Establecimiento y Mantenimiento de Cucarachas Americanas Gnotobiotic (Periplaneta americana)

Los animales gnotobióticos han demostrado ser herramientas invaluables para los estudios de microbiomas^1,2,3. Los animales libres de gérmenes y de flora definida han permitido la elucidación de las interacciones huésped-microbio, incluidas las respuestas inmunológicas del huésped, la maduración epitelial intestinal y el metabolismo del huésped^1,4,5,6,7. Los animales gnotobióticos inoculados con una comunidad simplificada también han ayudado a una comprensión más completa de las interacciones microbio-microbio en una comunidad intestinal, específicamente en el desentrañamiento de la alimentación cruzada y las relaciones antagónicas^8,9,10,11. El sistema modelo preferido actual para los estudios en el microbioma intestinal de los mamíferos es el modelo murino. Si bien este sistema ha sido vital en los descubrimientos descritos anteriormente, una deficiencia clave es el costo involucrado. El equipo especializado y los técnicos altamente entrenados son necesarios establecer y mantener una facilidad gnotobiotic. Esto, en combinación con el cuidado adicional que se debe dar a cada aspecto del mantenimiento animal gnotobiotic, hace que el animal gnotobiotic cueste diez a veinte veces más para criar que un modelo animal estándar^12. Debido a los altos costos, muchos investigadores pueden ser incapaces de pagar un modelo murino gnotobiótico. Además, si bien los modelos murinos pueden ser la opción más ampliamente aceptada para los estudios que buscan traducirse a la salud humana, todavía hay muchas diferencias fisiológicas y morfológicas entre las tripas humanas y de ratón¹³. Claramente, ningún modelo singular es suficiente para responder al número cada vez mayor de preguntas sobre los muchos aspectos del microbioma intestinal.

Los modelos de insectos son una alternativa más barata debido a su menor costo de mantenimiento en comparación con las especies de mamíferos. La extensa investigación libre de gérmenes y gnotobióticos en una variedad de especies de insectos ha llevado al desarrollo de múltiples modelos de uso común. Los mosquitos y Drosophila son modelos comunes para el trabajo libre de gérmenes debido a su relevancia para las enfermedades globales y la tratabilidad genética^14,15. Otro sistema modelo emergente es el de la abeja melífera (Apis mellifera), dada su importancia en la polinización y la investigación de la socialidad¹⁶. Sin embargo, muchos de estos insectos de uso común carecen de la complejidad taxonómica observada en las comunidades intestinales de mamíferos^17,lo que limita su capacidad para modelar interacciones de orden superior. No sólo la diversidad total de microbios que se encuentran en el intestino de las cucarachas americanas es más similar a la de los mamíferos, sino que muchos de los microbios presentes en el intestino de las cucarachas pertenecen a familias y filos que se encuentran comúnmente en la microbiota intestinal de mamíferos y humanos¹⁸. El intestino posterior de la cucaracha también es funcionalmente análogo al intestino grueso de los mamíferos, ya que es una cámara de fermentación densamente llena de bacterias para ayudar en la extracción de nutrientes^19,20. Finalmente, la naturaleza omnívora de las cucarachas permite una diversidad de regímenes de dieta que no serían posibles con los especialistas en dieta.

Las cucarachas americanas pueden ser un sistema modelo útil para comprender las comunidades microbianas intestinales en organismos superiores, pero el estado de la cucaracha como plaga también hace que este sistema sea relevante para el control de plagas²¹. Aprovechar el conocimiento fundamental de la influencia de la comunidad intestinal en la salud y la fisiología de las cucarachas ayuda a desarrollar nuevas técnicas para el manejo de plagas.

El objetivo de este método es esbozar una descripción completa del establecimiento y mantenimiento de cucarachas americanas gnotobióticas (Periplaneta americana), pero este protocolo podría ser utilizado para generar ninfas de cualquier cucaracha ovípara. Incluye un método para la recolección eficiente y no invasiva de ootecas maduras, y una técnica no destructiva para monitorear el estado gnotobiótico de los insectos^22,23,24. Mientras que los métodos anteriores de lograr y mantener cucarachas gnotobióticas describen la colección de ootheca^{23,24,25,26,27,}la madurez de la ooteca se interpreta en términos de señales específicas de la especie (en Blattella germanica^{22, 24,25),}o no se describe^{explícitamente 27, 28,}lo que dificulta la implementación para aquellos que no están familiarizados con el sistema. Dado que el método descrito aquí utiliza ootecas caídas naturalmente, el error de eliminar los huevos prematuramente está ausente. Este protocolo contiene métodos de control de calidad tanto dependientes del cultivo como independientes del cultivo, y el método dependiente del cultivo no requiere sacrificar insectos. Finalmente, este método reúne información de múltiples estudios de cucarachas gnotobióticas para crear un protocolo integral con toda la información necesaria para lograr y mantener cucarachas gnotobióticas.

