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Artículo de método

Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

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DOI:

10.3791/61282

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9 de septiembre de 2020

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

En este artículo

Resumen

El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.

Resumen

La modulación optogenética de las subpoblaciones neuronales en el cerebro ha permitido a los investigadores diseccionar los circuitos neuronales in vivo y ex vivo. Esto proporciona una premisa para determinar el papel de los tipos de neuronas dentro de un circuito neuronal y su importancia en la codificación de la información en relación con el aprendizaje. Del mismo modo, el método se puede utilizar para probar la importancia fisiológica de dos o más regiones cerebrales conectadas en animales despiertos y anestesiados. El estudio actual demuestra cómo las neuronas de glutamato VTA modulan la tasa de disparo de las neuronas piramidales putativas en el CA1 (hipocampo) de ratones anestesiados. Este protocolo emplea el etiquetado dependiente del virus adenoasociado (AAV) de las neuronas de glutamato VTA para el rastreo de los terminales presinápticos de glutamato VTA en las capas del hipocampo. La expresión de opsina controlada por la luz (canalrodopsina; hChR2) y proteína de fluorescencia (eYFP) albergada por el vector AAV permitió el rastreo anterógrado de los terminales de glutamato VTA y la fotoestimulación de los cuerpos celulares de las neuronas de glutamato VTA (en el VTA). Se colocaron electrodos de silicio agudo de alta impedancia en el CA1 para detectar respuestas de unidades múltiples y de una sola unidad a la fotoestimulación VTA in vivo. Los resultados de este estudio demuestran la distribución dependiente de capas de los terminales presinápticos de glutamato VTA en el hipocampo (CA1, CA3 y DG). Además, la fotoestimulación de las neuronas VTA glutamato aumentó la velocidad de disparo y estallido de las supuestas unidades piramidales CA1 in vivo.

Introducción

En la última década, se desarrolló una serie de herramientas genéticas para aumentar la especificidad de la modulación de tipo neuronal y el mapeo de redes neuronales complejas1. En particular, los virus neurotrópicos con una capacidad inherente para infectar y replicarse en las células neuronales se han desplegado para expresar o extirpar proteínas específicas en subclases de neuronas. Al albergar proteínas de fluorescencia o indicadores de actividad sináptica codificados genéticamente, los vectores AAV transfectados etiquetan y delinean las redes neuronales a través de las regiones cerebrales2,3. La elección de un promotor en el constructo AAV dirige la expresión del vector en tipos de neuronas con cierto nivel de especificidad (expresióndependiente del promotor). Sin embargo, a través de la recombinación de Cre-lox, los constructos AAV se despliegan con mayor especificidad para el etiquetado neuronal4,5,6,7. Cabe destacar que las opsinas microbianas fotoactivadas y las proteínas de fluorescencia empaquetadas en vectores AAV se pueden expresar en varios subtipos de neuronas8,y son ideales para imágenes, trazado de circuitos de tipo neuronal y fotomodulación9,10.

Las construcciones de AAV inyectadas estereotácticamente en una región del cerebro (o núcleo) impulsan la expresión de la proteína reportera en los terminales soma, dendrita y axones. La expresión neuronal de AAV que alberga un gen reportero (eYFP) facilita el etiquetado de los cuerpos celulares de las neuronas y el rastreo anatómico de las proyecciones hacia y desde otras regiones del cerebro11,12,13,14. Las construcciones AAV-eYFP que transportan opsina controlada por la luz (por ejemplo, hChR2), se pueden implementar como una herramienta para obtener imágenes6,15 y el rastreo fisiológico basado en la estimulación de proyecciones neuronales para apuntar a áreas cerebrales in vivo16. Dependiendo del serotipo AAV, la dirección del etiquetado neuronal puede ser anterógrada o retrógrada11,12. Estudios previos han establecido que AAV5 viaja anterógradamente en las neuronas12. Así, la fotoestimulación de cuerpos celulares que expresan hChR2 produce efectos presinápticos en otras partes del cerebro (diana)17.

