Inducción de lesión cerebral axonal difusa en ratas basada en aceleración rotacional

La lesión cerebral traumática (TBI, por sus) es una de las principales causas de muerte y discapacidad en los Estados Unidos. Los TMI contribuyen a aproximadamente el 30% de todas las muertes relacionadas con lesiones^1,2. Las principales causas de TBI difieren entre grupos de edad e incluyen caídas, colisiones de alta velocidad durante los deportes, autolesiones intencionales, accidentes automovilísticos y asaltos^1,2,3.

La lesión axonal difusa cerebral (DAI) es un tipo específico de TBI inducida por la aceleración rotacional, temblores o lesiones por explosión del cerebro resultantes del movimiento sin restricciones de la cabeza en el instante después de la lesión^4,5,6,7,8. DAI implica un daño axonal generalizado que conduce a un deterioro neurológico duradero que se asocia con un mal resultado, costos de atención de la salud gravosos, y una tasa de mortalidad del 33-64%^{1,2,4,5,9,10,11}. A pesar de importantes investigaciones recientes sobre la patogénesis de DAI, no ha habido un consenso sobre las mejores opciones de tratamiento^11,12,13,14.

En las últimas décadas, numerosos modelos experimentales han intentado replicar con precisión diferentes aspectos de DAI^11,,12,15,16. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones dada la presentación única de DAI en comparación con otras lesiones focales. Estos modelos anteriores no sólo causan lesiones axonales en regiones de materia blanca, sino que también resultan en lesiones cerebrales focales. Clínicamente, DAI va acompañado de micro hemorragias, que pueden constituir una causa importante de daño a la materia blanca.

Sólo se ha demostrado que dos modelos animales replican las características clínicas clave de DAI. Gennarelli y sus colegas produjeron el primer dispositivo de rotación de cabeza lateral en 1982, utilizando la aceleración rotacional de la cabeza sin impacto para inducir coma con DAI en un primate no humano modelo^15. Este modelo de primate empleó una sola rotación controlada para la aceleración y desaceleración para desplazar la cabeza a través de 60o dentro de 10-20 ms. Esta técnica fue capaz de emular la conciencia deteriorada y el daño axonal generalizado que se asemejaba a los efectos de la TBI grave observada en el cerebro humano. Sin embargo, los modelos de primates son muy caros^4,11,16. Basado en parte en el modelo anterior, un modelo porcino de lesión cerebral de aceleración rotacional fue diseñado en 1994 (Ross et al.) con resultados similares¹⁴.

Estos dos modelos animales, aunque produjeron diferentes presentaciones de patología típica, han añadido en gran medida a los conceptos de patogénesis DAI. La rotación rápida de la cabeza es generalmente aceptada como el mejor método para inducir DAI, y los roedores proporcionan un modelo menos costoso para los estudios de rotación rápida de la cabeza^11,16. Aquí, validamos un modelo de roedor simple, reproducible y confiable de DAI que causa daños generalizados en la materia blanca sin fracturas de cráneo o contusiones. Este modelo actual permitirá una mejor comprensión de la fisiopatología de la DAI y el desarrollo de tratamientos más eficaces.

Los experimentos se realizaron siguiendo las recomendaciones de las Declaraciones de Helsinki y Tokio y de las Directrices para el Uso de Animales Experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev.

1. Preparación de ratas para el procedimiento experimental

NOTA: Seleccione ratas macho adultas Sprague-Dawley que pesen 300-350 g.

1. Obtener la aprobación para la realización de estos experimentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal.
2. Mantener las ratas a una temperatura ambiente de 22 oC, con ciclos de luz de 12 horas y 12 horas de oscuridad. Proporcione comida para ratas y agua ad libitum.
3. Realice todos los experimentos entre las 6:00 a.m. y las 12:00 p.m.
4. Utilice un sistema de administración continua de isoflurano para inducir anestesia. Asegúrese de que el sistema de vaporizador esté lleno de isoflurano.
   1. Anestesiar a las ratas con 2% de isoflurano.
   2. Confirme que la rata está completamente anestesiada observando una falta de movimiento o reflejo del pedal en respuesta a un estímulo externo.

2. Inducción de lesiones axonales difusas

NOTA: El dispositivo consta de los siguientes componentes: 1) cilindro de plástico transparente, 2) peso de hierro (1308 g), 3) mecanismo de rotación que consta de un tubo cilíndrico, dos rodamientos sobre los cuales gira el eje y una fijación de la cabeza (para pasadores de oído); 4) plataforma horizontal en la que se fijan dos rodamientos.

