Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

Resumen

Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.

Resumen

El protocolo desarrollado aquí ofrece una herramienta para permitir el seguimiento por computadora de la división Escherichia coli y los niveles fluorescentes durante varias horas. El proceso comienza por la detección de colonias que sobreviven en medios mínimos, suponiendo que sólo Escherichia coli que alberga el plásmido correcto será capaz de prosperar en las condiciones específicas. Dado que el proceso de construcción de grandes circuitos genéticos, que requieren el montaje de muchas partes del ADN, es un desafío, los componentes del circuito a menudo se distribuyen entre plásmidos múltiples en diferentes números de copia que requieren el uso de varios antibióticos. Las mutaciones en el plásmido pueden destruir la transcripción de los genes de resistencia a los antibióticos e interpelar con el manejo de los recursos en la célula que conduce a la necrosis. La colonia seleccionada está situada en una placa Petri con fondo de cristal y algunos planos de enfoque se seleccionan para el seguimiento de microscopía tanto en campos brillantes como en dominios fluorescentes. El protocolo mantiene el enfoque de imagen durante más de 12 horas en condiciones iniciales que no se pueden regular, creando algunas dificultades. Por ejemplo, las células muertas comienzan a acumularse en el campo de enfoque de las lentes después de unas horas de imágenes, lo que hace que las toxinas se acumulen y la señal se desenfoque y decaiga. El agotamiento de nutrientes introduce nuevos procesos metabólicos y dificulta la respuesta deseada del circuito. La temperatura del experimento reduce la efectividad de los inductores y los antibióticos, lo que puede dañar aún más la fiabilidad de la señal. El gel de medios mínimo se encoge y se seca, y como resultado el enfoque óptico cambia con el tiempo. Desarrollamos este método para superar estos desafíos en Escherichia coli,similar a trabajos anteriores que desarrollan métodos análogos para otros microorganismos. Además, este método ofrece un algoritmo para cuantificar el ruido estocástico total en celdas sin modificar y alteradas, encontrando que los resultados son consistentes con las predicciones del analizador de flujo como se muestra en un coeficiente similar de variación (CV).

Introducción

La biología sintética es un campo multidisciplinar que ha surgido en la última década y tiene como objetivo traducir los principios de diseño de ingeniería en diseño biológico racional^1,2,3,en un esfuerzo por lograr la integración y procesamiento multi-señal en células vivas para entender la ciencia básica^4,5,aplicaciones diagnósticas, terapéuticas y biotecnológicas^6,7,8,9,

Protocolo

1. Preparación de los medios de comunicación y la cultura

1. Preparar solución de stock de 1.000x carbenicilina (50 mg/ml) o antibiótico relevante.
   1. . Pesar 0,5 g de carbenicilina. Añadir 10 ml de estéril H₂O. Disolver por completo.
   2. Esterilizar el stock de carbenicilina a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Aliquot la solución antibiótica y almacenar a -20 °C.
2. Para preparar placas de caldo de lisógena (LB), mezcle 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extracto de levadura y 7,5 g de agar Bacto con 0,5 L de estéril H₂O. Autoclave la solución a 121 °C durante 20 minutos.
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Resultados

El software analiza imágenes de dominio de campo brillante que son fuera de blanco y negro. La Escherichia coli se verá como formas oblongas negras sobre un fondo blanquecino y el rango dinámico de luminancia debe mostrar un pico en su centro(Figura 1). En las imágenes fluorescentes las células pueden tener un halo pequeño, pero las células individuales con formas oblongas todavía se pueden resolver. Primero se debe detectar un evento de mitosis después de 30 minutos. El enfoque del.......

Discusión

En este trabajo, desarrollamos un protocolo que permite el rastreo por ordenador de células vivas de Escherichia coli, siguiendo niveles de división y fluorescentes durante un período de horas. Este protocolo nos permite cuantificar la dinámica estocástica de los circuitos genéticos en Escherichia coli midiendo el CV y el SNR en tiempo real. En este protocolo, comparamos los comportamientos estocásticos de dos circuitos diferentes como se muestra en la Figura 10. Se ha demostrado que lo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plato de vidrio de 35 mm	mate	P35G-0.170-14-C	de espesor correspondiente a la lente del microscopio.
Agarosa	Lonza	5004	LB preparación
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inductor
Bacto triptona	BD - Becton, Dickinson y Compañía	211705	LB preparación
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiótico
Carb	Formedium	CAR0025	antibiótico
Ácidos Casamino	BD - Becton, Dickinson y Compañía	223050	solución de medios mínimos
eclipse Ti	microscopio invertido	nikon
Glucosa	Sigma-Aldrich	G5767	solución de medios mínimos
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	sustrato de medios mínimos
Immersol 518F	zeiss	44496000000000	aceite de inmersión
M9 solución salina	Sigma-Aldrich	M6030	solución de medios mínimos
NaCl	Bio-Lab	214010	LB
preparación Agar noble	Sigma-Aldrich	A5431	sustrato de medios mínimos
cinta de parafilm	Bemis	PM-996	referida como cinta en el texto
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	sustrato de medios mínimos
taymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	Solución de medios mínimos
Extracto de levadura	BD - Becton, Dickinson and Company	212750	LB Preparación