a anti-MPO GN. Este método proporciona un análisis objetivo de la ADNc en el tejido renal que demuestra claramente la eficacia en la que el programa de segmentación de Weka entrenable puede distinguir el ADNc entre el tejido renal normal sano y el tejido renal enfermo. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para identificar ECDNA, NETs y ecMPO en otros órganos.

Introducción

La vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos anti neutrófilos de mieloperoxidasa (MPO-AAV) es una enfermedad autoinmune que produce insuficiencia renal por lesión glomerular patológica con considerable muerte celular y liberación de ácido desoxirribonucleico (ADN)^1,2. El ADN puede activar el sistema inmunitario actuando como una señal de peligro. En condiciones saludables normales, la ubicación nuclear del ADN ofrece protección contra la exposición al sistema inmunitario. El auto-ADN que se libera extracelularmente durante los procesos patógenos o la autoinmunidad es visto por el sistema inmune como un....

Protocolo

Este método permite la detección de ecDNA pan a partir de todas las formas de muerte celular. El mismo método y anticuerpos se utilizan para el tejido de biopsia renal humana (del paso 4). Todos los sujetos animales y humanos tenían la aprobación ética de la Universidad de Monash, y Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.

1. Tinción de ECDNA con DAPI y Actin

1. Inducir un modelo de 20 días de glomerulonefritis anti-mieloperoxidasa (anti-MPO-GN) en ratones C57/Bl6 de 8-10 semanas de edad, con controles⁹.
   1. Eutanasia los ratones humanamente usando una cámara de_CO2.
   2. Retire los riñ....

Resultados

Estas imágenes representan los múltiples pasos necesarios para utilizar con éxito la segmentación de Weka entrenable para minimizar la medición manual intensiva en mano de obra de ecDNA en tejido renal FFPE manchado fluorescentemente de un ratón con GN anti-MPO inducido. Estos pasos se resumen en la Figura 1 y la Figura 2 con imágenes tomadas directamente del programa de segmentación de Weka, delineando cada paso en el proceso de.......

Discusión

Existen múltiples protocolos que miden los marcadores proinflamatorios en el suero y la orina tanto de los pacientes como de los modelos de ratón de glomerulonefritis. Este protocolo descrito permite el análisis de los productos de la muerte celular (ECDNA, NETs y ecMPO) directamente dentro del glomerulo. Los pasos más cruciales en este protocolo son la preparación de tejidos y la toma de imágenes. El principal elemento restrictivo del uso de un método de tinción fluorescente para el análisis es la autofluorescencia del .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina	SIGMA	A2153	Las soluciones al 5% y al 1% están compuestas en PBS, se pueden hacer a granel y congelarse, desechar una vez descongeladas.
Anticuerpo de absorción cruzada IgG (H+L) anti cabra de pollo Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Gire en la mini centrífuga durante 1 minuto antes de usar para evitar cualquier conjugado libre en su cóctel de anticuerpos
Anticuerpo de absorción cruzada IgG (H + L) anti ratón de pollo, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Gire en la mini centrífuga durante 1 minuto antes de usar para evitar cualquier conjugado libre en su cóctel
de anticuerposAnticuerpo de absorción cruzada Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Gire en la mini centrífuga durante 1 minuto antes de usar para evitar cualquier conjugado libre en su cóctel de anticuerpos
SERA de pollo	SIGMA	C5405	Hecho en 1%BSA/PBS
Cubreobjetos 24 x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Este no es un espesor estándar, diseñado para su uso en microscopía
confocalEDTA 10mM	SIGMA	E6758	Agregue TRIS y EDTA juntos en agua destilada y pH a 9, para la recuperación de antígenos, se puede hacer en una solución 10x Etanol
30%, 70% y 100%	Chem Supply	UN1170	Suministrado como etanol 100% sin desnaturalizar- diluido al 30% y 70% usando agua destilada
Formaldehído, 4% (10% Formalina tamponada neutra)	TRAJAN	NBF-500	El riñón se coloca en un tubo de 5 ml que contiene 3 ml de formalina durante 16 horas en RT, la formalina debe usarse en una campana
Portaobjetos de histología de vidrio: Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	TRAJAN	J3800AM4	El uso de portaobjetos recubiertos con carga positiva es esencial. No recomendamos el uso de poli-L-lisina para el recubrimiento de portaobjetos, ya que el tejido se desprende de los portaobjetos durante la etapa de recuperación del antígeno.
	D	AF3667	Alícuota y congelación a menos 80 grados a la llegada
Histosol	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	Usado solo, en recipientes de gradilla de tinción de 200 ml, uso en una campana
Bolígrafo hidrofóbico	VECTOR Labs	H-400	Úselo para dibujar un círculo alrededor del tejido renal
Ratón anti humano/ratón Peptidil arginasa 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Alícuota y congelación a menos 80 grados a la llegada
Cabezal láser de escaneo confocal Nikon C1 conectado al microscopio invertido Nikon Ti-E	científica		y se congela a menos 80 grados a su llegada
Solución salina tamponada con fosfato	SIGMA	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl Maquillaje 5L a la vez
Olla a presión 6L Tefal secure 5 Neo inoxidable	Tefal	GSA-P2530738	Comprado en la tienda local de artículos para el hogar
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	Aplique las gotas directamente al cubreobjetos
Conejo anti humano/ratón Anticuerpo Beta Actina	ABCAM	ab8227	Alícuota y congele a menos 80 grados a su llegada
Conejo anti humano/ratón Anticuerpo H3Cit	ABCAM	ab5103	Alícuota y congele a menos 80 grados a su llegada
Bandeja de tinción 24 portaobjetos	ProScitech	H4465	La rejilla de tinción elegida debe ser capaz de soportar la ebullición a presión y la incubación en un horno a 60 grados
Sudan Black	B SIGMA	199664	0.3% Agregue 3 g a una botella de 1 litro en etanol al 70%, filtre y proteja de la luz estable durante 6 meses a temperatura ambiente
Tris 10mM	SIGMA	T4661	Agregue TRIS y EDTA juntos en agua destilada y pH a 9, para la recuperación de antígenos, se puede preparar en una solución 10x
Xileno	Trajan	XL005/20	Debe usarse en una campana extractora

extractora extractora Alícuota coherente