Aquí, AAV (serotipo 5) con un promotor CaMKIIα se utilizó para expresar eYFP (reportero) y hChR2 (opsina) en neuronas glutamato VTA y proyecciones axonales. Los resultados de este estudio demuestran la distribución dependiente de capas de los terminales presinápticos VTA-glutamato en las regiones del hipocampo CA1, CA3 y DG. Además, la fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA aumentó las tasas de disparo in vivo de ca1 de varias unidades y unidades únicas en comparación con los valores basales. Este protocolo utiliza herramientas asequibles y software disponible comercialmente que puede aumentar la calidad de los datos obtenidos de los experimentos de rastreo de circuitos neuronales.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y de manejo de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Louisiana.

1. Animal de experimentación

  1. Use ratones de 5 a 6 semanas de edad.
  2. Casa de 3 a 5 animales por jaula en condiciones estándar de 12 h alternando ciclo de luz y oscuridad. Los alimentos y el agua deben proporcionarse ad libitum.

2. Craneotomía y preparación animal

NOTA: Esta sección describe los procedimientos pre y perioperatorios para la craneotomía de ratón. Utilice aparatos estereotácticos estándar y coordenadas apropiadas (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML y Dorsoventral: DV). Consulte un atlas cerebral de ratón para determinar las coordenadas de la región cerebral de interés.

  1. Anestesiar ratones mediante inyección de cóctel intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg). Realice una prueba de pellizco del dedo del dedo deldo del día para garantizar la ausencia de sensibilidad antes del comienzo de la cirugía.
    NOTA: Alternativamente, la anestesia isoflurano con una cámara nasal adecuada también se puede utilizar para este paso.
  2. Fije suavemente la cabeza del animal en el aparato estereotáxico.
    NOTA: Es importante manejar a los animales con precaución durante este proceso. Además, verifique la frecuencia respiratoria y otros signos vitales antes de proceder con la cirugía. Deje que el animal descanse durante ~ 7 minutos para reducir el estrés.
    1. Coloque una almohadilla térmica en el marco estereotáxico de modo que el cuerpo del animal esté acostado sobre él. Esto ayudará a mantener la temperatura corporal y mantener al animal caliente durante todo el procedimiento. Conserve la almohadilla térmica para el cuidado postoperatorio y la recuperación.
  3. Use un cortapelos para eliminar el vello sobre el cuero cabelludo y limpie la piel con una solución de yodo.
    1. Aplique lidocaína tópica para bloquear la sensación en el cuero cabelludo.
    2. Use un bisturí para hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo que se extienda desde el frente hasta la región occipital.
    3. Limpie el área de la incisión con solución de yodo, luego exponga la calvaria.
      NOTA: Se puede aplicar una pequeña cantidad de solución de peróxido de hidrógeno al 3% para eliminar el periostio de la calvaria. Esto aumentará la visibilidad de los puntos de referencia (bregma y lambda) y las suturas.
    4. Usando un atlas estereotáctico cerebral de ratón, determine las coordenadas AP y ML en relación con el bregma.
    5. Para la inyección de VTA, coloque una jeringa de aguja de punta roma ultrafina (por ejemplo, jeringa Neuros) en las coordenadas AP: -3.08 mm / ML: 0.5 mm en relación con el bregma.
    6. Use una herramienta de perforación para perforar un orificio de 1 mm (craneotomía) en el cráneo en la coordenada MARCADA AP / ML.
      NOTA: Este paso requiere un nivel significativo de precaución. Se debe aplicar una presión mínima durante la perforación para evitar que la broca aplaste el tejido cerebral. En el estudio actual, la broca fue de 0,8 mm y la velocidad de perforación se estableció en 15.000 rpm.
      PRECAUCIÓN: Si se utilizó peróxido de hidrógeno en la limpieza de la incisión o la calvaria, asegúrese de la eliminación total de la solución o permita una sequedad completa antes de perforar.

3. Inyección de cóctel AAV

NOTA: Esta sección describe el proceso para la inyección de AAV en el VTA de ratones adultos C57BL/6 (23–27 g). El método descrito se puede utilizar para la inyección de AAV en cualquier región del cerebro utilizando un aparato estereotáctico estándar y las coordenadas apropiadas. Para demostrar este protocolo, eYFP y hChR2 se expresaron en neuronas glutamato VTA utilizando transfección mediada por AAV5 bajo un promotor CaMKIIα(Figura 1). La recombinación Cre-lox también se puede utilizar para este paso.

