Descrito aquí es un método para utilizar embriones de pez cebra para estudiar la capacidad de las nanopartículas funcionalizadas para atacar las células cancerosas humanas in vivo. Este método permite la evaluación y selección de nanopartículas óptimas para futuras pruebas en animales grandes y en ensayos clínicos.
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Artículo de método
In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish
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Resumen
Resumen
Desarrollar nanopartículas capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés en el campo de la nanomedicina. Los modelos animales in vivo son necesarios para unir la nanotecnología a su aplicación biomédica. El ratón representa el modelo animal tradicional para las pruebas preclínicas; sin embargo, los ratones son relativamente caros de mantener y tienen ciclos experimentales largos debido a la limitada progenie de cada madre. El pez cebra ha surgido como un potente sistema modelo para la investigación del desarrollo y la biomédica, incluida la investigación del cáncer. En particular, debido a su transparencia óptica y rápido desarrollo, los embriones de pez cebra son muy adecuados para el monitoreo in vivo en tiempo real del comportamiento de las células cancerosas y sus interacciones con su microambiente. Este método fue desarrollado para introducir secuencialmente células cancerosas humanas y nanopartículas funcionalizadas en embriones transparentes de pez cebra Casper y monitorear el reconocimiento in vivo y la focalización de las células cancerosas por nanopartículas en tiempo real. Este protocolo optimizado muestra que las nanopartículas con etiqueta fluorescente, que están funcionalizadas con grupos de folatos, pueden reconocer y atacar específicamente las células de cáncer epiteliales humanos metastásicos etiquetadas con un fluorocromo diferente. El proceso de reconocimiento y focalización puede ocurrir tan pronto como 30 min postinjection de las nanopartículas probadas. Todo el experimento sólo requiere la cría de unos pocos pares de peces adultos y tarda menos de 4 días en completarse. Además, los embriones de pez cebra carecen de un sistema inmunitario adaptativo funcional, lo que permite el injerto de una amplia gama de células cancerosas humanas. Por lo tanto, la utilidad del protocolo descrito aquí permite la prueba de nanopartículas en varios tipos de células cancerosas humanas, facilitando la selección de nanopartículas óptimas en cada contexto específico del cáncer para futuras pruebas en mamíferos y la clínica.
Introducción
El desarrollo de nanopartículas que son capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés tanto para los físicos como para los investigadores biomédicos. La aparición de nanomedicina condujo al desarrollo de varias nanopartículas, como las conjugadas con ligandos de orientación y/o fármacos quimioterápicos1,,2,,3. Las propiedades añadidas de las nanopartículas permiten su interacción con el sistema biológico, la detección y el seguimiento de eventos biológicos con alta eficiencia y precisión junto con aplicaciones terapéuticas. Las nanopartículas de oro y óxido de hierro se utilizan principalmente en aplicaciones de tomografía computarizada y resonancia magnética, respectivamente. Mientras que las actividades enzimáticas de las nanopartículas de oro y óxido de hierro permiten la detección de células cancerosas a través de ensayos colorimétricos, las nanopartículas fluorescentes son adecuadas para aplicaciones de imágenes in vivo4. Entre ellas, las nanopartículas fluorescentes ultrabright son particularmente beneficiosas, debido a su capacidad para detectar cánceres a tiempo con menos partículas y toxicidades reducidas5.
A pesar de estas ventajas, las nanopartículas requieren experimentación utilizando modelos animales in vivo para la selección de nanomateriales adecuados y la optimización del proceso de síntesis. Además, al igual que los medicamentos, las nanopartículas se basan en modelos animales para pruebas preclínicas para determinar su eficacia y toxicidades. El modelo preclínico más utilizado es el ratón, que es un mamífero cuyo mantenimiento tiene un costo relativamente alto. Para los estudios de cáncer, ya sea ratones genéticamente diseñados o ratones xenoinjertados se utilizan típicamente6,7. La duración de estos experimentos a menudo abarca de semanas a meses. En particular, para los estudios de metástasis del cáncer, las células cancerosas se inyectan directamente en el sistema circulatorio de los ratones en lugares como las venas de cola y el bazo8,,9,10. Estos modelos sólo representan las etapas finales de la metástasis cuando las células tumorales extravasan y colonizan órganos distantes. Además, debido a problemas de visibilidad, es particularmente difícil monitorear la migración de células tumorales y la focalización de nanopartículas de las células tumorales en ratones.
