Artículo de método

Identificación y caracterización de especies de ARN inmunogénico en alérgenos de HDM que modulan la inflamación pulmonar eosinofílica

5.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/61183

⸱

30 de mayo de 2020

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, Long School of Medicine, University of Texas Health San Antonio, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, 3Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Xiangya Hospital, Central South University

En este artículo

Resumen

Los alérgenos ambientales, como los ácaros del polvo de la casa (HDM), a menudo contienen sustancias microbianas que activan las respuestas inmunitarias innatas para regular la inflamación alérgica. El protocolo presentado aquí demuestra la identificación de especies de dsRNA en los alérgenos de HDM y la caracterización de sus actividades inmunogénicas en la modulación de la inflamación pulmonar eosinofílica.

Resumen

Los alérgenos ambientales, como los ácaros del polvo de la casa (HDM), a menudo se encuentran en formas complejas que contienen tanto proteínas alérgicas que impulsan respuestas aberrantes de tipo 2 como sustancias microbianas que inducen respuestas inmunitarias innatas. Estos componentes microbianos asociados a alérgenos desempeñan un papel importante en la regulación del desarrollo de condiciones inflamatorias de tipo 2 como el asma alérgica. Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo en gran medida indefinidos. El protocolo presentado aquí determina las características estructurales y la actividad in vivo del ARN inmunoestimulante asociado al alérgeno. Específicamente, se examinan alérgenos comunes para detectar la presencia de especies de ARN de doble cadena (dsRNA) que pueden estimular las respuestas de IFN en los pulmones y restringir el desarrollo de eosinofilia pulmonar grave en un modelo de ratón de asma alérgica inducida por HDM. Aquí, hemos incluido los siguientes tres ensayos: Punto blot para mostrar las estructuras dsRNA en el ARN total aislado de alérgenos incluyendo las especies de HDM, RT-qPCR para medir las actividades de ARN HDM en genes estimulantes del interferón (ISG) expresión en los pulmones de ratón y análisis FACS para determinar los efectos del ARN HDM en el número de eosinófilos en BAL y pulmón, respectivamente.

Introducción

Sobre la base de la hipótesis de higiene propuesta originalmente por Strachan1, la exposición en la primera infancia a factores microbianos ambientales como la endotoxina puede proteger contra el desarrollo de trastornos alérgicos2,,3. Durante las infecciones microbianas, por ejemplo, infecciones virales, la detección inmunitaria innata de ácidos nucleicos extraños (ARN/ADN) desencadena las respuestas de defensa del huésped4,,5,,6. Sin embargo, la existencia y prevalencia de ácidos nucleicos inmunogénicos como especies de ARN de doble cadena (dsRNA) en los ácaros del polvo de la casa (HDM) u otros alérgenos de insectos siguen siendo desconocidas. Este protocolo fue diseñado para determinar si el HDM o los alérgenos de insectos y no insectos contienen especies de dsRNA largos que pueden activar una respuesta inmune protectora para contrarrestar el desarrollo de inflamación pulmonar eosinofílica grave en un modelo de ratón de asma alérgica. Aquí, proporcionamos tres métodos simples y rápidos para evaluar los determinantes estructurales en el ARN total de HDM que se requieren para regular la inflamación pulmonar eosinofílica inducida por alérgenos.

El sistema inmunitario mucoso es el órgano inmune más grande del cuerpo y sirve como primera línea de defensa del huésped contra infecciones microbianas e insultos alérgicos7,,8. El dsRNA largo, el intermedio de replicación de muchos virus, se sabe que funciona como un patrón molecular asociado a patógenos (PAMP) para estimular poderosamente las respuestas innatas a través de Toll como el receptor 3 (TLR3) para inducir la expresión de genes estimulados por interferón (ISG)9,,10,,11,12,,13,,14. Recientemente hemos demostrado que el ARN total del HDM contenía estructuras de ARNm, que regulaban la expresión de ISG y reducían la inflamación pulmonar eosinofílica grave cuando se administraban a través de la instilación intratraqueal en un modelo murino de asma alérgica inducida por extractos de HDM15. La gravedad de las inflamaciones pulmonares se determina mediante el análisis de los tipos de células inmunitarias en lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar a través de la citometría de flujo16,17,18,19,20.

