Descrito es un método de ahorro de tiempo y espacio para contar los huevos y determinar las tasas de eclosión de mosquitos individuales utilizando 24 placas de cultivo de tejido de pozos, lo que puede aumentar sustancialmente la escala y la velocidad de los ensayos de fecundidad y fertilidad.
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Artículo de método
Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)
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Resumen
Resumen
Los mosquitos representan un importante problema de salud pública como vectores de diversos patógenos. Para aquellos estudios que requieren una evaluación de los parámetros de aptitud de los mosquitos, en particular la producción de huevos y las tasas de eclosión a nivel individual, los métodos convencionales han puesto una carga sustancial en los investigadores debido a la alta intensidad de mano de obra y los requisitos de espacio de laboratorio. Descrito es un método simple que utiliza la placa de cultivo de tejido de 24 pozos con agarosa en cada pozo y la proyección de imagen digital de cada pozo para determinar números del huevo y índices de la eclosión en un nivel individual con requisitos substancialmente reducidos del tiempo y del espacio.
Introducción
El control de los mosquitos para proteger a los seres humanos de los patógenos transmitidos por vectores es un objetivo importante de salud pública, principalmente debido a la falta de vacunas efectivas para la mayoría de los patógenos transportados por los mosquitos. Muchos estudios tienen como objetivo reducir la aptitud de los mosquitos junto con una estrategia de reducción de la población aplicable en el campo1,2,3. Esto incluye amplios estudios para crear mosquitos transgénicos y/o líneas de knockout CRISPR/Cas9. Estos enfoques de modificación de la población requieren una evaluación detallada de los parámetros individuales de aptitud4. Las técnicas de laboratorio convencionales para evaluar la aptitud de los mosquitos hembra incluyen la contención individual de mosquitos hembra apareados y alimentados con sangre en contenedores de 100 mL5,tubos cónicos modificados de 50 mL, o tubos para la cría de Drosophila modificados mediante el suministro de superficies húmedas utilizando discos húmedos de algodón y papel de filtro para la oviposición (es decir, papeles de huevo)1,2,6,7. Tales métodos requieren un espacio relativamente grande (por ejemplo, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H para hasta 100 tubos de Drosophila) (Figura 1),y la manipulación de papeles de huevo individuales para contar huevos y larvas de eclosión, que pueden ser intensivos en mano de obra. Este manuscrito presenta un método para contar los huevos de mosquitos y determinar las tasas de eclosión utilizando 24 placas de pozos y agarosa como superficie de oviposición para evitar estos problemas8.
Simultáneamente, Ioshino et al.9 describieron un método detallado utilizando placas de 12 y 24 pozos para realizar el conteo de huevos obtenidos de hembras individuales. Su protocolo representó una mejora significativa de los métodos convencionales en el ahorro de tiempo y espacio9. Sin embargo, el protocolo que describieron continúa utilizando papel de filtro húmedo como superficie para la oviposición, lo que requiere desplegar cada papel individual para obtener recuentos, ya que los huevos a menudo se encuentran debajo o en pliegues. Su protocolo tampoco incluyó el uso de tecnologías de imágenes o un método para el conteo de larvas.
Se presenta un método mejorado para realizar ensayos de aptitud para el número de huevos (es decir, fecundidad) y la tasa de eclosión (es decir, fertilidad) utilizando agarosa como superficie de oviposición en un formato de placa de cultivo de tejido de 24 pozos para Ae. aegypti que oviposita en superficies húmedas. Estas placas fueron nombradas placas "EAgaL", de Egg, Agarose, y Larva. Estas placas de 24 pozos proporcionan a los mosquitos individuales una superficie mínima para poner huevos, simplificando y reduciendo drásticamente el tiempo y el esfuerzo necesarios para contar y mantener los huevos y las larvas eclosionadas durante unos días. La placa EAgaL utiliza agarosa translúcida para la superficie de oviposición, lo que elimina la necesidad de manipular papeles de huevo y encontrar los huevos y larvas cuando eclosionan; fotografiar cada pozo establece un registro archivado a largo plazo de los resultados y separa el proceso de conteo tanto en tiempo como en espacio del proceso de cría / manipulación, donde el tiempo a menudo es limitado.
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Protocolo
1. Preparación de placas
- Perforar agujeros en 24 tapas de placas de cultivo de tejido de pozos (4−6 agujeros por pozo) utilizando un taladro doméstico con una broca de ~ 1,6 mm (1/16 pulgadas) (Figura 2).