  1. Monte una jeringa con aguja ultrafina de punta roma (32 G; capacidad de 5 μL con una precisión de 100 nL) en un inyector. Fije el soporte de la jeringa en un micromanipulador.
    NOTA: Para este procedimiento, se utilizó un soporte de jeringa manual, con calibración de 1.6 nL. También se puede utilizar un inyector automático.
  2. Llene la jeringa con agua destilada doble para limpiar y probar el flujo de líquido.
  3. Descongelar las alícuotas del cóctel AAV (serotipo 5) sobre hielo. Los AAV se almacenan mejor a -80 ° C para mantener el título viral para una buena expresión.
  4. Llene la jeringa montada con 1.000 nL de solución AAV (10 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4). Dispense 10 nL de la solución AAV para confirmar el flujo del líquido antes de bajar la aguja a un sitio de inyección.
  5. Utilice un micromanipulador para bajar la aguja estereotácticamente a la profundidad deseada (coordenada DV). Después de bajar la aguja a la profundidad deseada, deje que la jeringa permanezca en su lugar durante 10 minutos antes de la inyección.
    NOTA: Para este procedimiento, la aguja se bajó en el VTA a una profundidad (DV) de 4,5 mm desde la superficie pial del cerebro. Para otras áreas del cerebro, use la coordenada dorsoventral apropiada (consulte el atlas cerebral del ratón).
  6. Inyecte 600–800 nL de AAV en el VTA. El volumen de inyección se puede ajustar dependiendo del tamaño del sitio objetivo.
    1. Entregue la solución AAV a una velocidad de 60 nL/min (intervalo de 3 min).
    2. Para expresar eYFP y hChR2 en neuronas y proyecciones de glutamato VTA, inyecte AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
      NOTA: El método de recombinación Cre-lox también se puede utilizar dependiendo del objetivo del experimento.
    3. Deje que la aguja permanezca en su lugar durante 15 minutos después de la inyección de AAV. Esto reducirá la difusión y el reflujo.
  7. Retire la aguja de la jeringa y luego suture la incisión para cerrar la herida.
  8. Administrar antibióticos y analgesia como parte de la atención postoperatoria. Coloque el ratón en una plataforma acolchada caliente y controle al animal hasta que esté despierto.
    NOTA: Después de 3 semanas de inyección, la expresión de AAV se puede observar mediante la detección de fluorescencia de la proteína reportera (eYFP) en las secciones cerebrales de ratón. Además, los experimentos de fotoestimulación se pueden realizar después de 3 semanas(Figura 2).

4. Configuración para grabaciones neuronales in vivo con optogenética

NOTA: Esta sección describe los pasos para el registro neuronal agudo con el rastreo optogenético de un circuito cerebral (proyección de la neurona de glutamato VTA al CA1). Si es necesario, verifique el sistema (amplificador y conexiones) para detectar problemas de ruido eléctrico y conexión a tierra antes de comenzar este paso. Realizar este paso en una jaula de Faraday puede ayudar a eliminar el ruido eléctrico en la grabación.