Este protocolo incluye tres ensayos: 1) detección rápida de estructuras de dsRNA con mancha de puntos de ARN utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón J2 que se une específicamente al dsRNA (40bp) de una manera independiente de la secuencia; 2) evaluación rápida de los efectos in vivo del ARN inmunoestimulador en los pulmones de ratón midiendo la inducción de ISG utilizando RT-qPCR; 3) cuantificación precisa de eosinófilos en BAL y pulmón en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por HDM utilizando análisis de citometría de flujo.

Los ensayos anteriores se pueden utilizar para estudiar no sólo las enfermedades pulmonares alérgicas, sino también las infecciones bacterianas y virales respiratorias. Por ejemplo, el anticuerpo J2 específico de dsRNA también se puede utilizar en otras aplicaciones como cromatografía inmunoafinada, inmunohistoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) e inmunosuración21,,22,,23. Además, se pueden utilizar varias aplicaciones aguas abajo de la recolección de fluidos BAL para cuantificar contenidos solubles como citoquinas y quimioquinas utilizando ELISA, y el perfilado transcripcional de células en las vías respiratorias (por ejemplo, macrófagos alveolares). Aunque hay una variedad de protocolos disponibles en la literatura para evaluar las condiciones pulmonares, la mayoría de estos protocolos a menudo se centran en la validación de destino. Los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar para identificar componentes en alérgenos ambientales que son importantes para regular el desarrollo de enfermedades alérgicas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas Health San Antonio.

