Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.
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Artículo de método
Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso
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Resumen
Resumen
Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos producen lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas. Estas lesiones comprometen la estructura ósea, aumentan el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que con muchos tumores sólidos, las células cancerosas que se han diseminado al hueso pueden ser la fuente principal de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. La mayoría de los modelos de ratón singénico o xenoinjerto de tumores óseos primarios implican la inyección intraósea (ortotópica) de suspensiones de células tumorales. Algunos modelos animales de metástasis esqueléticas de tumores sólidos también dependen de la inyección ósea directa, mientras que otros intentan recapitular pasos adicionales de la cascada metastásica ósea inyectando células por vía intravascular o en el órgano del tumor primario. Sin embargo, ninguno de estos modelos desarrolla metástasis óseas de forma fiable o con una incidencia del 100%. Además, se ha demostrado que la inyección intraósea directa de células tumorales está asociada con una posible embolización tumoral del pulmón. Estas células tumorales embólicas se injertan pero no recapitulan la cascada metastásica. Se informó un modelo de ratón de osteosarcoma en el que se implantan fragmentos tumorales frescos o criopreservados (que consisten en células tumorales más estroma) directamente en la tibia proximal mediante una técnica quirúrgica mínimamente invasiva. Estos animales desarrollaron injertos reproducibles, crecimiento y, con el tiempo, osteólisis y metástasis pulmonares. Esta técnica tiene la versatilidad de ser utilizada para modelar metástasis óseas tumorales sólidas y puede emplear fácilmente injertos que consisten en uno o múltiples tipos de células, células genéticamente modificadas, xenoinjertos derivados de pacientes y / o células marcadas que pueden rastrearse mediante imágenes ópticas o avanzadas. Aquí, demostramos esta técnica, modelando tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso.
Introducción
Los modelos de ratón de enfermedades humanas y animales son cada vez más populares en la investigación biomédica. La utilidad de usar ratones en este contexto es que su anatomía y fisiología son muy similares a las de los humanos. Tienen un período de gestación relativamente corto y un tiempo en la vida postnatal para alcanzar la madurez, y se asocian en gran medida con un costo relativamente bajo y facilidad de vivienda, aunque los crecientes costos de desarrollo o compra se asocian con mayores grados de modificación genética, inmunodeficiencia y / o humanización1. El uso de cepas endogámicas da como resultado una población animal en gran medi....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido.
1. Preparación de líneas celulares
- Cultivar líneas celulares de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular del laboratorio para el cultivo celular tradicional o la inyección en ratones. Los protocolos estándar utilizados aquí son el crecimiento en el medio de Eagle modificado de Dulbecco que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina / estreptomicina (en lo sucesivo conocido como medio de crecimiento completo).
NOTA: En....
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Resultados
Un resultado positivo se asociaría con el injerto tumoral y el crecimiento tumoral progresivo a lo largo del tiempo. Dependiendo del tipo de tumor, el crecimiento tumoral intraóseo puede estar asociado con cojera progresiva de las extremidades posteriores, pero muchos tumores no causan cojera a pesar de los signos de enfermedad ósea concomitante. El injerto exitoso se documentó con imágenes avanzadas, por lo que habría cambios radiográficos, μCT o μMRI progresivos en la tibia proximal asociados con el fenotipo óseo de la.......
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Discusión
Este informe documenta nuestro modelo para crear tumores óseos primarios o metástasis óseas después de la implantación intratibial de un aloinjerto tumoral. Creemos que hay varios pasos críticos en este proceso. Se debe establecer un plano anestésico seguro tanto para la inyección subcutánea de la suspensión de células tumorales como para la colocación intratibial de los fragmentos tumorales resultantes. Debe haber una preparación estéril del sitio quirúrgico tanto para la extracción del aloinjerto subcutáneo como para l.......
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Divulgaciones
El Dr. Hildreth fue financiado por el NIH bajo el número de premio K01OD026527. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.