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un potente sistema de vertebrados para la investigación del cáncer debido a su alta fecundidad, bajo costo, desarrollo rápido, transparencia óptica, y conservaciones genéticas11,12. Otra ventaja del pez cebra sobre el modelo de ratón es la fertilización de los huevos de pescado ex utero, que permite controlar los embriones durante todo su desarrollo. El desarrollo embrionario es rápido en el pez cebra, y dentro de las 24 horas de postfertilización (hpf), el plano del cuerpo vertebrado ya ha formado13. A los 72 hpf, los huevos son incubados de la coral, pasando de la etapa embrionaria a la etapa de alevines. La transparencia del pez cebra, la cepa Casper en particular14, ofrece una oportunidad única para visualizar la migración de las células cancerosas y su reconocimiento y focalización por nanopartículas en un animal vivo. Finalmente, el pez cebra desarrolla su sistema inmunológico innato en 48 hpf, con el sistema inmune adaptativo rezagado y sólo se vuelve funcional a los 28 días de postfertilización15. Esta brecha de tiempo es ideal para el trasplante de varios tipos de células cancerosas humanas en embriones de pez cebra sin experimentar rechazos inmunes.
Aquí se describe un método que aprovecha la transparencia y el rápido desarrollo del pez cebra para demostrar el reconocimiento y la focalización de las células cancerosas humanas mediante nanopartículas fluorescentes in vivo. En este ensayo, se inyectaron células de cáncer de cuello uterino humano (células HeLa) genéticamente diseñadas para expresar una proteína fluorescente roja en el área vascularizada en la cavidad perivitellina de 48 hpf embriones. Después de 20-24 h, las células de HeLa ya se habían diseminado por los embriones a través del sistema circulatorio de peces. Los embriones con metástasis aparente se inyectaron microincisiones con 0,5 nL de una solución de nanopartículas directamente detrás del ojo, donde se encuentra el rico lecho capilar. Usando esta técnica, las nanopartículas fluorescentes ultrabright de sílice pueden apuntar a las células de HeLa tan rápido como 20-30 min postinjection. Debido a su simplicidad y eficacia, el pez cebra representa un modelo in vivo robusto para probar una variedad de nanopartículas por su capacidad para atacar células cancerosas específicas.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Escuela de Medicina de la Universidad de Boston bajo el protocolo : PROTO201800543.
1. Generación de embriones de pez cebra Casper
- Elija peces Casper adultos que tienen al menos 3 meses de edad para la cría natural para generar embriones transparentes de pez cebra Casper.
- Llenar tanques de apareamiento de dos cámaras con agua de pescado por la noche, separar los tanques superiores usando divisores, colocar un pez macho en un lado de la cámara y uno o dos peces hembra en el otro lado de la cámara, y dejar el pez separado durante la noche por divisores.
- Saca los divisores a la mañana siguiente a las 8:00 AM cuando las luces estén encendidas. Agregue plantas de enriquecimiento artificial e incline ligeramente la cámara superior para crear un área poco profunda de agua. Dejar que el pescado se reproduzca durante 3-4 h.
- Levante las cámaras superiores de los tanques de apareamiento que contienen los peces y devuélvalos a sus tanques originales.
- Recoger los huevos situados en las cámaras inferiores vertiendo el agua a través de una red de malla. Transfiera los huevos a un plato estéril de Petri a una densidad no superior a 200 huevos por plato. Retire los huevos muertos o no fecados y llene el plato 2/3 lleno de agua dulce de pescado.
NOTA: Los huevos fertilizados y sanos deben ser translúcidos y redondos. Los huevos que estén nublados, blancos o desfigurados deben eliminarse. El agua de pescado se obtiene de las peceras en la instalación de peces. - Incubar embriones en la incubadora a 28,5 oC durante la noche.
- Blanquear los embriones a la mañana siguiente utilizando el protocolo estándar como se describe en el Zebrafish Book16, y volver a colocar los embriones en la incubadora (paso opcional).
- Saque los embriones de 24 hpf de la incubadora por la tarde y descorte los embriones con pronasa.
