Summary
このプロトコルは、粘性材料を新しいオープンソースの自動化技術と標準化された再現可能な混合のための包括的なチュートリアルとして機能します。新しく開発されたオープンソースワークステーションの操作、オープンソースプロトコル設計者の使用、および再現可能な混合物を識別するための検証と検証に関する詳細な手順が提供されています。
Abstract
粘性材料の現在の混合ステップは、主に低スループットモードで手動で実行される反復的で時間のかかるタスクに依存しています。これらの問題は、最終的に研究成果の再現性につながるワークフローの欠点を表しています。手動ベースのワークフローは、生物医学的用途に使用されるヒドロゲルなどの粘性材料の進歩と広範な採用をさらに制限しています。これらの課題は、標準化された混合プロセスで自動化されたワークフローを使用して再現性を高めることで克服できます。この研究では、オープンソースのプロトコル設計者の使用、オープンソースワークステーションの操作、および再現可能な混合物の特定について、段階的な手順を提示します。具体的には、オープンソースのプロトコル設計者は、実験的なパラメータ選択を通してユーザをガイドし、ワークステーションを操作するためのすぐに使用できるプロトコルコードを生成する。このワークステーションは、粘性材料のピペッティングに最適化されており、温度応答性材料用の温度ドック、粘性材料用の容積ピペット、およびピペットチップから余分な材料を除去するオプションのチップタッチドックの統合により、自動的かつ信頼性の高い取り扱いを可能にします。混合物の検証および検証は、オレンジGの迅速かつ安価な吸光度測定によって行われる。このプロトコルは、80%(v/v)グリセロール混合物、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)の希釈シリーズ、および5%(w/v)GelMAおよび2%(w/v)アルギン酸のダブルネットワークヒドロゲルを得るための結果を提示する。プロトコルの採用でユーザーをサポートするためのトラブルシューティングガイドが含まれています。記載されたワークフローは、多数の粘性材料に広く適用して、自動化された方法でユーザー定義の濃度を生成することができる。
Introduction
再現性と再現性は、科学的な研究において最も重要です1,2,3,4。しかし、最近のエビデンスは、基礎科学におけるインパクトの大きい生物医学研究とトランスレーショナルリサーチを繰り返す上での重大な課題を強調しています4,5,6,7。再現不可能な結果に寄与する要因は、研究デザインが貧弱または偏っている6,8、不十分な統計的検出力3,9、報告基準への準拠の欠如7,10,11、出版圧力6、または利用できない方法やソフトウェアコード6,9など、複雑で多様です6,9.その中で、プロトコルの微妙な変化や実験実施における人為的ミスが、再現性の欠如を説明するさらなる要素として特定されています4。たとえば、手動ピペッティング作業では、個人内および個人間の不正確さがもたらされ12,13、人為的ミスの可能性が高まります14。市販の液体処理ロボットはこれらの欠点を克服し、液体の信頼性の向上を実証していますが15,16,17が、粘性特性が著しい材料の自動処理は依然として困難です。
市販の液体処理ロボットは、一般に、エアピストンまたは空気置換ピペットとも呼ばれるエアクッションピペットを使用します。試薬とピストンは、分注ステップ中に収縮し、吸引ステップ中に膨張するエアクッションによって分離される。エアクッションピペットを使用すると、粘性のある材料は先端にゆっくりと出入りするだけになり、リザーバからピペットを早期に引き抜くと気泡が吸引される可能性があります。分配作業中、粘性材料は、空気によって強制されたときにゆっくりとしか「流れない」フィルムを内先端壁に残す。これらの問題を克服するために、固体ピストンを用いて粘性材料を先端から積極的に押し出すために、正変位ピペットを商業的に導入した。これらの容積式ピペットは粘性材料の正確で信頼性の高い取り扱いを可能にしますが、容積式ピペットを使用した自動ソリューションは依然として学術実験室の設定には高価すぎるため、粘性物質を使用するほとんどのワークフローは手動ピペッティングタスクのみに依存しています18。
一般に、粘度は流体が流れる抵抗として定義され、粘性材料はさらに水の粘度(25°Cで0.89mPa・s)が大きい材料として定義されています。生物医学用途の分野では、実験セットアップは、ジメチルスルホキシド(DMSO;25°Cで1.99mPa·s)、グリセロール(90%グリセロール[v/v]に対して25°Cで208.1mPa·s)、Triton X-100(25°Cで240mPa·s)、およびヒドロゲルと呼ばれる水膨潤ポリマーなど、水よりも粘度の高い複数の材料を含むことがよくあります19。20。ヒドロゲルは、細胞封入、薬物送達、およびソフトアクチュエータを含む様々な用途に使用される物理的または/および化学的モードに配置された親水性ポリマーネットワークである19、20、21、22。ヒドロゲルの粘度は、ポリマー濃度および分子量に依存する19。生物医学的用途に日常的に使用されるヒドロゲルは、1〜1000mPa・sの粘度値を示すが、特定のヒドロゲル系は、最大6 x 107mPa·s19,23,24の値で報告されている。しかしながら、ヒドロゲルの粘度測定は、測定プロトコールおよびサンプル調製に関して標準化されていないため、異なる研究間の粘度値を比較することは困難である。
ヒドロゲル用に特別に設計された市販の自動ソリューションは不足しているか高価すぎるため、ヒドロゲルの現在のワークフローは手動処理に依存しています18。ヒドロゲルのピペッティングに関する現在の手動ベースのワークフローの限界を理解するには、本質的な取り扱いタスクを理解することが重要です18。例えば、新規なヒドロゲル材料が合成されると、所望の濃度または様々な濃度の希釈系列が生成され、その後の機械的特性の分析により、信頼性の高い合成プロトコルおよび架橋特性が同定される25、26、27、28.一般に、原液を調製または購入し、続いて希釈剤および/または他の試薬と混合して混合物を得る。混合タスクは、ほとんどの場合、ウェルプレート(または任意の出力形式)で直接実行されず、むしろ一般にマスターミックスと呼ばれる別の反応管で実行されます。これらの調製作業中に、粘性物質を移送し、試薬を混合し、混合物を出力フォーマット(例えば、96ウェルプレート)に移送するために、様々な吸引および分配ステップが必要である。これらの作業は、大量の人的労働18、長い実験時間を必要とし、不正確な結果として潜在的に現れる可能性のある人為的ミスの可能性を高めます。さらに、手作業による取り扱いにより、詳細な特性評価のためにさまざまなパラメータの組み合わせをスクリーニングするための高いサンプル番号の効率的な準備が妨げられます。手作業による処理は、医薬品開発中の有望な化合物の同定など、ハイスループットスクリーニング用途向けのヒドロゲルの使用を妨げます。現在の手動ベースの調製ステップでは、何千もの薬物からなる薬物ライブラリーをスクリーニングすることは現実的ではありません。これらの理由から、効率的な開発プロセスを提供し、薬物スクリーニング用途向けのヒドロゲルの翻訳を成功させるためには、自動化されたソリューションが必要です。
手動ベースのワークフローから自動プロセスに移行するために、温度応答性材料用の温度ドックの統合、キャピラリーピストンチップを使用した既製の容積式ピペットの使用、およびピペットチップ洗浄用のオプションのチップタッチドックにより、粘性材料の取り扱いのための商用オープンソースピペッティングロボットを最適化しました。このピペッティングロボットは、ピペッティングモジュールとして、すぐにインストールできカスタマイズ可能なモジュールで構成される新しく開発されたオープンソースワークステーションにさらに統合されました18,29。ハードウェアファイルやソフトウェアファイルを含む、開発されたワークステーションの詳細な組み立て手順は、GitHub(https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation)とZenodoリポジトリ(https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757)から自由にアクセスできます。ハードウェア開発に加えて、オープンソースのプロトコル設計アプリケーションがプログラムされ、リリースされ、パラメータ選択プロセスを通じてユーザーをガイドし、すぐに使用できるプロトコルコード(https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp)を生成します。このコードは、商用のオープンソースピペッティングロボットと開発されたオープンソースワークステーションで実行されます。