1. Punto blot para mostrar la presencia de estructuras dsRNA en el ARN total hdM

  1. Aislamiento total de ARN de alérgenos, insectos y alérgenos no insectos
    1. Poner HDM, insectos o animales no insectos recogidos vivos u obtenidos comercialmente en tubos de 50 ml, y congelar rápidamente con líquido-N2. A continuación, conservar a -70 oC para el posterior aislamiento total de ARN.
      NOTA: En este experimento, se seleccionaron HDM, insectos y animales no insectos porque se sabe que son fuentes comunes de alérgenos. Además, una función inmunoestimulador de sus ARN sigue sin estar clara.
    2. Transfiera una cantidad adecuada (equivalente a 100 ml en volumen o menos) de HDM, insectos o animales no insectos almacenados a -70 oC en un tubo de 2 ml que contenga perlas (esferas cerámicas de 1,4 mm), luego congele los tubos en un recipiente líquido-N2 durante 10 minutos.
    3. Para el aislamiento total de ARN, agregue 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN basado en tiocianato de guanidinio24 a cada tubo, luego rompa el insecto y los animales pequeños no insectos con un disruptor celular de alta energía a la velocidad máxima durante 45 s y escalofríos en hielo. Repita este paso dos veces.
    4. Transfiera la solución del paso 1.1.3 a un nuevo tubo de 1,5 ml y añada 200 l de cloroformo a cada tubo y vórtice. Tubos centrífugos a 14.000 x g durante 14 min a 4oC.
    5. Una vez completada la centrifugación, transfiera la fase acuosa superior (200 l) a un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 500 ml de isopropanol para precipitar el pellet de ARN. No moleste la interfase. La relación de volumen recomendada de la fase superior frente al isopropanol es de 1:2.5.
    6. Mezclar por vórtice suave, luego centrifugar tubos a 14.000 x g durante 14 min a 4 oC.
    7. Aspirar el sobrenadante con precaución y luego lavar el pellet de ARN con 500 ml de etanol al 75% y centrífuga a 7.500 x g durante 10 min a 4 oC. Retire todo el líquido con precaución, seque al aire el pellet y disuelva el pellet de ARN con 20-50 l de H2O libre de RNase.
    8. Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro utilizando los siguientes parámetros:
      1. Abra el software asociado y seleccione el tipo de ácidos nucleicos a medir. Cambie el tipo de muestra a ARN.
      2. Realice la medición en blanco con 1-2 l de H2O. Limpie el H2O libre de RNase. Ahora, el instrumento está listo para la medición.
      3. Cargue 1-2 l de la muestra de ARN y mida la concentración de ARN (g/L).
        NOTA: La relación de la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/280) a 2,0 (1,9-2,2) se acepta generalmente como "pura" para el ARN. Si no se procesa inmediatamente, almacene las muestras de ARN a -70 oC y evite los ciclos de congelación y descongelación para mantener el ARN intacto.
  2. Detección de la estructura de dsRNA en el ARN total utilizando anticuerpoS J2 específicos de dsRNA
    1. Preparar dos muestras de ARN de 200 ml (200 ng/L). Uno con tratamiento RNase-III (1 ml para 1 g de ARN, incubar a 37 oC durante 60 min) y el otro sin tratamiento con RNase-III.
      NOTA: RNase III se utiliza aquí para degradar específicamente el dsRNA, pero no el ARN de una sola cadena25.
    2. Utilice un lápiz para dibujar rejillas donde las muestras de ARN se borrarán en la membrana.
    3. Detecte 2 l de la muestra de 200 ng/L de la muestra de ARN sobre la membrana de nylon cargada positivamente.
    4. Entrecruza las muestras a la membrana a 1.200 microjulios x 100 en un reticulante UV. Repita los pasos 1.2.3 y 1.2.4 dos veces más en el lugar del punto de muestra. Esto dará como resultado un total de 0,8 g por mancha.
      NOTA: No detecte más de 2 ml de muestra de ARN en la membrana a la vez.
    5. Bloquee la unión no específica con 5% de leche en TBS-T durante 1 h con agitación a temperatura ambiente. Retire la solución de bloqueo del paso 1.2.5 y añada el anticuerpo anti-dsRNA J2 a la dilución 1:1.000 en 1% de leche en TBS-T e incubar durante la noche con temblor a 4oC.
    6. Lave la membrana con TBS-T durante 5 minutos y repita este paso durante 3 veces. Añadir el anticuerpo secundario (IgG antifasa conjugada con fosfatasa alcalina diluida en 1% de leche 1:5.000) e incubar durante 1 h en una coctelera a temperatura ambiente. Lave la membrana con TBS-T durante 5 min y repita este paso durante 3x.
    7. Añadir el sustrato (BCIP/NBT) e incubar durante 5-15 min hasta que la señal deseada sea visible.
    8. Detenga la reacción enjuagando la membrana con ddH2O.
    9. Seque la membrana en papeles tisú y tome una fotografía con un teléfono inteligente (se muestra un resultado representativo en la Figura 1).