1. Preparación de materiales

1. Mantenimiento de cultivos de cucarachas
   NOTA: Hay muchas maneras de criar a estos insectos robustos. Los detalles sobre el suministro de refugio y agua pueden ser diferentes dependiendo de los materiales accesibles (es decir, cartones de huevos en lugar de tubos de cartón). El siguiente protocolo de esterilización funcionará para cualquier configuración de tanque de stock.
   1. Extienda suficiente ropa de cama de astilla de madera en una pecera de 37.85 L (10 galones) para cubrir el fondo del tanque con aproximadamente 1 pulgada de ropa de cama. Preparar la carcasa cortando cartón (plano) a 2 en x 4 en piezas. Inserte piezas de cartón en tubos de cartón (por ejemplo, tubos de papel higiénico) y apile tubos en un extremo del tanque(Figura 1).
   2. Unte una capa delgada de vaselina en las dos pulgadas superiores del interior del tanque para evitar el escape de insectos.
      NOTA: Asegúrese de recubrir correctamente el interior de las esquinas del tanque.
   3. Agregue cucarachas transfiriendo tubos de cartón (ocupados) de un tanque de stock anterior, sacudiéndolos para liberar a sus habitantes. Para cada transferencia, mueva 100-200 cucarachas de edades mixtas y sexos mixtos. Agregue comida para perros (20-30 piezas), controle la cantidad de comida para perros en el tanque y vuelva a llenar cuando esté baja.
   4. Montar un plato de agua.
      1. Llene un pequeño recipiente de plástico reutilizable con agua de doble destilación (ddH₂O). Corte las esponjas de celulosa y los agujeros en la tapa del recipiente de alimentos aproximadamente del mismo tamaño.
         NOTA: Las esponjas de celulosa evitan que las cucarachas se ahoguen en el plato de agua.
   5. Inserte las esponjas en los agujeros de la tapa y coloque la tapa en el recipiente lleno. Coloque el contenedor en el tanque y vuelva a llenarlo cuando esté bajo. Cubra el tanque con un paño de algodón y colóquelo en su lugar con una banda elástica.
   6. A medida que los tanques comienzan a acumular cantidades excesivas de cadáveres de frass e insectos, configure nuevos tanques y transfiera cucarachas.
      NOTA: Los tanques normalmente se transfieren cada 6 meses. Todas las cucarachas/huevos restantes en tanques de stock desmantelados son eutanasiados por congelación a -20 °C durante 1 h y el contenido del tanque de stock se transfiere a una bolsa de autoclave y se autoclava (1 h, ciclo de gravedad) antes de su eliminación. Los tanques de stock se esterilizan con un 2% de lejía entre usos.
2. Desinfectar un recipiente secundario.
   NOTA: Este contenedor no incluye un filtro, sino que permite el intercambio de aire libre.
   1. Rocíe el interior de la tapa y la parte inferior con 2% de lejía y déjelos remojar durante 10 minutos. Limpie la lejía con una toalla de papel limpia.
   2. Rocíe el interior de la tapa y la parte inferior con etanol al 70% y seque con una toalla de papel limpia. Substituya la tapa hasta su uso.
3. Haga slants y frascos de BHI para incubar huevos y alojar ninfas.
   1. Prepare BHI de acuerdo con las instrucciones del paquete, agregando un 2% de agar. Hervir la solución de agar BHI hasta que se aclare.
   2. Para los slants, transfiera 5 mL de alícuotas a 18 mm x 150 mm tubos de ensayo de vidrio y tapa. Esterilizar a través de autoclave (tiempo de esterilización = 20 min, ciclo líquido). Coloque los tubos en autoclave en un ángulo de 45 ° para enfriar en slants. Una vez solidificado, refrigerar hasta su uso para evitar el secado.
   3. En el el del matraz, transferir 10 ml de alícuotas de solución de agar BHI hervida en matraces Erlenmeyer de 250 ml para cubrir completamente el fondo del matraz. Cubra el matraz con papel de aluminio y esterilice mediante autoclave (20 min, ciclo líquido). Deje que los frascos en autoclave se enfríen y refrigere hasta su uso para evitar que se sequen.
      NOTA: No se requiere filtro de aire para esta configuración. La cubierta de papel de aluminio es suficiente para permitir el intercambio de gases al tiempo que evita la contaminación del flujo al aire libre.
4. Esterilizar a través de autoclave: chow de rata autoclavable roto en tamaños medios (~ 1/2 pulgada piezas) en un beaker cubierto de papel de aluminio (tiempo de esterilización = 1 h, ciclo de gravedad), ddH₂O en una botella tapada (tiempo de esterilización = 20 min, ciclo líquido), y fórceps en un casto cubierto de papel de aluminio (tiempo de esterilización = 20 min, ciclo de gravedad).
   NOTA: No llene en exceso el casto chow rata. Los pellets se hincharán en el autoclave.
5. Establecer un tanque de "sala de maternidad".
   NOTA: Este tanque contiene los mismos materiales que los tanques de almacenamiento (tubos de cartón, platos de agua con esponjas, comida para perros, ropa de cama de astillas de madera; ver Figura 1)y debe estar vacío de cucarachas a menos que se transfiera para la recolección de ootecas (ver sección 2).
6. Humidifique una incubadora preparando un castor lleno de solución de cloruro de sodio sobresaturado (NaCl). Preparar esta solución añadiendo 37 g de NaCl por 100 mL de ddH₂O y removiendo hasta que se disuelva.
   NOTA: Típicamente, 500 mL de solución de sal saturada típicamente humidifica una incubadora con dimensiones de cámara de 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x W x D) durante aproximadamente un mes antes de que se deba agregar más agua.