ここでは、粘性材料の混合タスクを自動化するためのオープンソースワークステーションの動作に関する包括的なチュートリアルを提供します(図1)。チュートリアル固有のプロトコル手順は、開発されたオープンソースワークステーションと商用オープンソースピペッティングロボットで実行できます。自社開発のオープンソースプロトコル設計アプリケーションによってサポートされ、グリセロール、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)およびアルギン酸塩に必要な濃度の自動混合および調製が実証されています。グリセロールは、十分に特徴付けられているため30,31、安価で容易に入手可能であり、したがって、自動ピペッティングタスクの粘性基準物質として一般的に使用されているため、このチュートリアルで選択されています。生物医学的用途に使用されるヒドロゲルの例として、GelMAおよびアルギン酸ヒドロゲル前駆体溶液が自動混合実験に適用されている。GelMAは、細胞封入研究のために最も一般的に使用されるヒドロゲルの1つを提示し32,33、および二重ネットワークヒドロゲルを製造する能力を実証するためにこの研究においてアルギン酸塩を選択した34,35。オレンジGを染料として使用して、分光光度計16で混合結果を検証および検証するために、迅速かつ安価な手順が実装されました。
商用のオープンソースピペッティングロボットは、開発されたオープンソースワークステーションにピペッティングモジュールとして統合されているため(図2a)、ピペッティングロボットを説明するために「ピペッティングモジュール」という名前がさらに使用されています。インストールされているハードウェアの詳細な説明は、このプロトコルの範囲外であり、オープンソースプラットフォームの一般アセンブリのためのステップバイステップの指示を含む、提供されているリポジトリを介して入手できます。ピペッティングモジュールには、軸A(右)と軸B(左)に取り付けられた2つのピペット(シングルチャンネルまたは8チャンネルピペット)を装備することができます(図2b)。ピペッティングモジュールは、米国規格協会/検査自動化およびスクリーニング協会(ANSI/SLAS)規格に準拠した10デッキ容量を提供し、デッキ上にはA1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2の位置が定義されています(図2c)。ヒドロゲル溶液の光誘起重合を開始するには、別の架橋モジュールが必要であり、ワークステーションに追加されています。架橋剤モジュールには波長400nmのLEDが装備されているため、可視光波長で励起する物質は、フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)36,37などの現在のシステムで使用できます。LEDの強度(mW/cm2)は、プロトコル設計アプリケーションにおいて、架橋挙動を研究するためにユーザが対処することができる38。ワークステーションには、スループット研究の向上を可能にするストレージモジュールも含まれています。ただし、このモジュールはこの研究では使用されていないため、これ以上説明されていません。一般に、サンプルの汚染を避けるために、生物学的安全キャビネット内でピペッティングモジュールを操作することをお勧めします。ピペッティングモジュールを動作させるための主電源回路は12V回路で、ほとんどの国で低電圧アプリケーションと見なされています。すべての電気部品は専用のコントロールボックスに組み込まれており、ユーザーが電気的な危険の原因と接触するのを防ぎます。
これらの標準化された混合プロトコルに従うことで、研究者は粘性材料と非粘性材料の信頼性の高い混合物を自動化された方法で達成することができます。オープンソースのアプローチにより、ユーザーはミキシングシーケンスを最適化し、新しく開発されたプロトコルをコミュニティと共有できます。最終的に、このアプローチは、異なる因子間の相互依存性を調査するための複数のパラメータ組み合わせのスクリーニングを容易にし、それによって、生物医学的用途のための粘性材料の信頼性の高い適用および開発を加速する。
Protocol
メモ: このプロトコルは、(1) ソフトウェアと (2) 必要なインストールとワークステーションについてユーザに理解してもらうためのハードウェアのセットアップの概要から始まります。(3)材料準備および(4)プロトコル設計アプリケーションの使用に関するセクションに続いて、(5)ピペッティングモジュールの較正および(6)自動化プロトコルの実行が詳細に強調される。最後に、(7)吸光度読み取りおよびデータ分析を含む検証および検証手順について説明する。個々のタスクを含む一般的なプロトコルワークフローを 図 1 に示します。
1. ソフトウェアのセットアップ
メモ:このセクションには、アプリケーションプログラミングインタフェース(API)のインストール、必要なプロトコルデザイナアプリケーション、およびキャリブレーション端子のインストールに関する詳細な手順が含まれています。次の手順は、ラズベリーパイ(RPi)シングルボードコンピュータ用に書かれています。ただし、Windows 8、10、macOS 10.13以降もAPIとアプリケーションで正常に使用されています。
- コンピューター環境をセットアップします。
注: Python39 の基本、Raspberry Pi40,41 のセットアップ方法と使用方法、およびインターネットへの接続方法42 に精通している必要があります。次のチュートリアルの手順では、プロトコル固有の手順に焦点を当てており、Raspberry Piの使用に関する追加情報はオンラインで入手できます40。- タスクバーまたはアプリケーションメニューからターミナルウィンドウを開きます。
- システムのパッケージリストを更新します。
sudo apt-get update - インストールされているすべてのパッケージをアップグレードします。
sudo apt-get dist-upgrade - ラズベリーパイを再起動します。
sudo の再起動 - インストールされているPythonのバージョンを確認してください:
python3 --version
少なくとも Python 3.5 がインストールされていることを確認してください。そうでない場合は、最新バージョン43をインストールします。 - Python パッケージ Index44 で Python パッケージを公開する python pip をインストールします。
sudo apt-get install python3-pip - インストールの依存関係:
ピップインストール番号
pip install python-resize-image
注:Windowsを使用している場合は、 python -m pip install windows-cursesを介してwindows-cursesパッケージをインストールする必要があります
- アプリケーション・プログラミング・インターフェース (API) をインストールします。
注: この API は、実験的なプロトコルのスクリプトを作成し、ワークステーションを操作するように設計された単純な Python フレームワークを提供します。生成されたプロトコル コードを正常に実行するには、次の 2 つの API が必要です。- ワークステーション API のインストール:
ピップインストールオープンワークステーション - Opentrons APIをインストールしてピペッティングモジュールを操作します。
ピップインストールopentrons==2.5.2 - API が正常にインストールされているかどうかを確認します。
パイソン3
>>>インポートオープンワークステーション
>>> インポート オープントロン
注: API とプロトコル設計アプリケーションのサイズは、それぞれ 2.2 MB と 1.2 MB です。限られたディスク容量 (200 MB) で使用した場合、インストール中に問題は発生しませんでした。ただし、必要なディスク容量はオペレーティング・システムによって異なります。
- ワークステーション API のインストール:
- ファイルダウンロード用のディレクトリ(キャリブレーション端末、プロトコル設計アプリケーションなど)を選択します。
注:ファイルは後で別の場所にコピーして貼り付けることができます。 - GitHubリポジトリからファイルをクローンする:
git クローンの https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
注: 'git clone' コマンドは、すべてのファイルをクローンし、その後、この時点でターミナルで開かれているディレクトリに保存します。リポジトリにはアセンブリのハードウェアファイルも含まれているため、提示されたプロトコルを実行するためにリポジトリ全体は必要ありません。実験を複製するために必要なすべてのファイルは、 補足ファイル として、および GitHub リポジトリの "/examples/publication-JoVE" で入手できます。 - ダウンロードしたフォルダを開きます。リポジトリ全体がダウンロードされた場合は、 'publication-JoVE'フォルダに移動します。
cd openworkstation/examples/publication-JoVE
メモ: このフォルダには、ワークステーションの動作、プロトコルデザイナアプリケーションとキャリブレーション端末の使用に必要なファイルが含まれています。
2. ハードウェアのセットアップ
- サンプルの汚染を避けるために、ワークステーションを生物学的安全キャビネットに入れます。
- ワークステーションにピペットを取り付けます。
- 実験セットアップに基づいてピペットサイズを選択します。一般に、吸引される体積が範囲のより高い方にあるピペットサイズをとる。特定のセットアップで 1 mL を超える容量の混合作業 (2 mL の吸引/分注など) が必要な場合は、最大吸引/分注量が 1,000 μL の M1000E を選択して、ピペッティングステップを最小限に抑え、時間を節約します。
注:空気置換ピペットの詳細な説明書は、オンラインで入手できます45。開発されたピペッティングモジュールは、M10E (1 ~ 10 μL)、M25E (3 ~ 25 μL)、M50E (20 ~ 50 μL)、M100E (10 ~ 100 μL)、M250E (50 ~ 250 μL)、M1000E (100 ~ 1,000 μL) の既製のプラス置換ピペットを統合できます。 - M4 アレンキーを使用して、ネジを緩めたり締めたりします。
- 2枚のピペット固定プレート(白いアクリル板)をアルミレールに取り付け、M5ネジを緩く締めます。
- ピペットを 2 つのピペット固定プレートに挿入し、ピペットの人間工学に基づいたテールがアクリル取り付けプレートの反対側にかかっていることを確認します。
- 2枚のピペット固定プレートの4本のネジをしっかり締めます。
- アクリル取り付けプレートに取り付けられている2つの正方形の締結ナットをz軸の押出スロットにスライドさせ、ネジを締めます。
メモ:操作中に動かないようにピペットをしっかりと固定してください。
- 実験セットアップに基づいてピペットサイズを選択します。一般に、吸引される体積が範囲のより高い方にあるピペットサイズをとる。特定のセットアップで 1 mL を超える容量の混合作業 (2 mL の吸引/分注など) が必要な場合は、最大吸引/分注量が 1,000 μL の M1000E を選択して、ピペッティングステップを最小限に抑え、時間を節約します。
3. 材料準備
注:粘性物質(グリセロール、GelMA、アルギン酸塩)は、この研究で提示された実験に使用されるため、調製された量および取り扱いタスク(例えば、5mL反応管に5mLのストック溶液を添加する)は、この実験セットアップに特異的である。
- ゼラチンメタクリロイル(ゲルMA)
注:GelMA官能化、透析、凍結乾燥は本稿の範囲ではなく、段階的なプロトコルがLoessner et al.33で入手可能である。このプロトコルは凍結乾燥GelMAの使用を開始し、これは社内で調製することも、商業的に購入することもできます。- 次の式を使用して、所望の最終ストック濃度(cGelMA)および体積(VGelMA)に基づいて、GelMA(mGelMA)の必要な質量を計算します。
mGelMA = cGelMA x VGelMA
注:VGelMAは実験セットアップに依存し、20〜30%の過剰材料を調製することをお勧めします。提示されたプロトコルは、ストック溶液として5mLの20%(w / v)GelMAで始まります。 - 凍結乾燥GelMAの必要量を秤量し、それを50mL反応管に加え、必要量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加える。
- GelMAを混合するには、4°Cで一晩溶媒に浸すか、水浴中で60°Cに6時間加熱します。
注:滅菌GelMA溶液は、少なくとも6ヶ月間、4°Cで光から保護して保存することができます。 - 5 mL の GelMA を 5 mL の反応チューブに充填します。
- 次の式を使用して、所望の最終ストック濃度(cGelMA)および体積(VGelMA)に基づいて、GelMA(mGelMA)の必要な質量を計算します。
- 光開始剤:フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)
メモ: LAP は光に敏感であるため、室内の光にさらさないでください。- 次の式を使用して、所望の最終ストック濃度(cLAP)と必要体積(VLAP)に基づいて、必要なLAP(mLAP)の質量を計算します。
mLAP = cLAP x VLAP
注: 3% (w/v) の原液を調製することをお勧めします。 - 必要量のLAPを秤量し、15mL反応管に加え、PBSを加える。
- 光誘起分解を防ぐために、チューブをアルミ箔で包みます。
- 反応管を37°Cの水浴中に2時間置いて、または完全に溶解するまでLAPを溶解する。
- 1 mL の LAP 原液を 5 mL チューブに充填します。
- 次の式を使用して、所望の最終ストック濃度(cLAP)と必要体積(VLAP)に基づいて、必要なLAP(mLAP)の質量を計算します。
- アルギン酸
- 式を使用して、所望の最終ストック濃度(カルギン酸塩)および体積(バルギン酸塩)に基づいて、アルギン酸塩(マルギン酸塩)の必要量を計算する:
マルギン酸 = カルギン酸 x バルギン酸
注:バルギン酸塩は実験セットアップに依存し、20〜30%過剰の材料を調製することが推奨される。提示されたプロトコルは、ストック溶液として5mLの4%(w / v)アルギン酸塩で始まります。 - 必要な量のアルギン酸塩を計量し、50mL反応管に加え、PBSを加える。
- アルギン酸塩ミックスを37°Cの水浴に4時間置く。
注:ボルテックスミキサーを使用すると、溶解プロセスが加速されますが、気泡も発生します。溶解したアルギン酸塩は、4°Cで少なくとも6ヶ月間保存することができる。 - 5 mL のアルギン酸塩を 5 mL の反応管に充填します。
- 式を使用して、所望の最終ストック濃度(カルギン酸塩)および体積(バルギン酸塩)に基づいて、アルギン酸塩(マルギン酸塩)の必要量を計算する:
- 5 mL のグリセロールを 5 mL の反応管に充填します。
- オレンジGソリューション
- 50 mL の反応管にオレンジ G の 10 mg/mL 原液を用意します。
注: 音量は実験の数によって異なります。希釈剤の種類に応じて、超純水、PBSまたは適切な希釈試薬のいずれかで原液を調製する。提示された実験では、グリセロールおよびPBSを希釈するために超純水を使用し、GelMAおよびアルギン酸塩を希釈した。PBSは、GelMAおよびアルギン酸塩の希釈剤として使用され、錠剤を用いて調製するか、または既製の購入のいずれかであり得る。 - ボルテックスで10秒間混合する。
- 光誘起分解を防ぐために、チューブをアルミ箔で包みます。
注:オレンジGの適切な溶解を確実にするために、ストック溶液は24時間後に使用することができます。 - 希釈した原液を 50 mL の反応管内の 1 mg/mL の作業液に希釈します。
- 実験セットアップのための適切なフラスコ/チューブに作業溶液を移す。
注:提示された実験のために、作業溶液を5mLチューブに充填した。オレンジGストックと作業溶液は、4°Cで保存し、調製後3ヶ月以内に使用することができます。 - 1 mg/mL のオレンジ G 作業液 5 mL を 5 mL の反応管に充填します。
- 50 mL の反応管にオレンジ G の 10 mg/mL 原液を用意します。
4. プロトコルデザイナアプリケーションでプロトコルコードを生成する
注:ステップ4.2-4.7で指定されたパラメータは、材料のストック濃度と最終出力濃度を除いて、実施されたすべての実験で同じです。これらのパラメータを 表1 に要約し、以下では、パラメータを使用して、5%(w/v)GelMA、2%(w/v)アルギン酸塩、0.15%(w/v)LAPおよびPBSを希釈剤として含むダブルネットワークヒドロゲルを調製する。
- 'ProtocolDesignApp.html' を実行してプロトコル デザイナー アプリケーションを開きます。
注:アプリ「ProtocolDesignApp.html」は、パラメータ選択プロセスをユーザーに案内し、ワークステーションを操作するためのすぐに使用できるプロトコルを自動的に生成します。ユーザーインターフェイスは、一般的に使用されるすべてのインターネットブラウザ(Chrome、Firefox、Safari、edge、Internet Explorer)で動作します。 - セットアップページにプロトコル名(例えば、ダブルネットワークヒドロゲル)を入力します。
- 「続行」をクリックしてプロトコル名を確認し、次の手順に進みます。
- ドロップダウンメニューから「3x4加熱ブロック」を選択し、次の入力パラメータを使用して、給紙トレイを定義します。
- ドロップダウンメニューから「ゲル1」を選択し、「GelMA」という名前を入力し、ストック濃度「20%」を入力し、「サンプル数」を「3」に設定して1列に記入します。「+追加」をクリックしてエントリを保存します。
- ドロップダウンメニューから「ゲル2」を選択し、名前:「アルギン酸塩」を入力し、ストック濃度「4%」を入力し、「サンプル数」を「3」に設定して1つの列に記入します。「+追加」をクリックしてエントリを保存します。
- ドロップダウンメニューから「光開始剤」を選択し、名前:「LAP」を入力し、ストック濃度「3%」を入力し、「サンプル数」を「3」に設定して1列を埋めます。「+追加」をクリックしてエントリを保存します。
- ドロップダウンメニューから「希釈液1」を選択し、名前:「PBS」を入力し、「サンプル数」を「3」に設定して1つの列に記入します。「+追加」をクリックしてエントリを保存します。
メモ: 給紙トレイの視覚化は、「+add」をクリックすると自動的に更新されます。トレイの容量よりも多くの入力が追加されると、「このトレイのサンプルが多すぎます」という警告がユーザーに表示されます。
- 「写真の架橋」をチェックし、秒単位の時間、「30」、強度W / m2 を「2」で入力して、架橋パラメータを定義します。
- 「続行」をクリックして入力設定を完了します。
- 出力トレイの設定を定義するには、ウェルプレートタイプのドロップダウンメニューで「96ウェルプレート」を選択します。
- 「Group1」をクリックして、サンプルのグループを作成して出力を定義します。
- 各入力のフィールドに所望の濃度とサンプル量を入力して出力組成を指定します:GelMA = '5'、アルギン酸塩= '2'、LAP = '0.15'、総体積= '60'。
- チェックボックスをクリックして、高度なミキシングプロトコルを適用します。
- 「サンプル数」フィールドにサンプル数を入力して、サンプル数を指定します: '96'。
メモ: サンプルトレイのビジュアライゼーションは、「+グループを追加」をクリックすると自動的に更新されます。トレイの容量よりも多くのサンプルが追加されると、「このトレイのサンプルが多すぎます」という警告がユーザーに表示されます。 - 「続行」をクリックして出力設定を完了します。
- デッキレイアウト上のトレイ位置を選択し、それに応じてプラットフォームを準備します。
- フィールド「スロットA1」のチェックマークをチェックし、ドロップダウンメニューから「Empty_Cell」を選択します。
- フィールド「スロットA2」のチェックマークをチェックし、ドロップダウンメニューから「Trash_Cell」を選択します。
- フィールド「SLOT B1」のチェックマークにチェックを入れ、ドロップダウンメニューから「Tips_Cell_100 μL」を選択します。
- フィールド「SLOT B2」のチェックマークにチェックを入れ、ドロップダウンメニューから「Tips_Cell_1000 μL」を選択します。
- フィールド「SLOT C1」のチェックマークをチェックし、ドロップダウンメニューから「Input_Cell」を選択します。
- フィールド「SLOT C2」のチェックマークをチェックし、ドロップダウンメニューから「Empty_Cell」を選択します。
- フィールド「スロットD1」のチェックマークをチェックし、ドロップダウンメニューから「Mixing_Cell」を選択します。
- フィールド「スロットD2」のチェックマークをチェックし、ドロップダウンメニューから「Output_Cell」を選択します。
- 「ピペット左」にチェックを入れ、ドロップダウンメニューから「10-100μLの正の変位」を選択し、吸引速度 = '600'、分注速度 = '800'を設定して、最初のピペット(M100E)の種類と特性を定義します。
- セカンドピペット(M1000E)の種類と特性を定義するには、「ピペット右」にチェックを入れ、ドロップダウンメニューから「100-1000μL正の変位」を選択し、吸引速度=「800」、分注速度=「1200」を設定します。
- 「プロトコルの生成」をクリックしてセットアップを確認し、プロトコルスクリプトを生成します。
注: 開発されたプロトコル デザイナー アプリは、新しいプロトコルが生成されるたびに、自動的に新しいフォルダーを生成します。この実験とワークステーションの操作に必要なすべてのファイルは、プロトコル名にちなんで名付けられたこのフォルダに保存されます。フォルダは、問題を引き起こすことなく異なるディレクトリにコピーできます。 - インタフェースはプロトコルの実行に使用されるため、閉じないでください(ステップ6.6を参照)。
5. ピペッティングモジュールのキャリブレーション
メモ:コンテナ(ウェルプレート、チップラック、ゴミなど)とピペット(M1000Eなど)は、最初に校正する必要があります。コンテナおよび/またはピペットの位置を変更/変更する場合は、新しい位置を較正する必要があります。
- プロトコルフォルダに移動し、端末windoxでファイル 'calibrate.py'を実行してキャリブレーション端末を開きます(ステップ1.1.1を参照)。
phython.calibrate.py