  1. A las 3 semanas después de la inyección de AAV, anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de uretano (0,2 mg/kg).
    PRECAUCIÓN: El uretano es cancerígeno y debe manipularse con precaución mientras se usa equipo de protección. Además, la administración de anestesia con uretano a esta concentración no es supervivencia.
  2. Coloque la cabeza del animal en un marco estereotáctico como se describió anteriormente (paso 2.2, Figura 3A). Realizar una craneotomía para exponer la duramadre (Figura 3A). Utilice una herramienta de perforación (tamaño de broca: 0,8 mm, velocidad: 15.000 rpm) para extraer parte del hueso parietal.
    1. La craneotomía debe ser de aproximadamente 3 mm x 4 mm de ancho. Aplique gotas de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) sobre esta área para prevenir la sequedad.
  3. Bajo un microscopio de disección (digital), use una punta de aguja doblada (27 G) para extirpar la duramadre expuesta. Tenga cuidado de no separar la delicada cubierta pial y los tejidos corticales en esta área.
  4. Perforar un orificio en el hueso occipital (tamaño de la broca: 0,8 mm, velocidad: 10.000 rpm) para sujetar el tornillo de tierra (tornillo Phillips de cabeza de sartén; M0,6 x 2,0 mm).
  5. Conecte un cable de tierra de acero inoxidable.
    NOTA: También se pueden utilizar otros tipos de cables(Figura 3b).
  6. Para la fotoestimulación combinada (VTA) y la grabación neuronal (CA1), utilice un aparato estereotáxico multirraíl equipado con micromanipuladores ultrafinos (10 μm o 1 μm). Monte la fibra óptica y la sonda neuronal de grabación en un micromanipulador de rango de 10 μm y 1 μm de rango, respectivamente.
    1. Si es necesario, utilice un adaptador de sonda de etapa de cabeza(Figura 3c).
      NOTA: En el protocolo actual, se equipó un escenario de cabeza de 32 canales con un adaptador para sostener un electrodo de grabación de 4canales (Figura 3d). El cable de tierra de acero inoxidable se soldó al puerto de conexión a tierra del adaptador.
  7. En coordenadas AP: -3.08 mm ML: 0.5 mm, baje la fibra óptica de 400 μm de diámetro en el VTA.
    1. Antes de bajar la fibra óptica, conecte la virola a un cable de fibra óptica (con férula de acero inoxidable o cerámica) conectado a una fuente LED acoplada a fibra.
      NOTA: Asegúrese de que la intensidad de la luz y el enfoque se ajusten como desee. La elección de la fuente de luz LED debe corresponder a las opsinas a las que se dirige. Aquí, se utilizó un controlador LED de 470 nm (luz azul) para la fotoactivación hChR2(Figura 4a).
    2. Para sincronizar el pulso de luz con la grabación neuronal, conecte el controlador LED y el puerto IN digital del controlador de grabación a un pulser lógico transistor-transistor (TTL)(Figura 4b). Esto se puede lograr utilizando un divisor BNC.
      NOTA: El uso de un pulsador TTL proporciona la flexibilidad de configurar digitalmente la frecuencia y la duración deseadas del tren de impulsos. En el protocolo actual, se activaron pulsos de luz de 10 ms a 50 Hz18. Para el control TTL del controlador LED, cambie el controlador a "disparador". En este modo, la intensidad de la luz se puede regular girando la "perilla". La frecuencia de estimulación se puede ajustar para acomodar variables experimentales y puede variar de 1 a 100 Hz. Para el rastreo de circuitos neuronales, se recomienda una frecuencia de estimulación de >20 Hz.
    3. Ajuste la perilla para determinar la intensidad efectiva que puede generar una respuesta sin producir artefactos fotoeléctricos. Si es necesario, reposicionar la fibra óptica para eliminar artefactos19.
      NOTA: El controlador LED utilizado para el protocolo actual produce una potencia de luz de ~ 21.8 mW.

5. Grabación neuronal

  1. Use una sonda neural aguda con un vástago de 15 a 50 μm de espesor, que mida al menos 5 mm de longitud.
    NOTA: La grabación de estructuras cerebrales profundas requerirá sondas neuronales con un vástago más largo. En el estudio actual, se utilizó una sonda con una longitud de vástago de 20 mm.
  2. Conecte el escenario del cabezal del preamplificador al controlador de grabación mediante un cable de interfaz periférica serie (SPI). Compruebe la iluminación de color de los LED en los puertos del controlador de grabación. Los LED verdes y amarillos indican el voltaje adecuado en la placa del amplificador conectado. El LED rojo indica un control de etapa de cabeza de software en funcionamiento(Figura 5b).
  3. Usando un micro-manipulador, coloque los sitios de contacto del electrodo en la capa de celda piramidal del CA1 (AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 a 1.2mm).
    NOTA: La fibra óptica y el electrodo se pueden colocar en otras regiones del cerebro deseadas para la fotoestimulación y la grabación.