2. Colección de ootecas

1. Transferir hembras (en cualquier número según corresponda para experimentos planificados) que llevan ootecas (Figura 2) desde el tanque de stock a la "sala de maternidad" mediante el uso de fórceps para mover tubos de cartón que contienen hembras grávidas.
   1. Si un tubo de cartón contiene varios insectos además de la hembra grávida, primero agite el tubo en un recipiente de plástico adicional anillado con vaselina, y luego anime al insecto objetivo a volver al tubo de cartón solo.
2. Transferir hembras de nuevo al tanque de stock una vez que han dejado caer sus oothecae. Recupere las ootecas de la camada en el tanque con las fuerzas.
   NOTA: Las ootecas a menudo se dejan caer dentro de las 24 h de la hembra que se transfiere.

3. Limpieza de oothecae

1. Agregue las ootecas a un tubo de centrífuga de 5 mL que contenga 3 mL de sulfato de dodecil sódico (SDS). Vórtice para 10 s. Repita para un segundo paso de lavado con un tubo de centrífuga que contenga SDS fresca.
   NOTA: Se pueden utilizar hasta cinco ootecas por cada 3 mL de SDS.
2. Usando una delicada toallita de tareas, frote suavemente la superficie de cada ooteca para eliminar cualquier residuo. Se pueden agregar más SDS para ayudar en la limpieza a fondo. Coloque las ootecas limpiadas en un bote de pesaje hasta que esté listo para la esterilización.
   NOTA: El protocolo puede pausarse aquí, pero dejar las ootecas en ambientes de baja humedad durante largos períodos de tiempo (días a semanas) hará que se deshidraten y pierdan viabilidad.

