In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Summary

Descrito aquí es un método para utilizar embriones de pez cebra para estudiar la capacidad de las nanopartículas funcionalizadas para atacar las células cancerosas humanas in vivo. Este método permite la evaluación y selección de nanopartículas óptimas para futuras pruebas en animales grandes y en ensayos clínicos.

Abstract

Desarrollar nanopartículas capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés en el campo de la nanomedicina. Los modelos animales in vivo son necesarios para unir la nanotecnología a su aplicación biomédica. El ratón representa el modelo animal tradicional para las pruebas preclínicas; sin embargo, los ratones son relativamente caros de mantener y tienen ciclos experimentales largos debido a la limitada progenie de cada madre. El pez cebra ha surgido como un potente sistema modelo para la investigación del desarrollo y la biomédica, incluida la investigación del cáncer. En particular, debido a su transparencia óptica y rápido desarrollo, los embriones de pez cebra son muy adecuados para el monitoreo in vivo en tiempo real del comportamiento de las células cancerosas y sus interacciones con su microambiente. Este método fue desarrollado para introducir secuencialmente células cancerosas humanas y nanopartículas funcionalizadas en embriones transparentes de pez cebra Casper y monitorear el reconocimiento in vivo y la focalización de las células cancerosas por nanopartículas en tiempo real. Este protocolo optimizado muestra que las nanopartículas con etiqueta fluorescente, que están funcionalizadas con grupos de folatos, pueden reconocer y atacar específicamente las células de cáncer epiteliales humanos metastásicos etiquetadas con un fluorocromo diferente. El proceso de reconocimiento y focalización puede ocurrir tan pronto como 30 min postinjection de las nanopartículas probadas. Todo el experimento sólo requiere la cría de unos pocos pares de peces adultos y tarda menos de 4 días en completarse. Además, los embriones de pez cebra carecen de un sistema inmunitario adaptativo funcional, lo que permite el injerto de una amplia gama de células cancerosas humanas. Por lo tanto, la utilidad del protocolo descrito aquí permite la prueba de nanopartículas en varios tipos de células cancerosas humanas, facilitando la selección de nanopartículas óptimas en cada contexto específico del cáncer para futuras pruebas en mamíferos y la clínica.

Introduction

El desarrollo de nanopartículas que son capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés tanto para los físicos como para los investigadores biomédicos. La aparición de nanomedicina condujo al desarrollo de varias nanopartículas, como las conjugadas con ligandos de orientación y/o fármacos quimioterápicos^1,,2,,3. Las propiedades añadidas de las nanopartículas permiten su interacción con el sistema biológico, la detección y el seguimiento de eventos biológicos con alta eficiencia y precisión junto con aplicaciones terapéuticas. Las nanopartículas d....

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Escuela de Medicina de la Universidad de Boston bajo el protocolo : PROTO201800543.

1. Generación de embriones de pez cebra Casper

1. Elija peces Casper adultos que tienen al menos 3 meses de edad para la cría natural para generar embriones transparentes de pez cebra Casper.
2. Llenar tanques de apareamiento de dos cámaras con agua de pescado por la noche, separar los tanques superiores usando divisores, colocar un pez macho en un lado de la cámara y uno o dos peces hembra en el ot....

Results

El esquema de protocolo de la Figura 1 ilustra los procedimientos generales para este estudio. Se criaron peces adultos transparentes de Casper y hembras para generar embriones (sección 1). Las células HeLa RFP+ se inyectaron en el área vascularizada bajo la cavidad perivitelina de los embriones de pez cebra a 48 cvf, con embriones no inyectados como controles (sección 3). Para los individuos con experiencia en microinyección, la tasa de supervivenci.......

Discussion

El protocolo descrito aquí utiliza el pez cebra como un sistema in vivo para probar la capacidad de las nanopartículas para reconocer y atacar las células de cáncer humano metastásicas. Varios factores pueden afectar a la ejecución exitosa de los experimentos. En primer lugar, los embriones deben desarrollarse completamente a 48 cvf. La correcta etapa de desarrollo de los embriones les permite soportar y sobrevivir al trasplante de células cancerosas humanas. Los embriones menores de 48 hpf tienen una tasa de supervivenc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosa	KSE scientific	BMK-A1705
Capilares de vidrio de borosilicato	World Precision Instruments	1,0 mm D.E. x 0,78 mm
Ordenador y monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	vendido por Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Incubadora de peces	VWR	35960-056
Hemocitómetro	Fishersci marca	02-671-51B
Soporte magnético	World Precision Instruments	M10
Punta de microcargador	Eppendorf	E5242956003	vendido por Fisher
Micromanipulador	Instrumentación Científica Aplicada	MMPI-3
Extractor de agujas	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 microscopio fluorescente	Olympus	MVX-10
P200 punta	Fishersci marca	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	vendido por Fisher
Placa de Petri	Corning	SB93102	vendido por Fisher
Pipeta de plástico	marca Fishersci	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Picobomba neumática	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche producto fabricado por Sigma- vendido por Fisher
Hoja de afeitar	Fishersci marca	12-640
SZ51 microscopio de disección	Olympus	SZ51
Tricaine metanosulfonato	Western Chemicals NC0872873		vendido por Fisher
Tripsina-EDTA	Corning	MT25053CI	vendido por Fisher
Tweezer	Fishersci marca	12-000-122