6. Configuración del amplificador y del filtro

  1. Conecte el sistema amplificador del controlador de grabación a un ordenador a través de un puerto USB 3.0. Conecte el escenario principal al amplificador mediante el cable SPI. Inicie el software del controlador. Si no se conecta correctamente, el sistema mostrará un mensaje de "dispositivo no encontrado".
  2. Haga clic en Ejecutar para ver la actividad en los canales. Cada forma de onda se traza como el voltaje (eje y) frente al tiempo (eje x). Dependiendo de la región de interés, ajuste las escalas de voltaje y tiempo para ajustar la visualización de la forma de onda.
  3. Si solo unos pocos canales están activos, deshabilite los canales no utilizados para reducir el tamaño del archivo en el disco de almacenamiento.
  4. Establezca la frecuencia de muestreo y las frecuencias de corte editando los parámetros de ancho de banda en el software de adquisición. Para la grabación de una sola unidad, establezca las frecuencias de corte superior e inferior en 300 Hz y 5.000 Hz respectivamente. Cambie la frecuencia de muestreo del amplificador a 30 kS/s.
    NOTA: La elección de una frecuencia de muestreo alta producirá un tamaño de archivo más grande.
  5. Antes de grabar, compruebe la integridad de los canales de electrodos midiendo la impedancia a 1.000 Hz. Esto se puede hacer iniciando la función en la interfaz de usuario (software del controlador). Un canal de trabajo debe tener un valor de impedancia que oscile entre 0,1 y 5 MΩ.
  6. Si una salida de audio (altavoz) está conectada al puerto ANALOG OUT, ajuste la ganancia y el silenciador para obtener un sonido de pico óptimo.
  7. Para mostrar el marcador de tren de pulsos TTL en la grabación de picos, habilite la visualización para el marcador DIGITAL IN. Para grabar la marca de tiempo del tren de pulsos, habilite la visualización del canal DIGITAL IN antes del experimento principal.
    NOTA: Por lo general, hay más de un canal "DIGITAL IN" (1 o 2). Asegúrese de que el cable BNC del pulsador TTL esté conectado al puerto "DIGITAL IN" que está seleccionado para su visualización en el software del controlador de grabación.
  8. Para ver en tiempo real la forma de onda del pico, abra la ventana del alcance del pico y establezca el umbral con el clic del mouse.
  9. Inspeccione el nivel de ruido monitoreando el cuadrado medio de la raíz (RMS en μV). Para una grabación de picos limpia, se prefiere que el umbral de picos neuronales sea de al menos 5x RMS.
  10. Una vez completada la configuración, seleccione el formato de salida del archivo.
    NOTA: Aquí, el pico neuronal CA1 se registró en formato .rhd. También se pueden seleccionar otros formatos de archivo (.rhs y .dat) para que coincidan con los formatos de archivo permitidos por el software de análisis.

7. Grabación y ajustes optogenéticos in vivo

  1. Abra el software de control de pulsos (TTL) que muestra varios parámetros de pulso ajustables. Seleccione el puerto COM apropiado en el software. Establezca los parámetros de pulso ajustando la configuración de Tren y Grupo.
    NOTA: La condición del pulso debe determinarse considerando las variables experimentales y el diseño.
  2. En el software del controlador del amplificador, haga clic en Ejecutar para detectar picos neuronales en el hipocampo o en el área cerebral deseada. Si es necesario, ajuste la profundidad del electrodo para detectar neuronas viables y activas.
  3. Una vez que se detecta la actividad de voltaje extracelular, observe los picos de referencia durante 15 minutos y monitoree los signos vitales del animal. Además, pruebe el pulso de luz para detectar neuronas sensibles dentro de la región objetivo anatómica CA1 o deseada.
    NOTA: Compruebe si hay artefactos fotoeléctricos y elimíne ajustando la intensidad de la luz o la posición de la fibra óptica.
  4. Registre la actividad basal durante ~ 10 minutos antes de activar el pulso de luz a la frecuencia deseada (Figura 5a, b). Esto permitirá comparar las velocidades de disparo o ráfaga con y sin iluminación.
    NOTA: En el estudio actual, la actividad basal se registró durante 10 minutos sin iluminación, seguida de la iluminación a 50 Hz(Película 1).

8. Análisis

  1. Convierta el archivo .rhd en formato de salidaNex 5.
  2. Nombre de archivo del proceso. Archivo Nex5 en un software de clasificación fuera de línea para detectar trenes ráster de una sola unidad y formas de onda(Figura 5a-b).
    1. Seleccione el canal deseado en la ventana desplegable.
      NOTA: Los datos de picos grabados continuamente se pueden ver en una ventana separada de la OFSS. La escala de tiempo también se puede ajustar. Si se utiliza un tetrodo, el OFSS se puede configurar para ordenar los 4 canales como un tetrodo.
    2. Establezca el nivel de voltaje para la extracción de la forma de onda de cruce de umbral.
      PRECAUCIÓN: Use un mínimo de 5x RMS para la detección adecuada de picos.
    3. Detecte formas de onda, luego realice la clasificación de picos utilizando el método de búsqueda de valles (automático) o K-means (semiautomático). Cuando sea necesario, combine unidades que ocupen regiones similares del espacio 3D-Análisis de componentes principales (PCA).
    4. Exportar ordenado . Archivos Nex5 para su posterior análisis (Figura 5c–d).
      NOTA: Los resultados del análisis para el intervalo entre disparos, la velocidad de disparo y la velocidad de ráfaga se pueden exportar a otras plataformas de análisis.