2. RT-qPCR para medir la capacidad del ARN total de HDM en la estimulación de la expresión de ISGs pulmonares

  1. Aislamiento de ARN de los tejidos pulmonares de ratones
    NOTA: Los ratones (hembras, 8-12 semanas de edad, C57BL/6J) se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos.
    1. Anestesar brevemente al animal con isoflurano y administrar a través de la instilación intratraqueal con 5 g (diluido en 80 l de PBS) de ARN HDM tratados con o sin RNase III.
    2. Después de 16-18 h después del tratamiento con ARN HDM, sacrifique el ratón por inhalación deCO2 durante unos minutos. A continuación, coloque el ratón sobre una plataforma y alfiler las extremidades con agujas.
    3. Desinfectar el ratón con 70% de etanol y luego cortar la piel a partir del abdomen al cuello con una tijera esterilizada.
    4. Fije la piel con agujas y corte las costillas para exponer los pulmones. Retire los pulmones enteros y lávelos con PBS frío. Coloque los pulmones sobre papeles tisú e especiale una pequeña pieza de cada lóbulo pulmonar en un tubo de 2 ml que contenga perlas (200-300 ml en volumen, esferas cerámicas de 1,4 mm).
      NOTA: El propósito de usar cuentas de cerámica es moler tejidos pulmonares enteros
    5. Congele las muestras de pulmón2 colocando los tubos en un recipiente líquido-N2 durante 10 min.
    6. Añadir 500 l de reactivo de aislamiento de ARN a base de tiocianato de guanidinio a cada tubo y romper los tejidos pulmonares con un homogeneizador durante 45 s. Enfriar sobre hielo entre cada paso. Repita este paso dos veces.
    7. Siga los pasos 1.1.4- 1.1.7 para el aislamiento de ARN pulmonar.
    8. Secar al aire el pellet y disolver el pellet de ARN con la cantidad adecuada de H2O libre de RNase (20-30 l).
    9. Mida la concentración de ARN como se describe en el paso 1.1.8.
  2. RT-qPCR para determinar la capacidad del ARN HDM para estimular la expresión génica pulmonar.
    1. Utilizando 100 ng/L de ARN extraído de los tejidos pulmonares como plantilla, realice la síntesis de ADNc de acuerdo con el protocolo26al que se hace referencia.
    2. Configure una reacción RT-qPCR a 10 l/pozo para una placa de 384 pocillos utilizando cDNA generado anteriormente y los pares de imprimación específicos del gen(Tabla 1 y Tabla 2).
    3. Sellar los pozos firmemente con una película adhesiva transparente y vórtice la placa durante 30 s. Gire la placa a 1.000 x g durante 30 s para recoger muestras en la parte inferior de los pozos.
    4. Cargue la placa en una máquina RT-qPCR y comience a ejecutar la reacción RT-qPCR utilizando el protocolo termólocista(Tabla 3).
    5. Exporte los resultados a un archivo de hoja de cálculo o analice los datos utilizando el software proporcionado por la fabricación una vez completado el programa (se muestra un resultado representativo en la Figura 2).