4. Esterilización e incubación de ootecas

1. Agua estéril alícuota para enjuague post-esterilización. Por cada ooteca que se esterilice, llene dos tubos centrífugos de 1,5 mL con 1 mL de agua estéril.
2. Añadir 10 μL de concentrado (32%) solución de culata de ácido peracético a 3,2 mL de ddH₂O en un tubo centrífugo de 5 mL para crear una solución al 0,1% para la esterilización. Tapar e invertir varias veces para mezclar.
   PRECAUCIÓN: El ácido peracético es dañino en contacto con la piel o los pulmones. Diluir en una campana extractora de humos.
   NOTA: Esto debe hacerse el mismo día que la esterilización. Si se diluye de antemano, la solución se descompone rápidamente y, por lo tanto, no se esteriliza correctamente. Hasta cinco ootecas limpiadas pueden esterilizarse en 3,2 mL de ácido diluido.
3. Coloque (hasta cinco) las ootecas limpiadas en la solución de ácido peracético al 0,1% durante 5 min. Invierta el tubo varias veces cada 60 s.
4. En una campana de flujo laminar, utilice pinzas estériles para transferir cada prótesis a su propio tubo de centrífuga con agua de enjuague estéril alícuota (paso 4.1). Invertir varias veces para mezclar. Repita para un segundo enjuague, luego transfiera cada prótesis enjuagada a su propia inclinación BHI usando pinzas estériles.
5. Coloque los slants en el recipiente secundario esterilizado. Mueva el recipiente a la incubadora humidificada a 30 °C durante 4−5 semanas hasta que eclosione.
   NOTA: Los slants pueden mantenerse en posición vertical por un pequeño estante de tubo de ensayo o un beaker mediano/pequeño.
6. Revise los slants regularmente (1−2x por semana). Si aparece un crecimiento de colonias fúngicas o bacterianas en el agar, retire la inclinación contaminada. Cuando se acerque el punto de tiempo de cuatro semanas, compruebe los slants todos los días.
   NOTA: Una vez eclosionadas, las ninfas pueden sobrevivir hasta varias semanas solo con BHI, pero no crecerán de manera óptima.

5. Mantenimiento de ninfas gnotobióticas

1. En una campana de flujo laminar, transferir asépticamente un pellet de chow de rata esterilizado a un matraz de BHI preparado (a partir del paso 1.3.3) con fórceps estériles. Como comprobación de esterilidad, colocar el matraz en el recipiente secundario en una incubadora de 30 °C durante 24 h, y no utilizar si aparece crecimiento.
2. Agregue ninfas al matraz de BHI con pellets de alimentos estériles. Agítelos de su inclinación BHI y déjelos caer en el matraz en una capucha de flujo laminar.
   NOTA: Las ninfas no tienen tracción en las paredes de vidrio del tubo de ensayo. Agitar el tubo para sacarlos de la inclinación y luego inclinar el tubo para permitirles deslizarse por el vidrio en el matraz es efectivo. Mientras que las ninfas se pueden transferir usando fórceps, el riesgo de lesiones fatales es alto.
3. Ariete a las ninfas con 300 μL de agua estéril una vez por semana en una campana de flujo laminar pipeteando directamente sobre el suelo de BHI del matraz.
4. A medida que las heces de ninfa comienzan a cubrir el piso de BHI, transfiera a un nuevo matraz de BHI, agregando el chow de rata esterilizado con 24 h de anticipación (para verificar la esterilidad) como en el paso 5.1.