1. Coloque el dispositivo en una mesa de laboratorio pesada y estable.
2. Fije el peso a una cuerda que esté elevada a una altura de 120 cm.
3. Permita que el peso que cae libremente golpee el perno, activando el mecanismo de rotación. Usando el dispositivo de rotación lateral de la cabeza, la cabeza del roedor se gira rápidamente de 0 a 90o.
4. Después de la inducción de una lesión cerebral axonal difusa, transfiera la rata a una sala de recuperación.

3. Medición de la cinemática rotacional/parámetros biomecánicos.

1. Mida la cinemática rotacional/los parámetros biomecánicos de la siguiente manera:
   
   
   
   donde F_o - fuerza aplicada a la cabeza de animal (kg); M – momento de fuerza; K – energía cinética; m – masa de la caída de peso; g - aceleración gravitacional; h – altura (cm); D – distancia entre los pasadores auditivos (cm).
   NOTA: Para calcular la fuerza aplicada a la cabeza del animal (F_o), es necesario conocer la masa del peso que cae, la altura a la que cae el peso y la distancia entre los pasadores auditivos. Los demás parámetros permanecen sin cambios.

4. Evaluación de la puntuación de gravedad neurológica después de 48 horas

NOTA: Los déficits neurológicos se evaluaron y calificaron utilizando una puntuación de gravedad neurológica, como se describió anteriormente^17,18,19. Las alteraciones en la función motora y el comportamiento se evalúan mediante un sistema puntual de tal manera que una puntuación máxima de 24 representa una disfunción neurológica grave. Una puntuación de 0 indica el estado neurológico intacto. Se evalúan las siguientes funciones de comportamiento.

1. Evalúe la incapacidad de la rata para salir de un círculo (50 cm de diámetro) cuando se deja en su centro. Realice esto para tres sesiones individuales que duran 30 min, 60 min y más de 60 min.
2. Pruebe la rata para una pérdida de reflejo de corrección en tres sesiones que duran 20 min, 40 min y más de 60 min.
3. Realizar la prueba de hemiplejía, la incapacidad de la rata para resistir los cambios forzados en la posición.
4. Levante la rata por su cola para probar la flexión de la extremidad posterior.
5. Coloque la rata en el suelo para probar su capacidad para caminar recto.
6. Prueba de tres reflejos separados: el reflejo pinna, el reflejo corneal y el reflejo de sobresalto.
7. Califique a la rata con un grado clínico basado en la pérdida de comportamiento de búsqueda y la postración.
8. Pruebe los reflejos de las extremidades para la colocación. Realice la prueba en las extremidades delanteras izquierda y derecha, y luego en las extremidades posteriores izquierda y derecha.
9. Realice una prueba funcional a través de la tarea de equilibrio de haz. La viga debe medir 1,5 cm de ancho. Ejecute la prueba para sesiones de 20 s, 40 s y más de 60 s.
10. Realizar prueba de caminar de haz en la rata con vigas de tres anchuras diferentes: 8,5 cm de ancho, 5 cm de ancho y 2,5 cm de ancho.

5. Recolección de cerebros para el examen histológico después de 48 horas

1. A las 48 horas después de la lesión, eutanasia a las ratas reemplazando su mezcla de gas inspirada por 20% O₂/80% CO₂. Asegúrese de que el_CO2 se entregue a una tarifa predeterminada de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
   1. Asegurar la confirmación de la muerte de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
2. Perfumar transcardiacamente la rata con solución salina heparinizada al 0,9% a temperatura de 4 oC, seguida de 500 ml de paraformaldehído al 4% en solución salina tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4).
3. Después de la perfusión, realizar la decapitación con una guillotina.
4. Realizar la recolección del cerebro mediante la eliminación de las calvarias con fórceps de corte óseo para evitar dañar el tejido cerebral.
5. Retire el cerebro inmediatamente y retírelo en una solución de formaldehído tampón del 4% durante 48 h a 4 oC.
6. Bloquear cerebros en secciones coronales de 5 mm desde la cara de la bombilla olfativa hasta la corteza visual y cerebelos y tallos cerebrales bisectas.
7. Después de la incrustación de parafina, corte las secciones coronales y sagitales (5 m) lejos del tálamo mediante la sección de microtomos.