注:「calibrate.py」インターフェースは、デッキセットアップとピペットのキャリブレーションをユーザーに案内します。ファイルがプロトコル・ファイルおよびモジュール・ファイルと同じフォルダーにあることを確認してください。これは、ステップ 4.10 で自動的に生成されます。 - テンキーパッド (1-8) でプランジャーx、y、z 移動の移動増分を選択します: 0.1 mm の場合は '1'、0.5 mm の場合は '2'、1 mm の場合は '3'、5 mm の場合は '4'、10 mm の場合は '5'、20 mm の場合は '6'、40 mm の場合は '7'、80 mm の場合は '8' を選択します。
- ピペットを校正します。
- キーボードショートカット P を押して、ピペットサイズを選択します。
- キーボードショートカット V を押してプランジャーキャリブレーションモードに入ります。
メモ: ピペットヘッドのインクリメントサイズと動きの動作に慣れるために、小さなインクリメント(2、5、および10 mm)から始めることをお勧めします。 - 正の変位ピペットについて、次のプランジャー位置を較正します: T–Top = 静止位置;B–Bottom = プランジャーは抵抗が満たされるまで押し込まれます。P–ピックアップ = プランジャーは、ピストンチップを取り付けることができる位置に押し込まれます。E – イジェクト = プランジャーは、取り付けられた先端がイジェクトされるまで押し出されます。キーボードの上向き矢印と下向き矢印を使用してプランジャーの位置を変更し、キーボードの S を使用して最終位置を保存します。
- キーボードショートカット Vを押して、ピペットプランジャーキャリブレーションモードを終了します。
- ピペットチップに対する容器の位置を較正します。
- キーボードショートカット P を押して、ピペットタイプを選択します。チップが選択したピペットに接続されていることを確認します。
- キーボードショートカット C を押して、コンテナタイプを選択します。
- 適切な移動インクリメントを選択し、ピペットチップを次の位置に移動します。ウェルプレートの場合は、下部の「A1」ウェル位置に校正します。チップラックの場合は、「A1」の位置にキャリブレーションします。ごみ箱の場合は、先端をごみ箱に排出できる位置 (ポイントとして定義) を選択します。
- キーボードショートカット S を押して位置を保存します。
- 選択したピペットタイプの「C」の下にリストされているすべてのコンテナについて、手順5.3.1−5.3.3を繰り返します。
- 2番目のピペットタイプに対して5.3.1−5.3.5を繰り返します。
- キャリブレーションスクリプトを閉じます。
6. ワークステーションでのプロトコル実行
メモ: プロトコルファイルはリポジトリからアクセスでき、 補足ファイルとしても利用できます。
- ごみ箱、チップラック、給紙トレイ、ミキシングトレイ、および出力をデッキに配置します(ステップ4.3で定義)。
- セクション5で定義されているようにピペットと機器を校正します。
- 必要に応じて、温度ドックをONに切り替え、入力トレイとミキシングトレイの温度を選択します。
注:このチュートリアルの実験は、温度制御なしで、グリセロールの場合は40°C、GelMAおよびアルギン酸ピペッティングの場合は37°Cで実施されました。 - 選択したセットアップに従って、温度ドックのアルミニウムブロックに入力試薬を含むチューブを配置します。
- 入力試薬が所望の温度に達するまで待ちます。
注:適切な温度分布を確保するために、GelMAおよびアルギン酸塩には30分のインキュベーション時間を推奨します。 - 「PYTHON スクリプトの実行」をクリックしてプロトコルファイルを実行します。
メモ: 選択したプロトコルがワークステーションによって実行されるようになりました。付属のビデオでは、GelMA の自動混合と 96 ウェルプレートへの 60 μL の分配が強調されています。 - 「完了」と表示されたら実行が完了しました。
7. 検証と検証のプロセス
- ワークステーションからウェルプレートを取り出し、サンプルを含むウェルプレートを分光光度計に輸送します。
- 450nmの分光光度計で吸光度を読み取る。各プレート2xを読み取って結果を比較し、一貫した結果を確認します。
- 吸光度の測定値をエクスポートして保存します。
- データ分析。
注:実験データは、個別に処理することも、提供されたテンプレートにコピーして貼り付けて、表計算ソフトを使用して平均、標準偏差、分散係数(CV)値を評価することもできます。- 補足ファイル 'supplementary_template-analysis.xlsx" を開きます。これは GitHub リポジトリ内の 'openworkstation/examples/publication-JoVE" でも利用できます。
- 吸光度の読み取り値を「生データ」シートにコピーし、すべての表ですべてのセル参照が正しく定義されていることを確認し、「分析」シートをクリックして平均、標準偏差、および分散係数(CV)値に関する情報を確認します。
注: ウェルプレート上のサンプル分布に応じて、テンプレートでは次のプリセット評価タイプを使用できます: 「均一」タイプは、すべてのサンプルが同じ組成を持つ場合に使用され、「行別」タイプは、異なる行のサンプルの組成が異なる場合に使用され、「列別」タイプは、異なる列のサンプルの組成が異なる場合に使用されます。 「カスタマイズ」タイプは、サンプル位置がユーザー固有の場合に使用されます。
Representative Results
このチュートリアルでは、グリセロール(図3)およびLAPおよびアルギン酸塩を用いたGelMA(図4)を用いた実験の結果を示します。
80%(v/v)グリセロール溶液の生成は、温度制御なし(室温、22°C)およびチップタッチなし(セットアップ1として定義)、温度制御(40°C)およびチップタッチなし(セットアップ2)、または温度制御(40°C)およびチップタッチ(セットアップ3)のいずれかで調査された(図3a-i)。これら2つの温度設定は、グリセロールの粘度が22°C(139.5mPa·s)から40°C(46.6mPa·s)に加熱するとほぼ3倍に減少するため、取り扱いの違いを評価するために選択されました30。グリセロールの85%(v/v)ストック溶液を最終濃度80%に希釈し、96ウェルプレートに均一に分配した(セットアップあたりn = 96)。この実験時間は、混合管への各材料の分注、各混合タスク、および96ウェルプレートへのサンプル分配を含み、30分42秒であった。希釈混合物の違いを特定するために、グリセロールの希釈剤としての超純水を1mg/mLオレンジGで調製した。吸光度の測定値は、温度制御と先端接触の統合が混合物に大きく影響することを強調しています(p<0.0001)。実施した二元配置分散分析(ANOVA)に加えて、CV値を算出し、相対標準偏差を評価した。変動係数は、平均に対する偏差の程度を識別するための標準化された指標を表し、パーセンテージで表されます。サンプル平均が特に関心のあるポイントではなく、測定値内の変動性である場合、変動係数は再現可能な混合物を識別するための追加の洞察を提供します46。3つの異なるセットアップを使用したこの実験では、吸光度値がセットアップ1、セットアップ2、およびセットアップ3でそれぞれCV値が5.6%、4.2%、2.0%に減少し、温度ドックとチップタッチ機能が信頼性の高い結果を生み出す上で有意な影響を示すことを示しました(図3a-ii)。セットアップ3(96ウェルプレートのサンプル番号#1~#96)のサンプル吸光度値をプロットすると、実験全体を通して値の増加または減少は得られないため、サンプル位置が吸光度値に影響を与えないことを示しています(図3a-iii)。ヒートマップを使用して測定された各ウェルプレートのデータを視覚化すると、特定の行または列の不均一性、または分配タスク全体で変化する吸光度値を識別するための追加の洞察が得られます。3つのセットアップの視覚化されたヒートマップは、セットアップ1からセットアップ3までのウェルプレート全体で不均一性の減少を示しています(図3b)。最後に、実施された混合の再現性を8つの独立したラン内で評価し(図3c−i、ii)、各ランは6分57秒かかった。単一混合ランでは、CV値が1.1%~2.6%と低く、個々のミキシングおよびディスペンシングタスクが非常に信頼できることを示しています。8つのランすべての吸光度値は3.3%のCV値をもたらし、確立された混合プロトコルの再現性を実証しました。
