El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.
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Artículo de método
Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior
En este artículo
Resumen
Resumen
La toma de imágenes de células beta es un paso clave hacia la comprensión del trasplante de islotes. Aunque se han desarrollado y utilizado in vivodiferentes plataformas de imágenes para el registro de la biología de células beta, están limitadas en términos de permitir la resolución de una sola célula y grabaciones longitudinales continuas. Debido a la transparencia de la córnea, la cámara anterior del ojo (ACE) en ratones es muy adecuada para estudiar la biología celular de los islotes pancreáticos humanos y de ratón. Aquí está una descripción de cómo este enfoque se puede utilizar para realizar grabaciones longitudinales continuas de injerto y revascularización de injertos de islotes humanos individuales. Los injertos de islotes humanos se insertan en el ACE, utilizando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-ratones como receptores. Esto permite la investigación de la expansión de las células receptoras frente a las de los donantes y la contribución de las células receptoras en la promoción de la encapsulación y vascularización del injerto. Además, se describe un enfoque paso a paso para el análisis de imágenes y la cuantificación del volumen de los islotes o de la vasculatura segmentada y de las células receptoras que forman cápsulas de islotes.
Introducción
La diabetes mellitus describe un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por niveles elevados de glucosa en sangre como resultado de la producción insuficiente de insulina por pérdida o disfunción de las células beta de islotes pancreáticos, a menudo acompañadas de resistencia a la insulina. La diabetes tipo 1 (T1D) y la diabetes tipo 2 (T2D) son enfermedades complejas en las que la disfunción progresiva de las células beta causa el desarrollo de la enfermedad. T1D se precipita por un ataque autoinmune en las células beta, mientras que T2D se considera impulsado por factores metabólicos, aunque con evidencia creciente de inflamación sistémica de bajo grado
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Protocolo
El Comité Regional de ética en Lund, Suecia, aprobó el estudio de acuerdo con la Ley relativa a la revisión ética de la investigación que involucra a los seres humanos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la ética sueca de los experimentos con animales y fueron aprobados por los comités de ética de Malmá y Lund. NOD inmunodeficientes de 6 a 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomate. Los ratones receptores Rag2-/-) se utilizaron como receptores para el trasplante de islotes humanos10.
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Resultados
Los islotes humanos no etiquetados fueron trasplantados a la ACE de la NOD femenina de 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. RatonesreceptoresRag2 . Para prevenir el rechazo del tejido humano, se eligieron ratones noqueadores Rag2 inmunodeficientes como receptores. En estos ratones transgénicos, todas las células y tejidos expresaron una proteína de fluorescencia de tomate (mT) dirigida a la membrana que permite una.......
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Discusión
Se presenta un método para estudiar el proceso de injerto de células de islotes pancreáticos humanos observando la participación del tejido receptor y donante. Después de una cirugía mínima invasiva que implanta islotes humanos en la cámara anterior de un ojo de ratón inmunodeficient, el ratón se recupera rápidamente en cuestión de minutos después de la cirugía. El procedimiento se realiza en un ojo. Generalmente, de 5 a 7 días después de la posimplantación en adelante, la córnea está lo suficientemente curada para reali.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, El área de investigación estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica Dnr IRC15-0067 a LUDC-IRC, la Sociedad Fisiográfica Real en Lund, Diabetesf-rbundet y Barndiabetesf-rbundet.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Máquina de anestesia, p. ej., Unidad de anestesia U-400 | Agnthos | 8323001 | utiliza para la anestesia con isoflurano durante la cirugía y |