3. Análisis FACS para determinar los efectos del ARN HDM en la infiltración de eosinófilos en BAL y pulmón

  1. Colección de fluidos BAL para análisis FACS
    1. Ratones de eutanasia (hembra, 8-12 semanas de edad, C57BL/6J) que fueron tratados con extractos de alérgenos HDM (según el diseño experimental mostrado en la Figura 3B)por inhalación de CO2.
    2. Coloque el ratón sobre una plataforma y alfiler las extremidades con agujas.
    3. Desinfectar el ratón con 70% de etanol. Usa tijeras para cortar la piel desde la zona superior del abdomen hasta el cuello.
    4. Suavemente, tire de las glándulas salivales y el músculo esternoide cuidadosamente aparte usando los fórceps para exponer la tráquea. Coloque una cuerda de nylon (10 cm) debajo de la tráquea usando fórceps.
    5. Haga una incisión en la tráquea (2 mm debajo de la laringe) lo suficiente como para insertar una cánula. No corte a través de la tráquea. Con nudo de la cuerda alrededor de la tráquea y la cánula.
    6. Cargue la jeringa con 1 ml de PBS+EDTA y adjúntela al extremo de la cánula. Inyecte 1 ml de PBS+EDTA en el pulmón y aspire completamente la solución. Separe la jeringa de la cánula cuidadosamente y transfiera la solución a un tubo de 15 ml sobre hielo.
    7. Vuelva a cargar la jeringa con el PBS+EDTA fresco y repita este paso 2x.
    8. Centrifugar el tubo que contiene el BAL agrupado obtenido en el paso 3.1.7 para peletizar las células a 500 x g durante 7 min a 4 oC. Registre el volumen de líquido BAL y transfiera el sobrenadante a dos tubos de 1,5 ml sin alterar el pellet.
      NOTA: El sobrenadante de BAL se puede almacenar a -70 oC para análisis futuros, por ejemplo, ELISA.
    9. En caso de que haya glóbulos rojos presentes en el pellet debido a una inflamación pulmonar grave, después de retirar el sobrenadante, añadir 500 l de tampón de lylisis RBC y mezclar bien por resuspensión. Transfiera la solución a un nuevo tubo de 1,5 ml y centrífuga durante 7 minutos a una velocidad de 500 x g a 4 oC.
    10. Retire el sobrenadante y resuspender el pellet en 150 l de tampón FACS.
    11. Transfiera los 150 l de la muestra resuspendida a una placa de 96 pocillos y centrifuga la placa durante 7 minutos a una velocidad de 500 x g a 4 oC.
    12. Rápidamente, invierta la placa en papeles tisú para recoger las células que residen en la parte inferior de los pozos.
    13. Manchar las células con anticuerpos en el tampón FACS en presencia de 2,4G2 de anticuerpos de bloqueo (2,5 g / 100 l). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en un lugar oscuro.
    14. Después de la tinción, centrifugar la placa para peletizar las células a 500 x g durante 7 min a 4 oC.
    15. Retire la solución de tinción invirtiendo la placa en papel tisú y luego lave mediante resuspending con 100 l de tampón FACS. A continuación, centrifugar la placa de nuevo a 500 x g durante 7 min a 4 oC y retire el tampón FACS invirtiendo la placa sobre papel tisú.
    16. Resuspender muestras en 150 ml de tampón FACS y transferir muestras a los tubos FACS que contienen 350 l de búfer FACS. Agregue 25 ml de cuentantes de cuentas a cada muestra. Las muestras ya están listas para el análisis de citometría de flujo.
      NOTA: Varios tipos de células en el líquido BAL fueron etiquetados con anticuerpos como se indica. Se añadieron cuentas de conteo antes de la ejecución del FACS. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando un software disponible comercialmente. Refiera al cuadro 3 y al cuadro 4 para la estrategia del gating.
  2. Digestión del tejido pulmonar para el análisis FACS
    1. Siga los pasos 3.1.1 - 3.1.3.
    2. Cortar la piel a partir del abdomen hasta el cuello con una tijera esterilizada. Fije la piel con agujas y corte las costillas para exponer los pulmones.
    3. Retire los pulmones enteros y lávelos con PBS frío. Colocar muestras en el tubo de 1,5 ml que contenga 50 ml de solución de digestión pulmonar.
    4. Picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños con una tijera curva. Transfiera los tejidos pulmonares a una placa de 6 pozos, luego agregue 8 ml de solución de digestión pulmonar. Colocar la placa sobre una coctelera en una incubadora de 37oC durante 45 min.
    5. Después de la incubación, utilice la parte superior del tubo de 1,5 ml para moler los tejidos pulmonares. Coloque un colador de 70 m en una nueva placa de 6 pocillos y aplique la muestra a través de un filtro de 0,22 m.
    6. Transfiera la solución filtrada a un tubo de 15 ml y, a continuación, centrifuga los tubos a 500 x g durante 7 min a 4 oC. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de lílisis RBC y dejarlo en hielo durante 3 min.
    7. Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 ml y centrífuga a 500 x g durante 7 min a 4oC. Repetir 2x
    8. Lavar las células pulmonares 2x con 1 ml de tampón FACS. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón FACS, y luego transferir 100 l de la muestra en una placa de 96 pozos.
    9. Centrifugar la placa durante 7 min a una velocidad de 500 x g a 4oC. Siga los pasos descritos en la recolección de fluidos BAL para el análisis de FACS (3.1.13 a 3.1.16) para manchar las células de las muestras de tejido pulmonar digerido.
      NOTA: Los eosinófilos en los pulmones fueron etiquetados con anticuerpos como se indica, luego mezclados con cuentantes para un análisis adicional de FACS. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando software asociado. Consulte la Figura 3 para evaluar las respuestas inmunitarias inducidas por ARN HDM.