GelMA希釈シリーズは、PBSで20%(w/v)ストック溶液を14、12、10、8、6、4、2、および0%(w/v)に希釈し、LAPを0.15%(w/v)の一定濃度に添加することによって調製した(図4a-i)、合計55分間12秒を要した。実験プロトコールスクリプトに規定されているように、ヒドロゲルは400nmで2.0mW/cm2の強度で30秒間架橋された。混合物間の差を評価するために、GelMAおよびアルギン酸塩の希釈剤としてのPBSを1mg/mLオレンジGで調製したため、1つの混合物内のサンプル間および連続希釈液間の吸光度差は分光光度計で同定される。各濃縮ステップの測定された吸光度値は有意に異なり(p<0.0001)、濃縮ステップ全体を通して1.2%〜3.4%の間の非常に低いCV値を有する(濃縮ステップ当たりn = 12)。線形回帰は、R²値が0.9869で高い適合を示し(図4a-ii)、ヒートマップは各濃度の均質分布と濃度間の差を確認しました(図4a-iii)。4つの試薬の自動混合は、同じ架橋パラメータ(30秒、2.0mW/cm2、400nm)を有する希釈剤として5%(w/v)ゲルMA、2%(w/v)アルギン酸塩、0.15%(w/v)LAPおよび(セットアップ3)タッチチップ(セットアップごとにn = 96)を用いてPBSを生成するために実施した。4つの材料の分配、混合、および96ウェルプレートへの分配は、32分22秒を要した。GelMAおよびアルギン酸塩を用いた全ての実験は、GelMAのピペッティングを防止する熱ゲル化を防止するために37°Cで実施した。チップタッチオプションにより、CV値が5.2%から3.4%に低下し、特に先端から余分な材料を除去することで下部領域の外れ値を防止しました(図4b-i)。セットアップ 2 とセットアップ 3 の平均値 1.927 と 1.944 は非常に近いですが、変動係数は平均に対する偏差の減少を強調しています。ヒートマップの視覚化を使用して、96ウェルプレートの単一行を互いに比較し、行および/または列の違いを検出できます(図4b-ii)。
図 1: 個々のタスクを含むプロトコル ワークフロー ここで説明するワークフローは、セットアップ、準備、実行、および分析に分かれている 7 つのタスクに分かれています。最初に、ソフトウェア (タスク 1) とハードウェア (タスク 2) をセットアップする必要があります。材料の準備(タスク3)とプロトコルスクリプトの生成(タスク4)の後、ピペットとコンテナの位置を定義することによってピペッティングモジュールが較正されます(タスク5)。次に、ワークステーション上でプロトコルスクリプトを実行し(タスク6)、混合物の検証と検証(タスク7)を行い、混合物を評価します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ピペッティングモジュールのオープンソースワークステーションとデッキのセットアップ (a)開発されたワークステーションは、サンプルが異なるモジュールを介して輸送される組立ラインアプローチに触発され、ピペッティング、架橋剤、貯蔵、輸送、および計算モジュールで構成されています。(b)ピペッティングモジュールのデッキは、実験レイアウト(例えば、ウェルプレートタイプ、チューブ容積など)に応じて設定される。表示されたデッキセットアップは、提示された実験に使用され、10−100μL(M100E)および100−1,000μL(M1000E)の範囲の正の変位ピペット、100μL(CP1000)および1,000μL(CP1000)用のキャピラリーピストン(CP)を備えたチップラック、ゴミ箱、混合トレイ、および入力試薬用の入力トレイからなる。(c) 利用可能なデッキ位置は、表示された番号で定義されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:グリセロール混合物の自動ピペッティングの結果。 (a)柔軟なワークステーション設計により、3つの異なるセットアップの評価(i)が再現可能な結果を得るための最適なパラメータを特定できます。(ii)チップタッチの追加と材料の加熱により、分散係数(CV)値が低下し、セットアップ3の再現性の高い混合物が得られました。各実験は96サンプルで行った。(iii)単一サンプル値のプロットは、ピペッティングシーケンスに影響を示さなかった。(b)各セットアップの実験結果をヒートマップで視覚化し、生/カラムの違い、エッジ、またはマスター混合物への影響を特定しました。(c) セットアップ 3 の再現性は、(i) 中央値、標準偏差、CV 値、および (ii) ヒートマップを使用して、8 回の独立した実行内で分析されました。パネル a-ii (n = 96)および b-i (n = 12)のデータには、平均と単一のデータポイントが表示されます。統計的有意性は、二元配置分散分析(ANOVA)を用いて****p < 0.0001として定義した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒドロゲルとの混合タスクの結果。 (a)ゼラチンメタクリロイル(GelMA)20%(w/v)ストック溶液から、96ウェルプレート(濃度あたりn = 12)を用いて、1回の実験実行内で14、12、10、8、6、4、2、および0%(w/v)の段階希釈液を生成した。(i)分散係数(CV)値は、調製された濃度全体で1.2%〜3.4%の間で変化し、(ii)線形回帰は、0.9869のR²値で高い適合を示した。(iii)均一な希釈液を、発生したヒートマップで目視で確認した。(b)ダブルネットワークヒドロゲルを、5%(w/v)GelMA、2%(w/v)アルギン酸塩、および0.15%(w/v)LAP(i)で、チップタッチの有無にかかわらず(各セットアップでn = 96)、400nmで2.0mW/cm2 の強度で30秒間架橋した。チップタッチの統合により、CV値が5.2%から3.4%に減少しました。(イ、ウ)ヒートマップは、先端から余分な材料を除去するために先端タッチを使用するときに、より少ない偏差を確認する。パネル a-i および b-i のデータには、平均と単一のデータ点が表示されます。統計的有意性は、一元配置分散分析(ANOVA)<用いて、*p < 0.05、***p < 0.0001、および ****p は 0.0001 と定義されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ピペットタイプの違いと粘性生体材料の問題の概要。 (a)試薬とピストンは、分注工程中に収縮し、吸引工程中に膨張するエアクッションによって分離される。粘性のある材料を吸引して分配するとき、遅い「流れ」は気泡や不規則なピペッティング動作などの問題を引き起こします。(b)正の変位ピペットは、先端の内側のピストンの使用により、粘性材料の信頼性の高い吸引および分配を可能にします。(c)高粘性材料(例えば、4%(w/v)アルギン酸塩)のピペッティングは、先端に過剰な材料の蓄積をもたらし、実験全体を通して不正確さをもたらす可能性がある。(d)シンプルなチップタッチトレイの実装により、チップ上の余分な材料を除去することができ、正確な吸引および分配量が得られます。これは、チップラック容器上に置かれたウェルプレート蓋の内側を使用することによって実現される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 素材#1(在庫濃度) | 材料の最終濃度#1 | 素材#2(在庫濃度) | 材料の最終濃度#2 | 材料#3(在庫濃度) | 材料の最終濃度#3 | 希釈液(オレンジG作業液) | 混合物中の最終オレンジG濃度 | 図に表示 |