Agradecimientos
Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP al desarrollo de esta técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hoja de bisturí #15 | Henry Schein Ltd. | 75614 | Ninguna |
| Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Se utilizan para picar trozos de tumores. También se puede utilizar para el cultivo celular |
| de la línea celular de osteosarcoma de Abrams | No aplicable | No aplicable | Ninguno Máquina |
| anestesia con vaporizador de isoflurano y tanque(s) de oxígenoVetEquip | 901805 | Ninguno | |
| Báscula de pesaje de animales | Kent Scientific | SCL- 1015 | Ninguno |
| BALB/c ratón desnudo (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 semanas de edad. Ratones machos o hembras |
| Cemento óseo | Depuy Synthes | 160504 | Uso opcional en lugar de cera ósea |
| Cera | Ethicon | W31G | Opcional |
| Buprenorfina | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0,3 mg/ml Solución inyectable para perros y gatos |
| Estación de eutanasia de dióxido de carbono | N/A | N/A | Debe proporcionarse dentro de las instalaciones para animales |
| Incubadora de cultivo celular configurada a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono | Heraeus | Varios | Ninguno |
| Exfoliante quirúrgico de clorhexidina | Vetoquinol | 411412 | Ninguno |
| Crioviales (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Opcional si se criopreservan fragmentos tumorales |
| D-luciferina (Luciferina (Luciérnaga), sal de potasio | Perkin Elmer | 122799 | Opcional si la línea celular de interés tiene un gen reportero bioluminiscente |
| Calibrador digital | Mitutoyo | 500-181-30 | Puede ser manual |
| Cabina de microrradiografía digital | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Opcional para evaluar la respuesta ósea al crecimiento tumoral |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 Opcional si se crioconservan fragmentos tumorales | |
| Dulbecco' Águila modificada' s medio | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Ninguno Etanol |
| (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | Ninguno |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Ninguno |
| Pinzas, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | Ninguno |
| Congelador (– 80 ° C) | Sanyo | MDF-794C | Opcional si se crían fragmentos de tumores con criopreservación o congelación instantánea |
| Hemocitómetro | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | También puede usar un contador de células automatizado, si está disponible |
| Agujas hipodérmicas (calibre 27) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | También puede usar agujas de 25G (DIS55509) y 30G (Catálogo DIS599) |
| Ice | N/A | N/A | Idealmente piezas pequeñas en un recipiente para el almacenamiento de jeringas y suspensión de células |
| Tijeras Iris | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | Ninguna |
| Isoflurano | Henry Schein Ltd. | 1182098 | Ninguno Sistema |
| imagen de bioluminiscencia/fluorescencia IVIS Lumina III | Perkin Elmer | CLS136334 | Opcional si la línea celular de interés tiene genes reporteros bioluminiscentes o fluorescentes |
| L-glutamina | Thermofisher Scientifc | 25030081 | Ninguno |
| Nitrógeno líquido | British Oxygen Corporation | NA | Opcional si se criopreservan o congelan fragmentos tumorales |
| Nitrógeno líquido dewar, 5 litros | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Opcional si se croconservan fragmentos tumorales |
| Matrigel® Matrix GFR, sin LDEV, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Opcional. También disponible en tamaño de 10 ml (354230) |
| Microcentrífuga | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Celdas de pellets a 1200 rpm durante 5-6 minutos |
| Mr. Frosty contenedora de congelación | Fisher Scientific | 10110051 | Opcional si se criopreservan fragmentos tumorales |
| NAIR Loción/aceite removedor de vello | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | También se puede utilizar una cortadora eléctrica con cuchilla fina |
| Penicilina/estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | Ninguno |
| Mango de bisturí, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | Preferencia del usuario siempre que acepte la hoja de bisturí #15 Almohadilla térmica para |
| animales pequeños | VetTech | HE006 | Ninguno |
| Microscopio estereoscópico | GT Vision Ltd. | H600BV1 | Ninguna |
| Solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific 10010023 | Uso para inyecciones y también como parte del exfoliante quirúrgico, alternando con clorhexidina | |
| Adhesivo tisular (estéril) | 3M Corporation | 84-1469SB | Alternativamente se puede utilizar sutura cutánea no absorbible (tamaño 6-0) |
| Azul tripano | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | Ninguno |
| Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Jeringa de 0,05%-0,25% |
| Tuberculina (1 ml con gradaciones de 0,1 ml) | Becton Dickinson | 309659 | Se prefiere la punta deslizante a los |
| matraces de cultivo de tejidos Luer Vented, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | También puede usar matraces más pequeños o más grandes, según sea necesario |
Referencias
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6
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Reimpresiones y permisos