6. Tinción y examen inmunoquímicos

1. Coloque suavemente las rodajas en los portaobjetos de vidrio con un cepillo suave, 1 rebanada por diapositiva.
2. Producir tinción inmunoquímica de la APP.
   1. Desparaffinizar rodajas con xileno (3 veces para 5 min cada una) y rehidratar con concentraciones de etanol gradualmente reducidas a temperatura ambiente: 3 min en 100% etanol dos veces, 3 min en 95% etanol dos veces, 3 min en 90% etanol, 3 min en 70% etanol, y 3 min en DDW.
   2. Tratar las secciones cerebrales desparafinas y rehidratadas con 3% H₂O₂ durante 15 min a temperatura ambiente para bloquear la actividad endógena de peroxidasa.
   3. Incubar secciones con citrato sódico de 0,01 M (pH 6,0) a 98 oC durante 5 min para la recuperación de antígenos.
   4. Mantenga las diapositivas en el búfer durante 20 minutos a temperatura ambiente para enfriar.
   5. Lave las secciones con solución salina con fosfato (PBS) dos veces durante 5 min.
   6. Bloquear las secciones con un 2,5% de suero de caballo normal durante 1 h a temperatura ambiente e incubar durante la noche a 4oC en el conejo primario anti-APP (1:4000) diluido en el suero de bloqueo.
   7. Después de la incubación en anticuerpos primarios, lave las secciones en PBS a temperatura ambiente.
   8. Incubar secciones en anticuerpos secundarios biotinylados adecuadamente diluidos durante 15 minutos y lavar con PBS durante 3 minutos dos veces a temperatura ambiente.
   9. Incubar en estreptavidina-peroxidasa durante 15 minutos y lavar de nuevo en PBS durante 3 minutos dos veces a temperatura ambiente.
   10. Incubar secciones con solución de sustrato tamponado (pH 7.5) que contenga peróxido de hidrógeno y solución cromática de 3,3-diaminobenzidina y proteger de la luz hasta que se desarrolle el color.
   11. Incubar los portaobjetos con DDW a temperatura ambiente durante 5 min para detener la reacción.
   12. Secciones de contramancha con hematoxilina durante 3 minutos a temperatura ambiente y lavar durante 5 minutos con agua del grifo que fluye.
   13. Deshidratar los portaobjetos con concentraciones graduales de etanol a temperatura ambiente: 2 min en DDW, 2 min en 70% etanol, 2 min en 90% etanol, 2 min en etanol 95%, 2 min en 100% etanol, y 3 min en xileno tres veces.
   14. Secar y montar con medio de montaje.
3. Examine las rodajas bajo aumento del microscopio de 200x con una lente objetivo de 20 mm utilizando un microscopio.

La Tabla 1 ilustra la línea de tiempo del protocolo. La tasa de mortalidad en este modelo de DAI fue del 0%. Una prueba de Mann-Whitney indicó que el déficit neurológico era significativamente mayor para las 15 ratas DAI en comparación con las 15 ratas falsas a las 48 horas siguientes a la intervención (Mdn 1 frente a 0), U a 22,5, p < 0,001, r a 0,78 (véase el Cuadro 2). Los datos se miden en recuentos y se presentan como mediana y rango de percentiles de 25 a 75.

Fotomicrografías representativas de secciones talámicas del tejido cerebral se muestran en la Figura 1. Los fotomicrografías revelaron inmunoresiones axonales y neuronales de APP tras un DAI aislado en ratas 48 horas después de una lesión en comparación con el grupo de control (67,46 a 30 contra 0 a 0), U a 0, p < 1,1E-06, r a 0,92. Los datos se miden como recuentos y se presentan como medias sd.

Tabla 1: Demostración de la línea de tiempo del protocolo. Los diferentes grupos de ratas en diferentes momentos se muestran: DAI - Lesión cerebral axonal difusa al comienzo del experimento; A las 48 horas, se determinó una puntuación de gravedad neurológica y se realizó una tinción inmunoquímica de la APP en ambos grupos.

Tabla 2: Puntuación de gravedad neurológica. Déficit neurológico 48 horas después de DAI para 2 grupos de estudio. Una prueba de Mann-Whitney indicó que el déficit neurológico era significativamente mayor para las 15 ratas DAI en comparación con las 15 ratas falsas a las 48 horas siguientes a la intervención (Mdn 1 frente a 0), U a 22,5, p < 0,001, r a 0,78. Los datos se miden en recuentos y se presentan como mediana y rango de percentiles de 25 a 75.

Figura 1: Examen inmunoquímico. Los fotomicrografías representativas de las secciones talámicas del tejido cerebral revelaron inmunorreactividades axonales y neuronales después de un DAI aislado en ratas (B) 48 horas después de una lesión en comparación con el grupo de control (A). La inmunoreactividad de APP se detectó en la región de interés en las 15 ratas DAI, y en absoluto en ninguna de las ratas que funcionan con las estafas. La prueba de Mann-Whitney indicó que el número de axones positivos de la APP era significativamente mayor para 15 ratas DAI que para los animales heridos de estafa a 48 horas después de DAI (67,46 a 30 contra 0 a 0), U a 0, p < 1,1E-06, r a 0,92. Las imágenes están en el aumento original * 200. Los datos se miden como recuentos y se presentan como media sd. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.