NOTA: Estos agujeros evitan que la condensación de agua de la agarosa se acumule en la tapa, donde los mosquitos pueden poner huevos. El tamaño estándar de la hembra Ae. aegypti ("cepa Liverpool") es de ~ 3,11 mm de envergadura. Se recomienda reducir el tamaño de los agujeros cuando se usan mosquitos más pequeños para evitar el escape de la placa. - El día anterior al experimento de oviposición, lave y enjuague bien las placas y remojelas en lejía al 1−5% durante 30−60 min a temperatura ambiente. Enjuague bien con agua desionizada corriente y séquelos.
NOTA: Este proceso reduce la posibilidad de que los hongos y bacterias crezcan en la agarosa. - Derretir la agarosa al 2% en agua desionizada y añadir inmediatamente 500 μL de la agarosa fundida a cada pozo de las 24 placas de pozo utilizando una pipeta de 1.000 μL(Figura 3A,B). Cuando la agarosa comience a enfriarse y obstruir la punta de la pipeta, recaliente la agarosa y use una nueva punta de pipeta.
NOTA: Evite tocar las paredes del pozo con la punta de la pipeta porque puede dejar un pedazo de agarosa en la pared donde una hembra puede poner huevos, complicando el proceso de imagen y conteo. - Antes de su uso, seque cualquier condensación en las paredes del pozo durante la noche en un banco de laboratorio(Figura 3C,D).
NOTA: La línea de tiempo del ensayo de la placa EAgaL desde la alimentación de la sangre hasta las imágenes larvarias se representa en la Figura 4,que es para mosquitos de colonia(Ae. aegypti "Liverpool" criado bajo 14 h luz: 10 h ciclo de luz oscura, 27 ° C, 80% de humedad relativa, 500 larvas en una bandeja de 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm con 2 L de agua), en condiciones insectarias. Se recomienda que cada laboratorio pruebe la placa EAgaL con los mosquitos que se utilizan, especialmente cuando se utilizan diferentes cepas, diferentes especies de mosquitos, así como diferentes protocolos de cría.
2. Alimentación de mosquitos
NOTA: Es fundamental utilizar mosquitos criados en condiciones uniformes para todos los grupos de tratamiento y grupos de control, ya que la nutrición larvaria tiene un impacto en los parámetros de aptitud de los mosquitos10,11. Larvas traseras en condiciones de poca gente con suficiente alimento. Deje que los mosquitos hembra se cierren en presencia de machos para que se asegure el apareamiento y maduren durante al menos 3 días.
- Retire cualquier fuente de agua y / o azúcar de los mosquitos hembra por lo menos 16 h antes de la alimentación con sangre con el fin de mejorar la alimentación de sangre.
- Calentar un circulador de agua para alimentación artificial a 37 °C y alimentar a mosquitos hembras utilizando sangre de vertebrados colocada en comederos artificiales durante 15−30 min (Figura 5A).
- Anestesiar a los mosquitos conCO2 o sobre hielo, transferirlos a un plato de cristal sobre hielo, y seleccionar los que están llenos de sangre (Figura 5B) en un recipiente provisto de 30% de agua de sacarosa durante más de 72 h, cuando las hembras terminan la excreción y el desarrollo del huevo.
NOTA: Si a las hembras se les proporciona una concentración más baja de agua de sacarosa, retire el agua de sacarosa y cualquier superficie húmeda después de 48 h para evitar que las hembras se ospositen.
3. Oviposición
- Aproximadamente 1 h antes de transferir los mosquitos a las placas, agregue 2−3 gotas (~80−120 μL) de agua en cada pozo de placa usando una pipeta de transferencia.
- Al menos 72 h después de la alimentación de sangre, derribar mosquitos conCO2 o en hielo, transferirlos a un plato de vidrio sobre hielo, y colocar individualmente cada mosquito en una tapa invertida de la placa de 24 pozos sobre hielo (Figura 6A).
NOTA: Este procedimiento se ha aplicado desde Ioshino et al.9. - Una vez que se hayan colocado los 24 mosquitos, cubra la tapa con un fondo de placa invertida (Figura 6B), asegure la tapa y la placa con una banda elástica nueva y fresca y colóque la placa en una cámara ambiental (o sala de cría) (Figura 6C) hasta que los mosquitos se recuperen (~ 10−15 min) y gire la placa hacia arriba (Figura 6D).