4. Análisis estadístico

  1. Realice análisis estadísticos utilizando un software disponible comercialmente.
  2. Determine los valores p mediante la prueba t de estudiante de dos colas sin pares para la comparación de dos grupos.
  3. Calcular los números absolutos de eosinófilos basados en cuentas de referencia (panel superior) utilizando la fórmula

figure-protocol-1

  1. Determine los valores p por ANOVA bidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Sidak para la comparación de más de dos grupos.
  2. Considere un valor p menor que 0.05 como estadísticamente significativo. Los valores p se indican en parcelas como *p <0.05, **p<0.01, ***p<0.001 y ****p<0.0001.
    NOTA: Todas las recetas de búfer se proporcionan en la Tabla 5.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La presencia de estructuras largas de dsRNA en HDM, insectos y animales pequeños no insectos fue examinada por punto btil utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón específico de dsRNA J2 (40bp). RNase III se utilizó para digerir el ARN en fragmentos de dsRNA de 12-15 bp, que eran indetectables por J2 (Figura 1).

La capacidad del ARN total del HDM para estimular una respuesta inmunitaria innata en los pulmones del ratón de una manera dependiente de la dosis fue ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El protocolo actual describe cómo evaluar las propiedades inmunoestimuladoras del ARN microbiano asociado al alérgeno y sus impactos en el desarrollo de la inflamación pulmonar eosinofílica en un modelo de ratón de asma alérgica. Aunque los dsRNAs largos se conocen como los intermedios de replicación de muchos virus que pueden activar poderosamente las respuestas de interferón en las células de los mamíferos, sus presencias en los alérgenos HDM se han desconocido hasta nuestro trabajo reciente15. ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Sra. Karla Gorena por la asistencia técnica en citometría de flujo. L.S. cuenta con el apoyo del Consejo de Becas de China y la Fundación Provincial de Innovación de Hunan para El Posgrado (CX201713068). H.H.A. cuenta con el apoyo del Departamento de Ciencias de Laboratorio Clínico, Facultad de Ciencias Médicas Aplicadas, Universidad Jouf, Sakaka, Arabia Saudita. X.D.L. cuenta con el apoyo del Fondo de Inicio de la Escuela de Medicina de UT Health San Antonio y el Fondo Max y Minnei Voelcker.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,40 y micro; m Filtro de células FalconThermo Fisher Scientific08-771-1
Jeringas de 1 mLHenke Sass Wolf5010.200V0
15 mL TuboTH. Geyer7696702
tubo de 50 mLTH. Geyer7696705
70% etanolDecon Labs2701
Cuentas de conteo absolutoLife Technologies Europe B.V.C36950
Tampón de lisado ACK-RBCLonza10-548E
Membrana Amersham Hybond-N+GE HealthcareRPN203B
Ant SanAntonioNota: Tampón
(consulte la Tabla 5 para la receta)
Dilución 200
Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clon N418)BioLegend117317dilución de 1 a 200
Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clon 1D3)eBioscience15-0193-81Dilución de 1 a 200
Anti-Mouse CD3e APC (clon 145-2C11)Invitrogen15-0031-81Dilución de 1 a 200
Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clon: 30-F11)BioLegend1031301 a 200 dilución
Tinte de viabillity fijable anti-ratón eFluor 506Invitrogen65-0866-141 a 200
Anti-Mouse IgG (H+L), AP ConjugadoPromegaS3721
Anti-Mouse Ly-6G FITC (clon RB6-8C5)Invitrogen11-5931-821 a 200 dilución
Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clon M5/114.15.2)eBioscience47-5321-801 a 200 dilución
Anti-Mouse Siglec-F PE (clon E50-2440)BD Pharmingen5521261 a 200 dilución
Sustrato BCIP/NBTThermo Fisher ScientificPI34042
Blocking Buffer (consulte la tabla 5 para obtener la receta)
Canual, 20 G x 1,5"CADENCE SCIENCE9920
CentrífugaThermo Fisher Scientific75004030
CFX384 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo realBio-Rad Laboratories 1855485
ChloroformThermo Fisher ScientificC298-500
CucarachaGreer LaboratoriesB26
Cuentas de conteoThermo Fisher Scientific01-1234-42
D. farinaeLaboratorios GreerB81
D. pteronyssinusLaboratorios GreerB82
Denville Placas de cultivo celular con tapa, placa de cultivo celular de 96 pocillosThomas Scientific1156F03