6. Control de calidad de la esterilidad

1. Retire una ninfa del matraz de BHI para sacrificarla por una comprobación de control de calidad independiente del cultivo del estado gnotobiótico a través del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP). Para hacer esto, vierta la ninfa en un tubo de centrífuga estéril (similar a la transferencia ninfa del paso 5.1) o coloque un aplicador de madera estéril en el matraz y espere a que una ninfa comience a subirlo, luego transfiríbalo al tubo de la centrífuga.
2. Agregue 0.5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la ninfa en el tubo de la centrífuga y homogeneice con un micropestle estéril hasta que todas las piezas grandes se rompan. Vórtice bien.
3. Extraiga el ADN del homogenado de ninfa utilizando un kit de extracción de ADN bacteriano(Tabla de Materiales) dela siguiente manera.
   1. Centrifugar la ninfa homogeneizada durante 10 min a 5.000 x g y retirar el sobrenadante. Precaliente una coctelera térmica a 37 °C.
   2. Añadir 100 μL de 1x Tris-EDTA, y vórtice para resuspend completamente el pellet. Añadir 10 μL de lisozima y mezclar, seguido de una incubación de 30 min (sin agitación) en la coctelera térmica precalentada a 37 °C.
   3. Añadir 25 mg de perlas de vidrio a las muestras, y vórtice a la velocidad máxima durante 5 min. Precaliente la coctelera térmica a 55 °C.
   4. Deje que las perlas se asienten antes de transferir el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mL con 100 μL de tampón de proteinasa K y 20 μL de proteinasa K. Vórtice para mezclar a fondo.
   5. Incubar, con agitación a 600 rpm, en un agitador térmico de 55 °C durante 60 min. Centrífuga a 10.000 x g durante 2 min, y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga de 1,5 mL. Precaliente el agitador térmico a 65 °C. Comience a precalentar el tampón de elución en un horno de hibridación de 65 °C.
   6. Añadir 220 μL de etanol al 100%. Vórtice a velocidad máxima para 20 s. Rompa cualquier precipitado visible pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10x.
   7. Inserte una columna de ADN en un tubo de recolección de 2 mL y transfiera la muestra a la columna, incluido cualquier precipitado que se haya formado. Centrífuga a 10.000 x g durante 1 min, deseche el filtrado del tubo de recolección y reemplace el tubo de recolección.
   8. Agregue 500 μL de búfer de unión a la columna y centrífuga a 10.000 x g durante 1 min. Deseche el filtrado del tubo de recolección y reemplácelo.
   9. Agregue 700 μL de tampón de lavado de ADN a la columna y centrífuga a 10,000 x g durante 1 min. Deseche el filtrado del tubo de recolección y reemplácelo. Repita para un segundo paso de lavado.
   10. Centrífuga vaciar la columna durante 2 minutos para secarla, transfiriendo la columna a un nuevo tubo centrífuga de 1,5 mL después. Añadir 50 μL de tampón de elución precalentado directamente a la matriz de la columna de ADN e incubar a 65 °C durante 5 min.
   11. Centrífuga a 10.000 x g durante 1 min a eluir. Cuantificar el ADN extraído en el filtrado mediante espectrofotometría o fluorometría.
4. Amplificar y digerir todo el gen 16S. Visualice fragmentos usando electroforesis en gel.
   1. Utilice 12,5 μL de mezcla maestra 2x, 0,5 μL de cada cebador 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) y 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng de ADN y agua de grado molecular para un volumen total de reacción de 25 μL.
   2. Ejecute el siguiente programa de termociclador: 94 °C durante 60 s; seguido de 35 ciclos de 94 °C para 30 s, 50 °C para 45 s, 68 °C para 90 s; seguido de 68 °C durante 5 min.
   3. Purificar el producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un kit de purificación de ADN(Tabla de Materiales).
      1. Agregue 120 μL de tampón purificante al producto de PCR y vórtice para mezclar. Centrífuga brevemente para recoger gotitas dentro de la tapa. Inserte una columna de ADN en un tubo de recolección de 2 mL, transfiera líquido a la columna preparada y centrífuga a ≥13,000 x g durante 1 min.
      2. Deseche el filtrado y reemplace el tubo de recolección. Añadir 700 μL de tampón de lavado de ADN y centrífuga a ≥13.000 x g durante 1 min. Deseche el filtrado y reemplace el tubo de recolección. Repita para un segundo paso de lavado.
      3. Centrifugar la columna vacía durante 2 minutos para secar y transferir la columna a un nuevo tubo centrífuga de 1,5 mL. Añadir 50 μL de tampón de elución precalentado directamente a la matriz de la columna de ADN, e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
      4. Centrífuga a 10.000 x g durante 1 min a eluir. Cuantificar el ADN extraído en filtrado mediante espectrofotometría o fluorometría.
   4. Añadir 1 μg de producto de PCR purificado a 5 μL de tampón de digestión, 10 unidades RsaI y agua de grado molecular para un volumen total de reacción de 50 μL. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar a 37 °C durante 60 min.
   5. Separe el producto digerido mediante electroforesis en gel ejecutando 20 μL de ADN digerido en un gel de agarosa al 2%. Visualice el gel para confirmar el estado gnotobiótico.
      NOTA: Los insectos gnotobióticos solo deben dar lugar a bandas a 402 pb, 201 pb y un frotis de 163 a 148 pb, basado en la secuencia de ADNr 16S del endosimbionte, Blattabacterium. Cualquier banda adicional vista en el gel es indicativa de especies microbianas contaminantes.

7. Seguimiento aséptico del crecimiento ninfal

1. Registre la longitud del cuerpo para rastrear el crecimiento de la ninfa midiendo los insectos a través del piso translúcido de BHI del matraz.
   NOTA: Las ninfas se pueden colocar a 4 °C durante 15 minutos para ralentizar su movimiento, lo que las hace más fáciles de medir.