9. Detección de fluorescencia de la expresión de AAV

  1. Después de la grabación, eutanasia al animal en una cámara isoflurano.
  2. Realizar perfusión transcárdica con PBS de 10 mM (~10 mL), seguido de paraformaldehído tamponado con fosfato al 4% (PB-PFA, ~10 mL).
  3. Retire todo el cerebro intacto y fójelo en PB-PFA al 4% durante 48 h.
  4. Transfiera el cerebro fijo a PB-PFA al 4% que contiene 30% de sacarosa para la criopreservación a 4 °C. Después de 72 h, seccione el cerebro en un criostato y monte rodajas en un portaobjetos recubierto de gelatina.
    NOTA: En el protocolo actual, se seleccionaron secciones que contienen la parte cerrada del hipocampo (rostral) para demostrar terminales etiquetados con AAV en el DG, CA3 y CA1.

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Resultados

Rastreo anterógrado

La expresión de AAV se verificó mediante imágenes de inmunofluorescencia de la proteína reportera (eYFP) en el VTA de ratones C57BL/6 21 días después de la inyección(Figura 2). El etiquetado anterógrado exitoso de las proyecciones presinápticas de glutamato VTA en el hipocampo también se verificó mediante la detección de eYFP en las capas de DG, CA3 y CA1 (Figura 6a-d; Películas 2 y 3).

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Discusión

En la última década, el diseño de las construcciones AAV ha avanzado significativamente. Como tal, se han incorporado más promotores específicos de neuronas en una serie de serotipos AAV para mejorar la especificidad de la transfección14. Al combinar genes para proteínas de fluorescencia, transportadores, receptores y canales iónicos, ahora existen bibliotecas de AAV para imágenes, neuromodulación y detección de actividad sináptica. En construcciones AAV disponibles comercialmente, una combinación...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo está financiado por CBS Bridging Grant otorgado a OOM. OOM, PAA y AS diseñaron el estudio y realizaron los experimentos. AS y PAA analizaron los resultados. OOM y PAA prepararon el manuscrito. Agradecemos al Dr. Karl Disseroth (Universidad de Stanford) por hacer que el AAV esté disponible para nuestro uso.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Peróxido de hidrógeno al 3% FisherquímicoH312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYPPlásmido de Addgene #26969
Cable
BNC Amazon BNC SplitterAmazon
Ceramic Split Taguito de acoplamiento para Ø Casquillos de 1,25 mm.ThorlabsADAL1-5
TaladroDremelLR 39098
Portaobjetos recubiertos de gelatinaFisher scientificOBSLD01CS
Jeringa de Hamilton (Neuros)WPI Inc.06H
Adaptador de platinade cabeza NeuronexusAdpt-Q4-OM32
Sonda de silicio de alta impedanciaNeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
Controlador de grabación INTAN 512ch SoluciónINTAN RHD2000
Dynarex1425
IsofluranoPiramalNDC 66794-017-25
Espectro de ketaminaK1068
Controlador LEDThorlabsLEDD1B
Fuente de luz LED (470 nm)-luz azulThorlabsM470F3
MicromanipuladorNarishigeM0-203
Fibra ópticaThorlabsCFMLC14L05
Tornillo philips de cabeza plana (M0.6 X 2 mm)AmazonM0.6 X 2 mm
Cabezal de preamplificador (32 canales)INTANC3314
Marco estereotáxicoKopf1530
TTL PulsadorPrizmatix4031
UretanoSigmaU2500
XilacinaAlfa AesarJ61430
SoftwareCompany Version
Graphpad PrismaSoftware GraphPadversión 8
Intan Recording ControllerIntantechversión 2.07
NeuroexplorerNex Technologiesversión 5.215
Plexon Offline Spike SorterPlexon Incversión 4.5
ACSF Composición: ACSF fuertemente oxigenado con 95% > oxígeno/5%CO2 que se burbujea constantemente a través de
la ACSF (ACSF; en mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 y 25 de glucosa).
de yodo

Referencias

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