Artículo de método

Aplicación de un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional para inducir la diferenciación tenogénica de células madre derivadas del tendón

DOI:

10.3791/61278

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1 de agosto de 2020

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1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional es un biorreactor ideal para la diferenciación tenogénica específica de las células madre derivadas del tendón y la formación de neo tendones.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tendinopatía es una enfermedad del tendón crónico común relacionada con la inflamación y la degeneración en un área ortopédica. Con alta morbilidad, capacidad de autorreparación limitada y, lo que es más importante, sin tratamientos definitivos, la tendinopatía todavía influye negativamente en la calidad de vida de los pacientes. Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendones, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía. Por lo tanto, un método que puede imitar in vitro la diferenciación in vivo de los ETDSC en las células tendinosas sería útil. Aquí, el presente protocolo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejidos similares a los tendones. Existen siete etapas del presente protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. La eficacia fue demostrada por la histología. Todo el procedimiento toma menos de 3 semanas. Para promover la deposición de matriz extracelular, se utilizó 4,4 mg/ml de ácido ascórbico en el medio de cultivo de estimulación. Una cámara separada con un motor lineal proporciona una carga mecánica precisa y es portátil y se ajusta fácilmente, que se aplica para el biorreactor. El régimen de carga en el presente protocolo fue 6% cepa, 0,25 Hz, 8 h, seguido de 16 h de descanso durante 6 días. Este protocolo podría imitar la diferenciación celular en el tendón, lo cual es útil para la investigación del proceso patológico de tendinopatía. Por otra parte, el tejido similar al tendón se utiliza potencialmente para promover la cicatrización del tendón en la lesión del tendón como un injerto autólogo diseñado. En resumen, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.

Introducción

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La tendinopatía es una de las lesiones deportivas comunes. Se manifiesta principalmente por el dolor, hinchazón local, disminución de la tensión muscular en la zona afectada, y disfunción. La incidencia de tendinopatía es alta. La presencia de tendinopatía de Aquiles es más común para los corredores de media y larga distancia (hasta 29%), mientras que la presencia de tendinopatía rotuliana también es alta en los atletas de voleibol (45%), baloncesto (32%), pista y campo (23%), balonmano (15%), y fútbol (13%)1,,2,3,,4,5. Sin embargo, debido a la limitada capacidad de autocuración del tendón, y la falta de tratamientos eficaces, la tendinopatía todavía influye en la vida de los pacientes negativamente6,7. Además, la patogénesis de la tendinopatía sigue sin estar clara. Ha habido muchas investigaciones sobre su patogénesis, incluyendo principalmente "teoría de la inflamación", "teoría de la degeneración", "teoría del uso excesivo", y así sucesivamente8. En la actualidad, muchos investigadores creían que la tendinopatía se debía a la reparera fallida de las microlesiones causadas por la carga mecánica excesiva del tendón experimenta9,,10.

Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendonesas, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía11,12,13. Se informó que la estimulación mecánica del estrés podría causar la proliferación y diferenciación de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células madre mesenquimales y otras células sensibles a la fuerza14,15,16,17,18. Por lo tanto, los TDSC, como una de las células mecanósensibles y multipotentes, pueden ser estimulados de manera similar para diferenciar por carga mecánica19,20.

Sin embargo, diferentes parámetros de carga mecánica (fuerza de carga, frecuencia de carga, tipo de carga y período de carga) pueden inducir a los TDSC a diferenciarse en diferentes celdas21. Por lo tanto, un régimen de carga mecánica eficaz y válido es muy significativo para la tenogénesis. Además, existen diferentes tipos de biorreactores como sistemas de estimulación utilizados actualmente para proporcionar carga mecánica a los TDSC. Los principios de cada tipo de biorreactor son diferentes, por lo que los parámetros de carga mecánica correspondientes a diferentes biorreactores también son diferentes. Por lo tanto, se demanda un protocolo de estimulación simple, económico y reproducible, incluyendo el tipo de biorreactor, el medio de estimulación correspondiente y el régimen de carga mecánica.

El presente artículo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejido similar al tendón. Hay siete etapas del protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante el cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. Todo el procedimiento tarda menos de 3 semanas en obtener la construcción de la célula 3D, que es mucho menor que algunos métodos existentes22,,23. Se ha demostrado que el presente protocolo es capaz de inducir a los ETS para que se diferencien en tejido tendino, y es más fiable que el sistema de estiramiento bidimensional (2D) de uso comúnactual 21. La eficacia fue demostrada por la histología. En definitiva, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.