- Retire la mayor cantidad de agua de pescado posible de los embriones en el plato Petri y agregue unas gotas de la solución pronasa (1 mg/ml en agua de pescado) al plato. Revuelva suavemente el plato de Petri. Una vez que los coros muestran signos de desintegración, pipetear los embriones hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para descomponer los coros para liberar los embriones.
- Agregue agua fresca de pescado inmediatamente en el plato Petri para terminar el proceso una vez que la mayoría de los embriones estén fuera de los coros. Enjuague los embriones 3 veces más usando agua de pescado para eliminar los coros flotantes. Devuelva los embriones a la incubadora.
2. Preparación de células cancerosas humanas para trasplante
- Ajuste la temperatura de la incubadora a exactamente 35,5 oC. Monitoree la incubadora para asegurar una temperatura consistente y estable utilizando un termómetro dentro de la incubadora.
- Autoclave 1 L de agua de pescado en una botella de vidrio. Haga una solución de agarosa al 3% añadiendo 3 g de agarosa de grado electroforesis a 100 ml de agua de pescado autoclave y microwaving hasta que la agarosa se disuelva por completo.
- Vierta la solución de agarosa caliente en un plato de Petri hasta que esté llena 3/4. Coloque el molde de microinyección en la agarosa. Asegúrese de que el molde no esté en contacto con la parte inferior de la placa Petri y que no se formen burbujas debajo.
- Deje que la solución se solidifique y retire cuidadosamente el molde de la placa. Llene el plato con agua de pescado autoclavizada y almacene la placa a 4 oC. Precalienta la placa de agarosa y el agua de los peces en la incubadora de 35,5 oC antes de cosechar las células de HeLa.
- Tire de los capilares de vidrio borosilicato de 1,0 mm D. x 0,78 mm en un tirador de pipetas utilizando los siguientes ajustes: presión a 500, calor a 560, tracción a 100, velocidad a 100 y tiempo/retardo a 200. Almacene las agujas en la masilla en un plato grande de Petri que haya sido limpiado con una toalla de etanol.
ADVERTENCIA: Las agujas tiradas son muy afiladas y frágiles. Tenga cuidado al manipular. - Preparar una solución de material de metanesulfonato tricaine (MS222, 4 mg/ml) disolviendo MS222 en agua de pescado autoclaved. Vortex mucho antes de su uso. Diluir la solución de stock MS222 1:100 en agua de pescado (es decir, añadir 200 l de solución de serie MS222 a 20 ml de agua de pescado a una concentración final de 40 g/ml) para anestesiar embriones para los siguientes procedimientos.
- Cultivo hLabel HeLa células transduciéndolas con PLenti6.2_miRFP670 lentivirus utilizando el protocolo descrito17. Cosechar células de HeLa RFP+ 30 min-1 h antes del trasplante.
NOTA: Las células hela humanas se han cultivado en una incubadora de cultivo de tejidos de hasta un 70% de confluencia en medio de crecimiento completo (medio DMEM con 10% DE FBS) a 37 oC complementado con 5% de CO2.- Retire el medio celular HeLa por aspiración en una capucha de cultivo de tejido. Enjuague brevemente la capa celular con PBS estéril para eliminar todos los restos del suero.
- Añadir 3,0 ml de solución estéril de Trippsina-EDTA a un matraz T-75 y volver a colocar las células en la incubadora de cultivo de tejido de 37oC durante 3-5 min para facilitar la digestión enzimática. Observar el matraz bajo el microscopio hasta que se suspenda el 80 % de las células.
- Añadir 6-8 ml de medio de crecimiento completo en el matraz. Recoger las células en un tubo estéril de 15 ml por pipeteo suavemente. Centrífuga a 135 x g durante 5 min.
- Aspirar las células HeLa sobrenadantes y resuspendidas en 3 ml de medio de crecimiento completo. Repita el paso de lavado 2x anterior. Resuspender las células en 1 ml de medio de crecimiento completo y contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocicómetro.
- Gire las células hacia abajo de nuevo, retire el sobrenadante y resuspendir las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a una concentración de 5 x 107 células/ml. Mantenga las células calientes sosteniendo el tubo en una mano cuando se transporta a la instalación de peces.
NOTA: Mantenga siempre las células calientes almacenando las células dentro de la incubadora de 35,5 oC antes o durante la inyección de los embriones.
