Describimos métodos de fotoactivación de fluorescencia para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios periféricos de ratones transgénicos que expresan una proteína neurofilament fotoactivable.
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Artículo de método
Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado
En este artículo
Resumen
Resumen
Los polímeros de proteína de neurofilamento se mueven a lo largo de los axones en el componente lento del transporte axonal a velocidades medias de 0,35-3,5 mm/día. Hasta hace poco el estudio de este movimiento in situ sólo era posible utilizando el etiquetado de pulsos radioisotópicos, lo que permite el análisis del transporte axonal en nervios enteros con una resolución temporal de días y una resolución espacial de milímetros. Para estudiar el transporte de neurofilamento in situ con mayor resolución temporal y espacial, desarrollamos un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa la proteína de neurofilament M etiquetada con GFP fotoactivable en las neuronas. Aquí describimos los métodos de fuga de pulsos y propagación de pulsos de fluorescencia para analizar el transporte de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios tibiales de estos ratones ex vivo. Los segmentos nerviosos aislados se mantienen en la etapa del microscopio por perfusión con solución salina oxigenada y se visualizan mediante microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio. La luz violeta se utiliza para activar la fluorescencia en una ventana axonal corta. La fluorescencia en las regiones activadas y flanqueantes se analiza a lo largo del tiempo, permitiendo el estudio del transporte de neurofilamento con resolución temporal y espacial en el orden de minutos y micras, respectivamente. El modelado matemático se puede utilizar para extraer parámetros cinéticos del transporte de neurofilamento, incluyendo la velocidad, el sesgo direccional y el comportamiento de pausa de los datos resultantes. Los métodos de escape de pulsos y propagación de pulsos también se pueden adaptar para visualizar el transporte de neurofilamento en otros nervios. Con el desarrollo de ratones transgénicos adicionales, estos métodos también podrían utilizarse para crear imágenes y analizar el transporte axonal de otras proteínas citoesqueléticas y citosólicas en axones.
Introducción
El transporte axonal de neurofilamentos se demostró por primera vez en la década de 1970 mediante el etiquetado de pulsos radioisotópicos1. Este enfoque ha producido una gran cantidad de información sobre el transporte de neurofilamento in vivo,pero tiene una resolución espacial y temporal relativamente baja, típicamente en el orden de milímetros y días en el mejor2. Además, el etiquetado por pulsos radioisópicos es un enfoque indirecto que requiere la inyección y el sacrificio de múltiples animales para generar un solo curso de tiempo. Con el descubrimiento de proteínas fluorescentes y los avances en la microsc....
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.
1. Preparación de la solución salina nerviosa
- Hacer 100 mL de la solución salina de Breuer10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1.5 mM CaCl2, 5.6% D-glucose, 23.8 mM NaHCO3 en agua doble destilada.
- Burbuja 95% oxígeno/5% dióxido de carbono (carbógeno) a través de la solución salina durante al menos 30 minutos antes de su uso. La solución salina sobrante se puede reutilizar en el pl....
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Resultados
La Figura 3 muestra imágenes representativas de experimentos de escape de pulsos y de propagación de pulsos. Hemos publicado varios estudios que describen los datos obtenidos utilizando el método de escape de pulsos y nuestros métodos para el análisis de esos datos5,6,7,8,17. A continuación, mostramos cómo los datos de propagación.......
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Discusión
Se debe tener cuidado en el análisis de los experimentos de fuga de pulsos y propagación de pulsos porque existe un potencial significativo para la introducción de errores durante el postprocesamiento, principalmente durante la corrección de campo plano, la alineación de la imagen y la corrección del lejía. La corrección de campo plano es necesaria para corregir la no uniformidad en la iluminación, lo que resulta en una caída de intensidad en todo el campo de visión desde el centro hasta la periferia. El grado de no unif.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Paula Monsma por la instrucción y la asistencia con la microscopía confocal y la disección del nervio tibial y al Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger y Sana Chahande por su ayuda con la cría de ratones. Este trabajo fue apoyado en parte por la colaboración National Science Foundation Grants IOS1656784 to A.B. y IOS1656765 a P.J., y los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud R01 NS038526, P30 NS104177 y S10 OD010383 a A.B. N.P.B. fueron apoyados por una beca del Programa de Becas Postdoctorales del Presidente de la Universidad Estatal de Ohio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Junta rectangular de 14 x 22 0,1 mm | interior | Bioptechs | 1907-1422-100 |
| 2-desoxi-D-glucosa | Sigma | D6134 | |
| 30 mm Junta redonda con orificios | Bioptechs | 1907-08-750 | junta exterior |
| 35 x 10 mm | Platos de disección | Thermo Fisher | 153066 |
| cubreobjetos redondos de 40 mm | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| Jeringa de 60 ml - Punta Luer-lock | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD sistema confocal de discos | Andor | equipado con sistemas Perfect Focus y FRAPPA | |
| Cloruro de calcio | Fisher | C79 | |
| Cubreobjetos | Fisher | 12-541-B | para solución de fluoresceína |
| portaobjetos D-(+)-glucosa | Sigma | G8769 | |
| Alfileres de disección | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Pinza de disección | Fine Science Tools | 11251-30 | pinza de punta fina |
| Microscopio de disección | Zeiss | 47 50 03 | |
| Bandeja de disección con cera | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Tijeras de disección | Fine Science Tools | 14061-09 | initial tijera de disección |
| FCS2 cámara de perfusión | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluoresceína sódica | Fluka | 46960 | |
| Calentador de solución en línea | Warner Instruments | SH27-B | |
| pinza de laminectomía | Fine Science Tools | 11223-20 | pinza de disección inicial |
| Sulfato de magnesio | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| portaobjetos de microacueducto | Bioptechs | 130119-5 | |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher | 12-544-3 | para portaobjetos de fluoresceína |
| inserto de platina para microscopio | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Sistema de calentamiento de objetivos | Okolab | Oko Touch con collar de objetivo | |
| Aceite de objetivo - tipo A | Nikon | descatalogado | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objetivo | Nikon | MRD01901 | |
| Cloruro de potasio | Fisher | P217 | |
| Fosfato de potasio | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodio iodoacetato | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Bomba de jeringa | Sage Instruments Modelo | 355 | |
| Adaptador de tubo - hembra | Small Parts Inc. | ||
| Adaptador de tubo - macho | Small Parts Inc. | ||
| Tubo 1005012 Tygon | Bioptechs 1 | /16" de diámetro interior, 1/32" de espesor de pared | |
Referencias
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport.
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Reimpresiones y permisos