- Permita que los mosquitos hembras se ovipositen durante 24−48 h y elimine a las hembras liberándolas de las placas en una jaula grande.
NOTA: Si es importante realizar un seguimiento de las hembras individuales, anestesiarlas enfriando las placas y retírelas individualmente sobre hielo. Se observó retraso en la oviposición y excreciones oscuras que interfieren con el conteo de óvulos cuando las hembras fueron transferidas a los platos antes de 72 h después de la harina de sangre (PBM) (Figura 7D).
4. Conteo de huevos
- Revise cada pozo de la placa de 24 pozos, ya que a veces los mosquitos ponen huevos en la pared de los pozos y en el margen de la superficie de agarosa / plástico, donde son difíciles de resolver en fotografías. Con un pincel húmedo, mueva los huevos puestos en la pared y el borde de la agarosa a la superficie plana de la agarosa para que todos los huevos estén en un plano uniforme y no se superpongan entre sí.
NOTA: El borde de la agarosa está típicamente fuera del plano focal de la cámara debido a la tensión superficial de la solución de agarosa. - Usando fórceps, retire las patas rotas, las alas y otras partículas en los pozos que puedan interferir con los huevos de imágenes (Figura 7C).
- Inserte papel blanco debajo de la placa para aumentar el contraste con los huevos de mosquito oscuros antes de tomar imágenes utilizando un iluminador estereomicroscopio (Figura 7A).
- Tome una imagen de cada pozo utilizando una cámara digital compacta en modo microscopio, que permite al usuario enfocar objetos tan cercanos como 1 cm. Esta capacidad permite que la cámara se coloque directamente en la placa para obtener imágenes de huevos sin un trípode o un soporte (Figura 7A). Para distinguir los huevos individuales puestos en grupos, utilice el modo fino o súper fino para capturar imágenes de alta resolución para que se puedan ver los detalles del primer plano.
NOTA: Borre la tarjeta de memoria de la cámara antes de usarla para evitar confusiones entre imágenes nuevas y antiguas. - Después de fotografiar cada pozo de una placa, tome una imagen de toda la placa con una etiqueta de orden de imagen para distinguir cada placa más adelante (Figura 7E).
- Agregue una capa delgada ~ 5 gotas de agua (~ 200 μL) con una pipeta de transferencia a cada pozo para evitar que su tapón de agarosa y los huevos se sequen e inducir el desarrollo del embrión y la eclosión. Preste atención a los niveles de agua durante las primeras horas y verifique todos los días, porque puede haber pérdida de agua debido a la absorción por la agarosa o evaporación. Agregue agua cuando su nivel sea demasiado bajo para que las larvas eclosionen.
NOTA: La evaporación del agua se produce de manera no uniforme tanto dentro de una placa como dentro de una pila de placas. Se ha observado que el secado se produce en el siguiente orden: 1) los pozos de esquina (A1, A6, D1, D6) se secan más rápido; seguido de 2) pozos en el borde exterior de la placa (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); y los últimos 3) pozos en su interior. Cuando las placas se apilan, la placa superior se seca más rápido. - Transfiera las imágenes a una computadora con ImageJ (Fiji) y cambie el nombre de los archivos para facilitar la organización, como "[id. de placa]_[id. de pozo] .jpg" (Figura 8A,B).
- Cree un archivo de hoja de cálculo para registrar los números de huevos (es decir, la fecundidad) y los números de larvas y calcular la tasa de eclosión (es decir, la fertilidad) (Figura 9E).
- Abra las imágenes con ImageJ (Fiji)12 y use la herramienta "multipunto" para marcar cada huevo (Figura 9A−C); zoom-in o zoom-out usando la tecla "+" o "–" para contar los huevos en grupos. Después de marcar todos los huevos, haga doble clic en el icono multipunto para que aparezca el número de marcas (Figura 9D). Registre los resultados en una hoja de cálculo.
5. Evaluación de la fertilidad
NOTA: En 2 días, las larvas del primer estadio pueden comenzar a eclose en los pozos. Espere de 3 a 5 días más antes de tomar imágenes/contar para asegurarse de que todos los huevos viables eclosionen.
- Prepare los alimentos larvales mezclando 1/16 cucharada (~ 168 mg) de alimentos para peces molidos (es decir, una dieta normal de larvas de mosquitos) en 20 mL de agua y esperando a que se asienten partículas sólidas grandes (Figura 10A−D). Comience a agregar alimento (el sobrenadante) a los pozos que contienen larvas eclosionadas tan pronto como aparecen, porque no sobreviven por mucho tiempo sin comida.