| グリセロール (85% (w/v)) | 80% (w/v) | 水 (1 mg/mL オレンジ G) | 0.059 ミリグラム/mL | 図 3a−c | ||||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 0% (ワット/V) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 1ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 2% (ワット/バイ) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.85 ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 4% (ワット/バイ) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.75 ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 6% (税抜率) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.65 ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 8% (税抜) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.55 ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 10% (ワット/バイ) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.45 ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 12% (税抜率) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.35 ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 14% (ワット/V) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.25 ミリグラム/mL | 図4a | ||
| ゲルMA (20% (w/v)) | 5% (ワット/V) | アルギン酸塩 (4% (w / v)) | 2% (ワット/バイ) | ラップ (3% (ワット/ブー)) | 0.15% (ワット/V) | PBS (1 mg/mL オレンジ G) | 0.2 ミリグラム/ミリリットル | 図 4b |
表1:実施した実験のパラメータ概要。
| プロトコルのステップ | 問題 | 考えられる理由 | 解決 |
| 1.1 | ソフトウェアをインストールまたは更新できない | SDカードのディスク容量が不足しています | SDカードのディスク容量を確認してください。必要に応じて、不要なアイテムや空のビンを取り外すか、適切なサイズのSDカードを使用してください |
| 1.2 | API をインストールできません | ユーザーのインストール機能は制限されています (root ユーザー権限なし) | 指定されたコマンドの前に 'sudo'コマンドを使用して、管理者権限を取得します。Linux では、この種のアクセスはスーパーユーザーと呼ばれます。 |
| 3.1 | ゲルMAとのトラブル | 機能化、透析または凍結乾燥 | トラブルシューティングリストを含む詳細なステップバイステッププロトコルは、Loessner et al.33で入手可能である。 |
| 5.1 および 6.2 | ワークステーションがコマンドに反応しない | 接続の問題 | すべての電源を入れ、コンピュータをシャットダウンします。電源装置の電源を切り、10 秒間待ちます。コンピュータとワークステーションの電源を入れ直します。 |
| 5.1 および 6.2 | ワークステーションがコマンドに反応しない | 接続の問題 | コンピュータがUSB接続を認識し、USBポートが正しく定義されているかどうかを確認します。ファイアウォールが接続プロセスを妨げていないことを確認します(表2の下のリンクを参照)。 |
| 5.1 および 6.2 | ファイルを開くことができません | 間違ったディレクトリ | ダイレクタ(フォルダパス)をチェックして、正しいパスが使用されていることを確認します。ファイル(interface.py など)が見つからない場合は、間違ったパスが使用されている可能性があります。 |
| 6.6.2 | 先端が正しく取り付けられていない、または移動中に落下する | キャリブレーションの問題 | ピペットのキャリブレーション手順を繰り返し、キャピラリーピストンがピペットに正しく接続されていることを確認します。 |
| 6.6.2 | 先端が正しく取り付けられていない、または移動中に落下する | 添付ファイルの問題 | ピペットはピペット軸に正しく接続されておらず、移動ステップ中に移動します。これを防ぐためにネジをしっかり締めてください。 |
| 6.6.2 | 先端が材料の上に吸引されている | キャリブレーションの問題 | このトレイタイプのキャリブレーションを繰り返して、高さを適切に定義します。 |
| 6.6.2 | 先端が材料の上に吸引されている | キャリブレーションの問題 | チューブ内のボリュームを確認し、ボリュームがプロトコルデザイナアプリケーションで定義されたボリュームと等しいことを確認します。 |
| 6.6.2 | 移動中に材料が浸かっている | 先端に余分な材料が多すぎる | チップタッチドックオプションを追加します。任意選択で、先端接触の時間も長くすることができる。 |
| 6.6.2 | 材料が固体であるか、ピペッティングには粘性が高すぎる | 材料の温度応答性挙動 | 温度応答性材料の特性評価を確認し、それに応じて温度ドックの加熱/冷却温度を調整します。 |
| https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting | |||
表2:特定された問題、考えられる理由、および問題を解決するための解決策を含むトラブルシューティング表。
補足ファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
粘性物質、特に生物医学的用途のためのヒドロゲル19,20,21,33,47のピペッティングは、ユーザー定義濃度または様々な濃度の希釈シリーズを調製するための多くの研究室における日常的な作業である。これは反復的であり、実行はかなり単純ですが、ほとんどの場合、サンプルスループットが低くて手動で実行されます18。このチュートリアルでは、粘性材料用に特別に設計されたオープンソースワークステーションの動作を紹介し、粘性材料の自動混合を可能にして、所望の濃度を再現可能に生成します。このワークステーションは、ハイドロゲルのピペッティングに最適化されており、温度応答性材料用の温度ドック、粘性材料用の正の変位ピペット、およびチップから余分な材料を除去するオプションのチップタッチドックの統合により、自動で信頼性の高い取り扱いを可能にします。ピペッティングモジュールは、標準化された自動化された方法で粘性材料の処理を可能にするために特別に最適化されています。エアクッションピペット(図5a)と比較して、容積式ピペット(図5b)は、先端に残留材料を残さずに粘性のある材料を分配し、正確な吸引量と分配量をもたらします。オプションのチップタッチドックは、チップから余分なサンプル材料を除去し(図5c、d)、これは接着剤材料(例えば、4%(w / v)アルギン酸塩)に有用である。