3. Trasplante de células cancerosas humanas
- Limpie el área de trabajo con toallas de etanol antes del trasplante (por ejemplo, tijeras, pinzas, pipetas de plástico, cuchillas de afeitar).
- Alinee los embriones dentro de las ranuras de la placa de agarosa utilizando una pipeta de plástico. Poner embriones en el lado con la parte anterior hacia adelante.
NOTA: Asegúrese de que el agua del pescado cubra los embriones. Deja a un lado algunos embriones para no inyectar células cancerosas y usarlas como controles. - Encienda la fuente de aire y el microinyector. Saque las células HeLa de la incubadora y pipetee las células hacia arriba y hacia abajo 20-30x usando una punta P200. Cargue 3 l de mezcla celular inmediatamente en una aguja utilizando una punta de carga de gel con un extremo cortado. Inserte cuidadosamente la punta hacia el extremo inferior afilado de la aguja. Si es necesario, agitar la aguja para asegurarse de que la mezcla celular se mueve por la aguja para llenar el extremo afilado.
- Inserte la aguja en el soporte de la aguja. Use un par de pinzas para abrir cuidadosamente la punta de la aguja. Ajuste la presión y la duración del tiempo en el microinyector para expulsar todas las burbujas de aire dentro de la punta de la aguja. Reduzca la presión y el tiempo de duración de la inyección hasta que el tamaño de las gotas de inyección sea de 1 nL.
- Coloque la placa de inyección debajo del microscopio en una posición adecuada para tener el lado de la yema de los embriones frente a la aguja. Anestesar los embriones añadiendo cinco gotas de la solución MS222 diluida (40 g/ml).
- Coloque el inyector y deje que la aguja toque la cavidad de la perivitellina de cada embrión.
- Inyectar la mezcla celular en los embriones en el área vascularizada bajo la cavidad de la perivitellina presionando el pedal.
- Utilice la mano nonteminante para mover la placa de inyección al siguiente embrión. Utilice la mano dominante para extender y retraer el inyector mientras presiona el pedal simultáneamente para continuar con la inyección. Pipetear unas gotas de agua estéril de pescado en embriones que se han inyectado. Una vez completada la inyección de todos los embriones en la placa, lave los embriones con agua estéril de pescado, colóquelos en un plato estéril de Petri y muévalos inmediatamente a la incubadora de 35,5 oC.
- Después de 3 h, examine los embriones inyectados y retire los muertos.
- Devolver los embriones vivos a la incubadora de 35,5 oC e incubarlos durante 20-24 h para permitir que las células de HeLa se propaguen desde el lugar de inyección a otras partes del cuerpo.
NOTA: Los embriones se mantienen en una incubadora de 35,5 oC para permitir la supervivencia y la migración de las células cancerosas humanas porque las células no funcionan bien a 28,5 oC, la temperatura de los embriones de peces normalmente se incuban.
4. Inyección de nanopartículas o vehículo
- Anesthetizar los embriones trasplantados a la mañana siguiente con cinco gotas de solución MS222 diluida. No agregue demasiado MS222, porque esto matará a los embriones. Bajo un microscopio fluorescente, recoge cuidadosamente embriones con metástasis de cola de células DE HeLa RFP+ y colóllalos en un nuevo plato de Petri con agua estéril de pescado.
- Haga las agujas de inyección como se describió anteriormente en la sección 2 utilizando los siguientes ajustes: presión a 500, calor a 645, tracción a 60, velocidad a 50 y tiempo/retardo a 100.
- Siga los procedimientos descritos en los pasos 3.1-3.3 para alinear embriones y cargar el vehículo (por ejemplo, H2O) o la solución de nanopartículas en la aguja.
- Inyectar 0,5 nL de 1 mg/ml de solución de nanopartículas detrás del ojo y continuar la inyección como se describe en los pasos 3.5-3.6 (Figura 1B). Esta ubicación detrás de los ojos está enriquecida con capilares, permitiendo que las nanopartículas entren en circulación.
- Tras un procedimiento similar, inyectar el vehículo (por ejemplo, H2O) que se utilizó para suspender las nanopartículas en embriones con células HeLa trasplantadas y aquellos sin (es decir, controles)(Figura 1A, C).
- Incubar todos los embriones inyectados a 35,5 oC.