Los tanques de almacenamiento se establecen como se muestra en la Figura 1. Las hembras "embarazadas" son identificadas por la ooteca unida al abdomen posterior, como se muestra en la Figura 2. La incubación de ootecas en el agar BHI permite el control de calidad gnotobiótico de una manera no destructiva. En algunos casos, la esterilización no tiene éxito, y el crecimiento aparece alrededor de las ootecas como en la Figura 3B. Estas ootecas deben eliminarse y desecharse. En nuestras manos, se observó una tasa de fracaso promedio del 10% para la esterilización (n = 51). Las ootecas eclosionan un promedio de 34 días después de la esterilización sin crecimiento en el medio, como se ve en la Figura 3A. Hemos observado tasas típicas de eclosión del 41% (n = 46) para las ootecas esterilizadas, no contaminadas, con un promedio de 11 ninfas por ooteca. Las ninfas más grandes se transfieren a frascos de BHI cubiertos de papel de aluminio, como en la Figura 4. La lámina evita la contaminación, y las ninfas tienen espacio para crecer. RFLP del ADNr 16S de una ninfa homogeneizada se utiliza para confirmar la situación gnotobiotic. Se ha observado que las ninfas gnotobióticas crecen a un ritmo más lento que sus contrapartes no estériles, como se representa en la Figura 5. La Figura 6 muestra los resultados de insectos gnotobióticos con éxito, así como ninfas estándar (no esterilistas).

Si bien esta prueba aún no ha identificado la contaminación en ausencia de un resultado positivo de cultivo, este paso se ha llevado a cabo de forma rutinaria durante experimentos críticos para descartar la presencia de microbios sensibles al oxígeno o fastidiosos contaminantes. Se ha observado un crecimiento más lento en las cucarachas gnotobióticas en comparación con los insectos estándar / no esterilistas.

Figura 1: Configuración de la cultura de stock de cucarachas.
Los tubos de cartón se pueden ver apilados en el otro extremo del tanque. Tanto la comida como el agua están cerca de la parte delantera del tanque. La cubierta de tela de algodón y la banda elástica se han eliminado para la visibilidad. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Una cucaracha americana "embarazada".
La flecha indica la ooteca. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3: Imágenes de ninfas gnotobióticas eclosionadas con éxito y esterilizadas sin éxito en las ootecas de BHI.
Oothecae fue esterilizado e incubado según lo descrito en este protocolo. (A) La falta de crecimiento microbiano en la inclinación del IMC indica que los insectos están libres de organismos cultivables. (B) Las ootecas en los slants que dan lugar a la formación de colonias deben desecharse como contaminadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4: Aparato de cría gnotobiótico.
Los insectos se mantienen en frascos estériles cubiertos con una tapa de papel de aluminio para evitar la contaminación. El recipiente secundario (tapa verde) se esteriliza con blanqueador al 2% seguido de etanol al 70%. El flujo de aire no está restringido en el contenedor secundario. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5: Datos representativos de la tasa de crecimiento que comparan las longitudes corporales de las ninfas gnotobióticas y no esterilistas. Ambos grupos de insectos fueron alimentados con dieta de roedores en autoclave. Los insectos gnotobióticos (aquí: n = 105) se mantienen en BHI como se describe. Los insectos no esterilizados (aquí: n = 50) viven en frascos con lecho de astilla de madera en autoclave con pequeños platos para el agua. Las ninfas no esterilistas crecen a una tasa promedio de 0,059 mm/día, mientras que las ninfas gnotobióticas crecen a 0,028 mm/día (p < 0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6: Una imagen de gel representativa de los resultados de RFLP para el control de calidad.
Los amplicons del gene Whole-16S fueron digeridos con RsaI. La DNA para la polimerización en cadena fue extraída de las ninfas homogeneizadas en 1x PBS. Los carriles de "ninfa G" corresponden a ninfas gnotobióticas, mientras que los carriles de "ninfa conv" corresponden a contrapartes convencionales no esterileñas. De acuerdo con el resumen virtual de la restricción, el endosymbiont (Blattabacterium) se espera que tenga vendas en los tamaños 402 bp, 206 bp, y 163 bp, con un borrón de transferencia de las vendas entre 163 bp y 148 bp. Un insecto gnotobiótico debe mostrar sólo el patrón de bandas de Blattabacterium. Se espera que una comunidad bacteriana mixta tenga un frotis de bandas con diferentes tamaños, etiquetados aquí como "otros fragmentos bacterianos 16S". Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.