La pureza e integridad del ARN aislado es un paso vital en los ensayos dependientes del ARN. Aquí, presentamos un método práctico, rápido y barato para extraer el ARN de una pequeña cantidad de tejido pancreático no dañado.
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Artículo de método
Extracción rápida y rentable de ARN de tejido pancreático de rata
En este artículo
Resumen
Resumen
Independientemente del método de extracción, la extracción optimizada de ARN de tejidos y líneas celulares se lleva a cabo en cuatro etapas: 1) homogeneización, 2) desnaturalización efectiva de proteínas de ARN, 3) inactivación de la ribonucleasa, y 4) eliminación de la contaminación del ADN, proteínas y carbohidratos. Sin embargo, es muy laborioso mantener la integridad del ARN cuando hay altos niveles de RNase en el tejido. La autolisis espontánea hace que sea muy difícil extraer ARN del tejido pancreático sin dañarlo. Por lo tanto, se necesita un método práctico de extracción de ARN para mantener la integridad de los tejidos pancreáticos durante el proceso de extracción. Se llevó a cabo un estudio experimental y comparativo de los protocolos existentes obteniendo 20-30 mg de tejidos pancreáticos de rata en menos de 2 minutos y extrayendo el ARN. Los resultados fueron evaluados por electroforesis. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces para la generalización de los resultados. Sumergir el tejido pancreático en el reactivo de estabilización de ARN a -80 oC durante 24 horas produjo ARN de alta integridad, cuando se utilizó el reactivo de extracción de ARN como reactivo. Los resultados obtenidos fueron comparables a los resultados obtenidos de kits comerciales con fijaciones de columna de espín.
Introducción
Los datos genéticos estructurales se pueden transcribir a un producto funcional a través de la expresión génica. El análisis de ARN se utiliza para descubrir diferencias en la expresión génica en diferentes condiciones. Hay una serie de métodos para extraer ácidos nucleicos de la siguiente manera: guanidinio tiocianato, extracción a través de fenol-cloroformo, cromatografía a base de celulosa, extracción por matrices de sílice, y anión-intercambio1,2.
La detección adecuada de la expresión génica está influenciada por la integridad del ARN aislado de los tejidos; por lo tanto, es vit....
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Protocolo
La aprobación ética para este estudio se obtuvo de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz (Número de aprobación: 93-01-01-7178-03-07-2014).
NOTA: Utilice ratas macho Sprague-Dawley que pesen 250 g. Coloque el vial que contiene una astilla de tejido pancreático sumergido en un reactivo estabilizador de ARN en un tanque de nitrógeno líquido a -80 oC y utilice la solución de reactivo de extracción de ARN para mantener la integridad del ARN.
1. Extirpación del tejido pancreático de rata
- Prepare el quirófano y coloque todos los materiales necesarios debajo del capó.
- Esterili....
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Resultados
Evaluación de la integridad del ARN en el reactivo de extracción de ARN de acuerdo con un protocolo quirúrgico rutinario y modificado sin reactivo de estabilización de ARN
Se observaron bandas inaceptables después de la extracción de ARN con el reactivo de extracción de ARN de un protocolo quirúrgico de rutina. El carril 1 muestra el ARN del hígado como control. El carril 2 muestra el estado degradado de las bandas de ARN 28S/18S en el ARN total obtenido de un protocolo quirúrgico de rutina. Cuando la.......
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Discusión
En biología molecular es vital obtener ARN de alta calidad. La presencia de las enzimas ribonucleasa en células y tejidos degrada rápidamente el ARN y hace que la extracción sea compleja. Las ARN son enzimas estables que funcionan sin ningún cofactor. Pequeñas cantidades de ARN son adecuadas para destruir el ARN. Cuando el tejido pancreático de rata se extrae de la cavidad abdominal, es necesario desinfectar los instrumentos quirúrgicos con detergentes fuertes, enjuagarlos bien y ponerlos en un horno durante al menos 4 h.......
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Divulgaciones
Ninguno declarado.
Agradecimientos
El presente estudio fue apoyado financieramente por la Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz (Grant No. 93-01-01-7178-03-07-2014). Agradecemos al Sr. Zomorodian y al Sr. Rostami en el Departamento de e-Learning en Ciencias Médicas, Escuela Virtual y Centro de Excelencia en e-Learning, Universidad de Ciencias Médicas de Shiraz por editar el video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Merck | 116801 | Alemania |
| Atoclave | Teb Zaim | Irán | |
| Centrífuga | Sigma | Alemania | |
| Cloroformo | Merck | 107024 | Alemania |
| Agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) | Sigma | Alemania | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Alemania |
| Tanque de electroforesis | Payapajoohesh | Irán | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Alemania |
| Etanol | Merck | 81870 | Alemania |
| Falcon | Tube Extragene | Taiwan | |
| Formaldehído | Merck | 344198 | Alemania |
| Formamida | Merck | 344206 | Alemania |
| Homogeneizador-sunicador | Microson XL 2000 | EE. UU. | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Alemania |
| Clorhidrato de ketamina | sigma | 1867-66-9 | Alemania |
| Campana de flujo laminar | Jal Tajhiz | Irán | |
| Agitador mgnetic | Labrotechnik | EE. UU. | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | Alemania | |
| Puntas de micropipeta | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Alemania |
| Na AC | Merck | 567422 | Alemania |
| NaOH | Merck | 109137 | Alemania |
| Horno | Teb Zaim | Irán | |
| Medidor | de PHKnick | Alemania | |
| ARN Later/reactivo de estabilización de ARN | Qiagen | 76104 | EE. UU. |
| Instrumental quirúrgico | Agn Thos | de fabricación alemana | |
| AvaPezeshk | Irán | ||
| Reactivo TriPure/reactivo de extracción de ARN | Roche 11667157001 | EE. UU. | |
| Vortex | Labinco | Países Bajos | |
| Baño de agua | Memmert | Alemania | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Alemania |
Referencias
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and prot....
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Reimpresiones y permisos