5. Imágenes y seguimiento de nanopartículas y células cancerosas
- Examine los embriones inyectados bajo un microscopio fluorescente a 0, 30, 60, 90, 120, 180 y 210 min después de la inyección de nanopartículas para monitorear su distribución en circulación y el grado de apuntamiento de células cancerosas. La focalización de las células cancerosas por nanopartículas se puede observar tan pronto como 30 min postinjection dependiendo del tipo de nanopartícula probada.
- Pipetear 2-3 embriones en un plato de Petri e inmovilizarlos añadiendo cinco gotas de solución MS222 diluida (40 g/ml). Una vez que los embriones dejen de nadar, retire la mayor parte del agua para permitir que los embriones se recuestrán en sus lados.
- Utilice una pipeta con un cepillo delgado y suave unido a su extremo para alinear los embriones de modo que se recuestron en sus lados con la cara anterior hacia adelante y sólo un ojo visible.
- Imagen de los embriones en canales rojo, azul y de campo brillante a baja ampliación (2x) para capturar todo el embrión y repetir en mayor aumento (6.4x) para capturar el área de la cola. Enfoque el embrión bajo el canal rojo para evitar el sangrado de nanopartículas.
NOTA: Los embriones no deben moverse durante la toma de imágenes. Cualquier movimiento dará lugar a imágenes borrosas y la incapacidad de superponer imágenes de diferentes canales. - Agregue agua fresca de pescado a los embriones inmediatamente después de la toma de imágenes y vuelva a la incubadora. Repita los pasos 5.2-5.4 para tomar imágenes de los embriones en diferentes puntos de tiempo.
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Resultados
El esquema de protocolo de la Figura 1 ilustra los procedimientos generales para este estudio. Se criaron peces adultos transparentes de Casper y hembras para generar embriones (sección 1). Las células HeLa RFP+ se inyectaron en el área vascularizada bajo la cavidad perivitelina de los embriones de pez cebra a 48 cvf, con embriones no inyectados como controles (sección 3). Para los individuos con experiencia en microinyección, la tasa de supervivenci...
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Discusión
El protocolo descrito aquí utiliza el pez cebra como un sistema in vivo para probar la capacidad de las nanopartículas para reconocer y atacar las células de cáncer humano metastásicas. Varios factores pueden afectar a la ejecución exitosa de los experimentos. En primer lugar, los embriones deben desarrollarse completamente a 48 cvf. La correcta etapa de desarrollo de los embriones les permite soportar y sobrevivir al trasplante de células cancerosas humanas. Los embriones menores de 48 hpf tienen una tasa de supervivenc...
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Divulgaciones
I.S. declara interés en NanoScience Solutions, LLC (receptor de la subvención STTR NIH R41AI142890). Todos los demás autores no declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Sra. Kaylee Smith, a la Sra. Lauren Kwok y al Sr. Alexander Floru por revisar el manuscrito. H.F. reconoce el apoyo otorgado por el NIH (CA134743 y CA215059), la Sociedad Americana contra el Cáncer (RSG-17-204 01-TBG) y la Fundación St. Baldrick. F.J.F.L. reconoce una beca del Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S reconoce la ayuda NSF (concesión CBET 1605405) y NIH R41AI142890.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Capilares de vidrio de borosilicato | World Precision Instruments | 1,0 mm D.E. x 0,78 mm | |
| Ordenador y monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | vendido por Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Incubadora de peces | VWR | 35960-056 | |
| Hemocitómetro | Fishersci marca | 02-671-51B | |
| Soporte magnético | World Precision Instruments | M10 | |
| Punta de microcargador | Eppendorf | E5242956003 | vendido por Fisher |
| Micromanipulador | Instrumentación Científica Aplicada | MMPI-3 | |
| Extractor de agujas | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 microscopio fluorescente | Olympus | MVX-10 | |
| P200 punta | Fishersci marca | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | vendido por Fisher |
| Placa de Petri | Corning | SB93102 | vendido por Fisher |
| Pipeta de plástico | marca Fishersci | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Picobomba neumática | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche producto fabricado por Sigma- vendido por Fisher |
| Hoja de afeitar | Fishersci marca | 12-640 | |
| SZ51 microscopio de disección | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine metanosulfonato | Western Chemicals NC0872873 | vendido por Fisher | |
| Tripsina-EDTA | Corning | MT25053CI | vendido por Fisher |
| Tweezer | Fishersci marca | 12-000-122 |
Referencias
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