Baño seco digital - Cuatro bloquesUniversal Medical, Inc.
lombriz de tierraSan Antoniorecolectado
FACS(ver receta en la Tabla 5)
Biosciences
FlyGreer LaboratoriesB8
PinzaRoboz Instrumento quirúrgicoRS-5135
HemocitómetroHausser Scientific3110
HT-DNASigmaD6898
In Vivo MAb anti-ratón CD16/CD32 (clon: 2.4G2)Bio X CellBE0307
iScript ADNc Kit de síntesisBio-Rad Laboratories1708891
IsofluranoAbbott Labssc-363629Rx
IsopropanolThermo Fisher ScientificBP2618500
J2 anticuerpo monoclonal anti-dsRNASCICONS10010200
Soluciónver receta en la Tabla 5)
Lysing Matrix DMP Biomedicals116913050-CF
Lysing Matrix D, tubo de 2 mLMP BiomedicalsSKU:116913100
Ratones (hembras, 8-12 semanas de edad, C57BL/6J)Jackson Laboratory#000664
Tubo de microcentrífuga 1,5 mLSigma-Aldrich30120.094
MicroscopioOlympusCK30
Mini-BeadBeaterHomogeneizadoresSKU:BS:607
Mini-Beadbeater-16Biospec607
MosquitoGreer LaboratoriesB55
NanoDrop 2000CEspectrofotómetro Thermo Scientific Medex SupplyTSCND2000C
Aguja, 21 G x 1 1/2 enBD Biosciences305167
Leche descremadaBio-Rad Laboratories 1706404
Cuerda de nylonDynarex3243
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)LonzaBE17-516F
RNasa IIIThermo Fisher ScientificAM2290
RNase T1Thermo Fisher ScientificAM2283
TijerasRoboz Instrumento quirúrgicoRS-6802
Agitador o pequeño mezclador de laboratorioBoekel Scientific201100
SPHERO AccuCount FluorescenteSpherotechACFP-70-5a 10 dilución
SpiderSan AntonioNota: TBS recolectado
(ver receta en la Tabla 5)TBS-T
(ver receta en la Tabla 5)
Medio(ver receta en la Tabla 5)
Reactivo TRIzolThermo Fisher Scientific15596018
Tween 20Sigma-AldrichP9416
UV Stratalinker 2400 UVLabX20447
AvispaSan AntonioNota: Recolectado
de dilución de anticuerpos recolectado localmenteAnti-Mouse CD11b V450 Rata (clon M1/70)BD Bioscience 560456 1 a dilución de BSH1004 Nota: Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) localmente.Tampón Sigma-Aldrich E6511 Tubos de polipropileno de fondo redondo Falcon, 5 mL STEMCELLTM TECHNOLOGIES 38056 Citómetro de flujo (BD FACS Celesta)BD de digestión pulmonar ( 1 localmente celular total localmente

Referencias

  1. Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
  2. Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
  3. Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
  4. Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
  5. Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
  6. Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
  7. O'Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
  8. Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018).
  9. Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
  10. Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
  11. Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
  12. McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351(2012).
  13. Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506(2016).
  14. Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
  15. She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
  16. Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128(2017).
  17. Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
  18. Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73(2017).
  19. Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).
  20. Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427(2019).
  21. Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: scicons.eu/en/antibodies/j2/ (2020).
  22. Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
  23. Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70(2018).
  24. TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf (2020).
  25. ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245 (2020).
  26. IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf (2020).
  27. Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
  28. Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
  29. Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

ARN de cadena doblecaro del polvo dom sticoan lisis de RT qPCRan lisis de FACSensayo de dot blotaislamiento de ARNlavado broncoalveolarprocesamiento de tejido pulmonarcitometr a de flujo

Artículos relacionados