El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.
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Artículo de método
Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo
En este artículo
Resumen
Resumen
La modulación optogenética de las subpoblaciones neuronales en el cerebro ha permitido a los investigadores diseccionar los circuitos neuronales in vivo y ex vivo. Esto proporciona una premisa para determinar el papel de los tipos de neuronas dentro de un circuito neuronal y su importancia en la codificación de la información en relación con el aprendizaje. Del mismo modo, el método se puede utilizar para probar la importancia fisiológica de dos o más regiones cerebrales conectadas en animales despiertos y anestesiados. El estudio actual demuestra cómo las neuronas de glutamato VTA modulan la tasa de disparo de las neuronas piramidales putativas en el CA1 (hipocampo) de ratones anestesiados. Este protocolo emplea el etiquetado dependiente del virus adenoasociado (AAV) de las neuronas de glutamato VTA para el rastreo de los terminales presinápticos de glutamato VTA en las capas del hipocampo. La expresión de opsina controlada por la luz (canalrodopsina; hChR2) y proteína de fluorescencia (eYFP) albergada por el vector AAV permitió el rastreo anterógrado de los terminales de glutamato VTA y la fotoestimulación de los cuerpos celulares de las neuronas de glutamato VTA (en el VTA). Se colocaron electrodos de silicio agudo de alta impedancia en el CA1 para detectar respuestas de unidades múltiples y de una sola unidad a la fotoestimulación VTA in vivo. Los resultados de este estudio demuestran la distribución dependiente de capas de los terminales presinápticos de glutamato VTA en el hipocampo (CA1, CA3 y DG). Además, la fotoestimulación de las neuronas VTA glutamato aumentó la velocidad de disparo y estallido de las supuestas unidades piramidales CA1 in vivo.
Introducción
En la última década, se desarrolló una serie de herramientas genéticas para aumentar la especificidad de la modulación de tipo neuronal y el mapeo de redes neuronales complejas1. En particular, los virus neurotrópicos con una capacidad inherente para infectar y replicarse en las células neuronales se han desplegado para expresar o extirpar proteínas específicas en subclases de neuronas. Al albergar proteínas de fluorescencia o indicadores de actividad sináptica codificados genéticamente, los vectores AAV transfectados etiquetan y delinean las redes neuronales a través de las regiones cerebrales2,
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales y de manejo de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Louisiana.
1. Animal de experimentación
- Use ratones de 5 a 6 semanas de edad.
- Casa de 3 a 5 animales por jaula en condiciones estándar de 12 h alternando ciclo de luz y oscuridad. Los alimentos y el agua deben proporcionarse ad libitum.
2. Craneotomía y preparación animal
NOTA: Esta sección describe los procedimientos pre y perioperatorios para la cran....
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Resultados
Rastreo anterógrado
La expresión de AAV se verificó mediante imágenes de inmunofluorescencia de la proteína reportera (eYFP) en el VTA de ratones C57BL/6 21 días después de la inyección(Figura 2). El etiquetado anterógrado exitoso de las proyecciones presinápticas de glutamato VTA en el hipocampo también se verificó mediante la detección de eYFP en las capas de DG, CA3 y CA1 (Figura 6a-d; Películas 2 y 3).
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Discusión
En la última década, el diseño de las construcciones AAV ha avanzado significativamente. Como tal, se han incorporado más promotores específicos de neuronas en una serie de serotipos AAV para mejorar la especificidad de la transfección14. Al combinar genes para proteínas de fluorescencia, transportadores, receptores y canales iónicos, ahora existen bibliotecas de AAV para imágenes, neuromodulación y detección de actividad sináptica. En construcciones AAV disponibles comercialmente, una combinación.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo está financiado por CBS Bridging Grant otorgado a OOM. OOM, PAA y AS diseñaron el estudio y realizaron los experimentos. AS y PAA analizaron los resultados. OOM y PAA prepararon el manuscrito. Agradecemos al Dr. Karl Disseroth (Universidad de Stanford) por hacer que el AAV esté disponible para nuestro uso.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Peróxido de hidrógeno al 3% Fisher | químico | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Plásmido de Addgene #26969 | ||
| Cable | |||
| BNC Amazon BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Taguito de acoplamiento para Ø Casquillos de 1,25 mm. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Taladro | Dremel | LR 39098 | |
| Portaobjetos recubiertos de gelatina | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Jeringa de Hamilton (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Adaptador de platina | de cabeza Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| Sonda de silicio de alta impedancia | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| Controlador de grabación INTAN 512ch Solución | INTAN RHD2000 | ||
| Dynarex | 1425 | ||
| Isoflurano | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Espectro de ketamina | K1068 | ||
| Controlador LED | Thorlabs | LEDD1B | |
| Fuente de luz LED (470 nm)-luz azul | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulador | Narishige | M0-203 | |
| Fibra óptica | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Tornillo philips de cabeza plana (M0.6 X 2 mm) | Amazon | M0.6 X 2 mm | |
| Cabezal de preamplificador (32 canales) | INTAN | C3314 | |
| Marco estereotáxico | Kopf | 1530 | |
| TTL Pulsador | Prizmatix | 4031 | |
| Uretano | Sigma | U2500 | |
| Xilacina | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prisma | Software GraphPad | versión 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | versión 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | versión 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | versión 4.5 | |
| ACSF Composición: ACSF fuertemente oxigenado con 95% > oxígeno/5%CO2 que se burbujea constantemente a través de | |||
| la ACSF (ACSF; en mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 y 25 de glucosa). |
Referencias
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neura....
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Reimpresiones y permisos