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Protocolo

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Los métodos descritos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices y regulaciones del Comité de Etica Animal de la Universidad de Australia Occidental.

1. Aislamiento de ratones TDSC

  1. Eutanasia los ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad por luxación cervical.
  2. Cosecha de tendonesrotulosos 24 y tendones de Aquiles25.
  3. Digerir tendones de uno con 6 ml de colagenasa de tipo I (3 mg/ml) durante 3 h.
    NOTA: Como el tamaño del tendón en el ratón es pequeño, todos los tendones cosechados de un ratón deben utilizarse en este paso.
  4. Recoger las células y el cultivo en medio esencial mínimo completo (Alpha-MEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de la mezcla de estreptomicina y penicilina durante 7 días.
  5. Identificar los TDSC mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia por citometría de flujo (expresión de marcadores de superficie celular, incluidos CD44, CD90 y Sca-1; falta de expresión de CD34 y CD45).
  6. Células de paso y congelación (el paso 4 células se utilizará para pasos adicionales).

2. Cultivo y expansión de ratones TDSC

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Tome las células calentadas (ratones TDSC, 1 millón de células, paso 4, a 37 oC).
  2. Agregue lentamente 4-5 mL adicionales de medio esencial mínimo completo (Alpha-MEM).
  3. Transfiera la mezcla a un tubo centrífugo de 15 ml con una pipeta.
  4. Reta con un total de medio a 8 ml con una pipeta.
    1. Precalentar el medio en una incubadora de horno de 37oC.
  5. Coloque el tubo en centrífuga y equilibre.
  6. Células centrífugas y pellets a 347 x g durante 5 min.
  7. Sacar después de la centrífuga y comprobar el pellet en la parte inferior.
  8. Decantar el medio de congelación, y resuspend las células suavemente en 1-2 mL de medio completo (evitar hacer demasiadas burbujas).
  9. Transfiera las celdas resuspendidas a un matraz T-75 por una pipeta.
  10. Utilice una pipeta para añadir el medio Alfa-MEM completo al matraz para alcanzar un volumen total de 10 ml con una concentración final de 13.000 células/cm2.
  11. Colocar el matraz en la incubadora y en forma de cultivo a 37oC con un 5% de CO2.
  12. Cambie el medio cada 3 días.
  13. Observar y monitorear las células bajo un microscopio al cambiar el medio hasta que las células se cultivan a 100% confluencia (alrededor de 40.000 células/cm2).

3. Preparación del medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Vierta 15 ml de medio Alpha-MEM completo en un tubo estéril de 15 ml.
  2. Añadir 6 l de ácido ascórbico (11 mg/ml) en 15 ml de medio para una concentración final de 4,4 g/ml.
    NOTA: Además, añadir un factor de crecimiento del tejido conectivo de 25 ng/ml en el medio de cultivo de estimulación puede acelerar todo el proceso de crecimiento y diferenciación.
  3. Mezclar suavemente invirtiendo hacia arriba y hacia abajo.

4. Formación de láminas celulares mediante el cultivo en medio de estimulación

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Deseche cuidadosamente el medio alfa-MEM completo normal y evite tocar las celdas unidas a la parte inferior del matraz.
  2. Añadir 10 ml de medio de estimulación lentamente y evitar causar ninguna alteración a las células completamente confluentes.
  3. Cultivo de las células en medio de estimulación durante 9 días (cambiar el medio cada 3 días) para generar suficientemente la hoja celular a 37 oC con 5% de CO2.
    NOTA: La matriz extracelular se volverá gruesa y presente para estar turbia cuando se observa desde la parte inferior del matraz después de estimularse por ácido ascórbico, lo que significa que la hoja celular está suficientemente generada.

5. Preparación de la construcción de células madre del tendón 3D

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Saque el matraz de la incubadora.
  2. Deseche completamente el medio de estimulación.
  3. Lave la lámina celular monocapa con solución salina tampón de fosfato (PBS) girando el matraz.
  4. Deseche el PBS por completo.
  5. Utilice una pipeta para añadir 1 ml de 0,25% de trippsina a la esquina del matraz.
  6. Toque la esquina del matraz para desajuntar la hoja de celda monocapa hasta que la esquina de la hoja de celda esté fuera de la parte inferior del matraz.
  7. Añadir inmediatamente 9 ml de medio Alfa-MEM completo para detener la tripsinación.
  8. Continúe girando el matraz para despegar completamente la lámina de celda monocapa.
  9. Vierta la hoja de celda total desajunida en un plato de Petri con un medio.
  10. Utilice una pinza estéril para recoger una esquina de la hoja de celda y gire en el sentido de las agujas del reloj durante 15 veces.
  11. Recoja otro extremo de la hoja de celda y gire en sentido antihorario durante 10 veces para generar firmemente una construcción in vitro similar a un tendón(Figura 1A).

6. Montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial en un biorreactor de diseño único

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Conecte los ganchos del conectador y ajuste a la distancia deseada (2 cm) entre dos ganchos.
  2. Enrolle suavemente la construcción de los TDSC 3D en el gancho montado 3 veces en cada gancho (Figura 1B).
  3. Fije los ganchos con la construcción de la célula en la cámara del biorreactor apretando los tornillos en dos extremos.
    NOTA: Toda la cámara, incluidos los tornillos y ganchos, es estéril (autoclave durante 1,5 h a 134 oC y los rayos ultravioleta (UV) exponen durante 24 horas antes de su uso). Para el soporte de metal de las cámaras, la luz UV se expone durante 48 horas antes de su uso.
  4. Llene la cámara con un medio Alfa-MEM completo.
  5. Conecte el actuador a la cámara de cultivo por cable.
  6. Corte el comediante de ganchos con tijeras estériles.
  7. Encienda la alimentación y el controlador de canal correspondiente para iniciar la estimulación mecánica.
  8. Pon la tapa en la cámara.
  9. Compruebe las luces indicadoras y asegúrese de que el biorreactor pueda funcionar correctamente.
  10. Poner el biorreactor en la incubadora y someter la construcción de la célula 3D a estiramiento mecánico durante 6 días (6% de estiramiento, 0,25 Hz, 8 h, seguido de 16 h de descanso).

7. Evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro

  1. Afloje los tornillos con un destornillador y retire el conjunto con cuidado.
  2. Poner el tejido similar al tendón en 4% de paraformaldehído para fijación durante 15 min.
  3. Coloque el tejido similar al tendón fijo en un casete de biopsia con almohadillas de espuma de biopsia.
  4. Proceso para deshidratar la muestra y finalmente evaluar por tinción histológica H&E.
  5. Repita todo el protocolo y extraiga el ARN del tejido similar al tendón para evaluar la expresión de marcadores tenogénicos por PCR cuantitativo (qPCR). Los primeres para los genes seleccionados se enumeran en la Tabla 1.
    NOTA: El protocolo de histología y el protocolo qPCR son estándar y siguen un estudio anterior21.

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Resultados

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Antes de la estimulación mecánica, los TDSC crecieron al 100% de confluencia en un medio completo y mostraron una morfología ultraestructural desorganizada(Figura 2A). Después de 6 días de estiramiento uniaxial de carga mecánica, matriz extracelular (ECM) y alineaciones celulares fueron bien orientados (Figura 2B). Las células estaban bien pobladas y bien envueltas en ECM después de la carga mecánica. La morfología celular se presentó para ser alargada y era más similar a la célula del t...

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Discusión

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El tendón es un tejido conectivo fibroso mecanosensible. Según investigaciones anteriores, el exceso de carga mecánica podría conducir a la diferenciación osteogénica de las células madre del tendón, mientras que la carga insuficiente conduciría a una estructura desordenada de la fibra de colágeno durante la diferenciación del tendón21.

Una opinión común es que la clave para un biorreactor ideal es la capacidad de simular el microambiente celular in vitro que sufren las...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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La investigación se llevó a cabo mientras el autor estaba en la recepción de "una beca de tasa internacional de la Universidad de Australia Occidental y un premio de postgrado de la universidad en la Universidad de Australia Occidental". Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81802214).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido ascórbicoSigma-aldrichPHR1008-2G
Suero fetal bovino (FBS)Gibcoä de Life Technologies1908361
Procesador de histologíaLeicaTP 1020
Medio esencial mínimo (Alpha-MEM)Gibcoä de Life Technologies2003802
célulamadre derivada del tendón de ratónAislado de tendones de Aquiles de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad. Luego se digiere con colagenasa tipo I (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) durante 3 h y se pasó a través de un colador de celdas de 70 mm para producir suspensiones de celdas individuales.
ParaformaldehídoSigma-aldrich441244
Mezcla de estreptomicina y penicilinaGibcoä de Life Technologies15140122
Sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensionalCentro de Investigación Ortopédica Traslacional, Facultad de Medicina, Universidad de Australia OccidentalDisponible a petición del autor para correspondencia. O hágalo de acuerdo con nuestro diseño* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. La estimulación mecánica programable influye en la homeostasis del tendón en un sistema de biorreactor. Biotechnol Bioeng. 2013; 110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
TripsinaGibcoä por Life Technologies1858331

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