| cámara de inducción por imagen 1,4 L | Agnthos | 8329002 | conectar a través de un tubo al |
| interruptor de enrutamiento de gas | Agnthos | 8433005 | conectarse a través de un tubo al U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | agente de imagen inyectable, utilizado para obtener imágenes de vasos sanguíneos en injertos de islotes humanos |
| Conjuntos de tubos de aspiración | Sigma | A5177-5EA | se conectan con pipetas capilares tiradas para la selección manual de islotes |
| Buprenorfina (Temgesic) 0,3 mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluido, para el alivio del dolor |
| Pipetas capilares | VWR | 321242C | utilizadas junto con Conjuntos de tubos de aspiración |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | agente de imagen para inyección |
| Cánula ocular, extremo romo, 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | hecho a medida con el linealador de hidrodo cónico [Blumenthal], dimensiones: 0,5 x 22 mm (25 G x 7/8 pulgadas) (45 ?), punta cónica a 30 g ( 0,3 mm) |
| Gel para ojos | Novartis | Viscotears, contiene carbómero 2 mg/g | |
| Jeringa Hamilton de 0,5 ml, modelo 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Jeringa hermética al gas tipo émbolo para inyección |
| en islotesSoporte de cabeza | |||
| -Adaptador de sujeción de cabeza | Narishige | SG-4N-S | ensamblado en placa de |
| metal-máscara de gas | Narishige | GM-4-S-UST-2 | |
| Junta universal sólida | Narishige | UST-2 | ensamblada en placa de |
| metal-placa de metal hecha a medida para el ensamblaje | |||
| cabeza-Dumont #5, recta | Agnthos | 0207-5TI-PS o 0208-5-PS | unida a UST-2 (hecha a medida) |
| Almohadilla térmica, hecha | a medida pegada a la plataforma estereotáxica | ||
| Medios de cultivo de islotes humanos | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals medios de | cultivo celular para islotes | |
| humanos-HEPES | GIBCO | ||
| GIBCO | |||
| GIBCO BRL-Fungizone | |||
| GIBCO BRL | |||
| -Ciproxfloxacina | Bayer healthcare | ||
| Sigma | de | ||
| análisis de imágenes | Bitplane | Imaris 9 | |
| Software de adquisición | de imágenes Zeiss | ZEN 2010 | |
| a los animales en la jaula de despertador | |||
| Isoflurano Isoflo | Abott Fluido Escandinavia/Apotek | , para anestesia | |
| Aguja de 25 g (0,5 x 16 mm), naranja | BD | 10442204 | utilizado como placas |
| , 90 mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscopio> | |||
| -LSM7 MP microscopio vertical | Zeiss-Ti | ||
| :Láser de zafiro Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai-lente | ||
| de inmersión en agua de larga distancia 20x/NA1.0 | |||
| /40m (Angiosense 680) | Chroma | ||
| /65m-2p (TR) | Chroma | ||
| /50 (GFP) | Chroma-ET610 | ||
| /75 (tomate) | Chroma-main | ||
| beam divisor T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Espejo dicroico para transmitir 690 nm y superior y reflejar de 440 a 650 nm tamaño 25,5 x 36 x 1 mm |
| Tubo de polietileno (0,38 mm de diámetro interior, 1,09 mm de diámetro exterior) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | para conectar con la jeringa Hamilton y la cánula |
| ocular Microscopio estereoscópico | Nikon | Modelo SMZ645, para la selección < islotes | |
| >microscopio estereoscópico (fluorescencia) | para la imagen del injerto de islotes-AZ100 | ||
| Multizoom | Nikon | de campo amplio y larga | |
| distancia-AZ Plan Apo 1x | Nikon-AZ | ||
| Plan Apo 4x | Nikon-AZ-FL | ||
| Epifluorescencia con lámpara C-LHGFI HG | Nikon-HG | ||
| Manual Nuevo Intensilight | Nikon | ||
| - Bloque de filtro Epi-FL TEXAS RED | Nikon | contiene EX540-580, DM595 y BA600-660-Bloque | |
| de filtro Epi-FL G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 y BA590) | |
| -Bloque de filtro Epi-FL B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 y BA520) | |
| -DS-Fi1 Cámara digital en color (5MP) | Jeringa Nikon | ||
| 1 ml, Omnitix | Braun | 9161406V | para inyección de buprenorfina, utilizada con aguja de 27 G |
| Cinta quirúrgica | 3M |
Referencias
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014,....
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Reimpresiones y permisos