NOTA: El exceso de adición de partículas de alimentos puede interferir con las imágenes y el recuento de larvas eclosionadas. - Aproximadamente 5-8 días después de la adición de agua a los pozos, enfríe la placa cubriendo con hielo triturado durante 15-20 minutos para anestesiar las larvas.
- Tome imágenes de cada pozo mientras mantiene las placas en el hielo como se hizo con los huevos. Para las imágenes larvales, proporcione un fondo oscuro insertando un material negro debajo de la placa para ayudar a mejorar el contraste. Después de fotografiar cada pozo de una placa, tome una imagen de toda la placa con una etiqueta de orden de imagen para distinguir cada placa más adelante.
NOTA: Las imágenes se toman mientras las placas están en el hielo porque el movimiento larval puede comprometer el conteo. Las placas son reutilizables; congelar y eliminar los mosquitos y la agarosa para limpiar para el próximo uso. La placa EAgaL no es adecuada para la cría de larvas en estadios avanzados. - Abra imágenes con ImageJ (Fiji) y use la herramienta "multipunto" para contar haciendo clic en cada larva. Durante el período de 3 a 5 días, algunas larvas pueden haberse mudado, especialmente en pozos con un bajo número de larvas. Por lo tanto, al contar, excluya las cutículas de la vertiente (es decir, exuviae), que parecen larvas de cabeza solamente con un poco de cuerpo, o larvas encogidas (Figura 10E). Registre los resultados en la hoja de cálculo.
6. Realizar análisis
- Después de haber recopilado todos los datos necesarios para el análisis de fecundidad y fertilidad, realice el análisis estadístico apropiado y cree gráficos utilizando el software preferido.
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Resultados
Los mosquitos fueron inyectados con dsRNA apuntando a un transportador de hierro candidato (FeT) o gen de control (EGFP), alimentados con sangre, y medidos para la fecundidad y la producción de fertilidad utilizando el método de la placa EAgaL, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
Los mosquitos en los que la expresión de FeT fue silenciada después de la inyección de dsRNA exhibieron una reducción significativa tanto en el número de huevos como en la tasa de eclosión (
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Discusión
La placa EAgaL reduce drásticamente el trabajo de parto, el tiempo y el espacio para realizar ensayos individuales de fecundidad y fertilidad en Aedes aegypti en comparación con el método FT. La comparación preliminar entre el método de FT y la placa de EAgaL resultó en tiempos más cortos para todos los pasos (se aplicó la técnica de imagen al método de FT) (Tabla 1). Como referencia, en la Tabla 2 se proporciona una estimación de los costos de inicio y por ensayo (una placa EAgaL de 24...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de interés para este estudio.
Agradecimientos
Agradecemos a Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program por su financiamiento. También agradecemos a los miembros del laboratorio de Adelman por su ayuda en el desarrollo de este método y sugerencias al redactar el manuscrito, así como a los miembros del laboratorio de Kevin Myles. También agradecemos a los revisores y editores por su ayuda para mejorar este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,6 mm Φ broca | alternativamente clavos calentados se pueden utilizar | ||
| 1000 μ L puntas de pipeta (largas) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Thermo Scientific | 930186 | transparente, de fondo plano con placas de tapa anilladas |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Cámara digital compacta | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Ordenador (Windows, Mac o Linux) | |||
| Agua desionizada | |||
| Fiji (imageJ) | desde: https://fiji.sc/ | ||
| Pinzas | de Dumont | pueden romper el cuerpo del mosquito | |
| Placas de Petri de vidrio | Lejía doméstica VWR | ||
| Iluminador de taladro | |||
| doméstico para microscopio estereoscópico (cuello de cisne) | |||
| Pipeta P-1000 | Pinceles Gilson | ||
| Bandas | |||
| elásticas | |||
| Tarjeta | para grabar imágenes de cámaras digitales (DSHC, SDXC debería ser mejor) | ||
| Software de hoja de cálculo (Microsoft Excel) | Microsoft | Cualquier software de hoja de cálculo funciona | |
| Alimento para peces TetraMin | Tetra | molido con molinillo de café, batidora o mortero | |
| Pipetas de transferencia | VWR | 16011-188 |
Referencias
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