プロトコール設計アプリケーションは、ヒドロゲル用に特別にプログラムされており、異なる濃度の最大4つの試薬と最大2つの希釈剤の希釈が可能です。最終希釈の計算におけるエラーのリスクは、ユーザーが所望の濃度または段階希釈ステップのみを選択するため、このアプリケーションでは防止されます。必要な吸引量と分注量は自動的に計算され、別のドキュメントテキストファイルに保存され、プロトコルスクリプトに入力されます。このプロトコル設計アプリケーションは、ユーザーがすべての実験パラメータ(ピペッティング速度など)を完全に制御し、重要なパラメータの内部文書化を保証します。プロトコル設計アプリは、リザーバの充填レベル(例えば、ウェル)を考慮に入れ、粘性材料への不必要な浸漬を防ぐために吸引/分配高さを変化させる。この統合された機能は、先端の外壁への材料の蓄積を回避し、それによって、プロトコル全体にわたって信頼性の高い吸引および分配タスクを保証します。プロトコールデザイナーアプリケーションはヒドロゲル希釈ステップ用に開発されましたが、オレンジG染料などの非粘性液体の希釈にも使用できます。プロトコルデザイナーアプリケーションは、リポジトリの '/examples/publication-JoVE' からアクセス可能で、プロトコルのセクションで説明され、ビデオで強調表示されているバージョンです。このバージョンは更新されません。ただし、プロトコル・デザイナー・アプリケーションの更新バージョンは、メイン・リポジトリー・ページから入手できます。キャリブレーションターミナルは、最初にSanderson48によって開発され、正の変位ピペットのキャリブレーション用に最適化されています。
プロトコルセクション4で説明したように、ピペットと容器は最初に較正する必要があります。このキャリブレーションプロセスは、動きの増分を計算するために使用される位置を定義して保存するために重要です。したがって、プロトコルの実行が成功するかどうかは、キャリブレーションポイントを間違えるとチップがコンテナにクラッシュする可能性があるため、明確に定義されたキャリブレーション位置に依存します。ピペットのプランジャー位置は手動で校正する必要があるため、ピペッティングの精度と精度は、実行される校正に大きく依存します。これらの校正手順は、ピペッティングモジュールのユーザーエクスペリエンスに大きく依存するため、適切な校正手順を確実にするために、最初に経験豊富なスタッフとのトレーニングをお勧めします。ピペッティングモジュールの手動キャリブレーションに加えて、正確なピペッティングを保証するためにピペット自体をキャリブレーションする必要があります。ISO 8655で規定されている合格基準を満たすために、少なくとも12ヶ月ごとにピペットを校正することをお勧めします。ピペットキャリブレーションを内部的に評価するために、Stangegaard et al.16によって記述されているように、検証および検証が利用可能である。
信頼性の高いデータセットを生成するためには、高品質の試薬から始めることが重要です。これは、バッチ間の変動がこのプロトコル内で生成された結果に影響を与える可能性があるため、ヒドロゲル処理タスクにとって特に重要です。バッチ間の変動に加えて、少量の調製における微妙な変化も特性の違いに寄与する可能性がある。これを防ぐために、実験全体に使用できるより大きなボリュームの準備が推奨されます。
検証および検証手順は、信頼性の高い混合物を識別するために染料の使用法に依存しています。提示されたプロトコルは、Orange Gの適用を記述しているが、一般的なプロトコルおよび分析ワークフローは、蛍光色素にも適合させることができる49,50。オレンジGの使用は、分光光度計の技術的要件を低減し、光に曝露した後の蛍光色素の漂白を防止するために取られた予防措置を排除する。色素の溶解挙動またはクラスター形成における問題は、実験中に提示された材料では観察されていないが、他の材料では現れる可能性がある。潜在的なクラスター形成、したがって色素と物質との間の相互作用は、顕微鏡で容易に検出することができた。
このチュートリアルで紹介する手順と技術は、粘性材料の現在のワークフローに自動化機能を追加し、最小限の人的労力で信頼性の高いタスクを実現します。提供されているトラブルシューティング表 (表 2) には、特定された問題が含まれ、考えられる理由と問題を解決するための解決策が示されています。提示されたワークステーションは、自動ピペッティング作業のための天然(ゼラチン、ジェランガム、マトリゲル)および合成(例えば、ポリ(エチレングリコール)[PEG]、プルロニックF127、ルトロールF127)ポリマー材料に首尾よく適用されている。特に、オープンソースワークステーションと粘性材料用に設計されたオープンソースプロトコル設計アプリケーションの組み合わせは、生物医学工学、材料科学、微生物学の分野で働く研究者にとって非常に有用です。
Disclosures
CMとDWHはGelomics Pty Ltd.の創設者および株主であり、CMはGelomics Pty Ltd.の取締役でもあります。著者は、この記事の主題に関連する利益相反を宣言しません。著者は、開示されたものを除いて、記事で議論されている主題または資料に金銭的利益または財政的矛盾を有する組織または団体と、他の関連する所属または財政的関与を有しません。
Acknowledgments
著者らは、QUTの再生医療センターのメンバー、特にアントニア・ホルストとパヴェル・ミェシュチャネクの有益な提案とフィードバックを認めている。この研究は、QUTのSEのための大学院研究賞と、助成金契約IC160100026(アディティブバイオマニュファクチャリングのARC産業変革トレーニングセンター)に基づくオーストラリア研究評議会(ARC)によって支援されました。NBは、National Health and Medical Research Council(NHMRC)Peter Doherty Early Career Research Fellowship(APP1091734)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
| 5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
| 50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
| 70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
| Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
| Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
| Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
| M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
| OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
| Equipment | |||
| Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
| Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
| Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
| Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
| Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
| Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
| Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |
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