Un Modelo De Epileptogénesis En La Corteza Rinal-Hipocampo Organotípica Slice Cultivos

Resumen

Aquí, describimos la preparación de las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo. Bajo una privación gradual y controlada del suero, estas rebanadas representan la evolución epiléptica-como acontecimientos y se pueden considerar un modelo ex vivo del epileptogenesis. Este sistema representa una excelente herramienta para monitorear la dinámica de la actividad espontánea, así como para evaluar la progresión de las características neuroinflamatorias a lo largo del curso de la epileptogénesis.

Resumen

Las culturas organotípicas de la rebanada se han utilizado extensamente para modelar desordenes del cerebro y se consideran plataformas excelentes para evaluar el potencial neuroprotective y terapéutico de una droga. Las rebanadas organotípicas se preparan a partir de tejido explantado y representan un complejo entorno ex vivo multicelular. Preservan la citoarquitectura tridimensional y el entorno local de las células cerebrales, mantienen la conectividad neuronal y la interacción recíproca neurona-glía. Las rebanadas organotípicas hippocampal se consideran convenientes explorar los mecanismos básicos del epileptogenesis, pero la investigación clínica y los modelos animales de la epilepsia han sugerido que la corteza rinal, compuesta de cortezas perirhinal y entorhinal, desempeñe un papel relevante en la generación del asimiento.

Aquí, describimos la preparación de las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo. Las grabaciones de la actividad espontánea del área CA3 bajo perfusión con el medio de crecimiento completo, en la temperatura fisiológica y en ausencia de manipulaciones farmacológicas, mostraron que estas rebanadas representan la evolución epiléptica-como acontecimientos a través del tiempo en cultura. La muerte celular creciente, con análisis de la absorción del yoduro del propidium, y el gliosis, evaluados con immunohistochemistry fluorescencia-juntado, también fueron observados. El enfoque experimental presentado destaca el valor de los cultivos organotípicos de rebanadas de corteza rinal-hipocampo como plataforma para estudiar la dinámica y la progresión de la epileptogénesis y para detectar posibles dianas terapéuticas para esta patología cerebral.

Introducción

La epilepsia, uno de los desordenes neurológicos más frecuentes por todo el mundo, es caracterizada por el acontecimiento periódico e imprevisible de la actividad neuronal sincronizada y excesiva en el cerebro. A pesar de las diversas drogas antiepilépticas (AEDs) disponibles, una tercera parte de pacientes con epilepsia es refractaria a la terapia¹ y continúa experimentando asimientos y la disminución cognoscitiva. Además, los AEDs disponibles obstaculizan la cognición debido a sus acciones relativamente generalizadas sobre la actividad neuronal. La epileptogénesis es difícil de estudiar en humanos, debido a las lesiones epileptógenas múltiples y heterogéneas, los largos períodos latentes que duran de meses a décadas y los efectos engañosos del tratamiento anticonvulsivo después de la primera convulsión espontánea.

La identificación de agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de la epilepsia se ha hecho posible debido a los modelos animales de la epilepsia: 1) los modelos genéticos, que utilizan los animales genético predispuestos en los cuales los asimientos ocurren espontáneamente o en respuesta a un estímulo sensorial; 2) modelos de asimientos estímulo-inducidos eléctricos; y 3) modelos farmacológicos de inducción de convulsiones que utilizan pilocarpina (agonista de los receptores muscarínicos), kainato (agonista de los receptores de kainato) o 4-aminopiridina (bloqueador de los canales de potasio), entre otros. Estos modelos fueron cruciales en la comprensión de los cambios de comportamiento, así como de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la epilepsia, y han llevado al descubrimiento de muchos^{DEA 2.}

Las preparaciones ex vivo son también una herramienta de gran alcance para explorar los mecanismos que son la base de epileptogenesis y de ictogenesis. Las rebanadas agudas del hipocampo, que permiten estudios electrofisiológicos de células vivas durante un período de 6-12 h, y las rebanadas organotípicas del hipocampo que pueden conservarse en una incubadora durante un período de días o semanas, se han utilizado ampliamente en estudios de actividad epileptiforme^3.

Las rebanadas cerebrales organotípicas se preparan a partir de tejido explantado y representan un modelo tridimensional fisiológico del cerebro. Estas rebanadas preservan la citoarquitectura de la región de interés e incluyen todas las células cerebrales y su comunicación intercelular⁴.  La región más utilizada para los cultivos organotípicos a largo plazo es el hipocampo, ya que esta región se ve afectada por la pérdida neuronal en múltiples condiciones neurodegenerativas. Han sido ampliamente utilizados para modelar trastornos cerebrales y se consideran excelentes herramientas para evaluar el potencial neuroprotector y terapéutico de un fármaco^5,6. Se describieron modelos de epileptogénesis, accidente cerebrovascular y toxicidad inducida por Aβ en rodajas organotípicas del hipocampo^7,8,9,10. La enfermedad de Parkinson fue explorada en mesencéfalo ventral y estriado, así como corteza-cuerpo calloso-estriado-sustancia negra, rebanadas organotípicas¹¹. Los cultivos organotípicos de rebanadas cerebelosas imitan muchos aspectos de la mielinización axónica y las funciones cerebelosas y son un modelo muy extendido para investigar nuevas estrategias terapéuticas en la esclerosis múltiple¹².

Sin embargo, la investigación clínica y los modelos animales de la epilepsia han sugerido que la corteza rinal, compuesta por cortezas perirhinal y entorhinal, desempeña un papel en la generación¹³del asimiento. Así, se estableció un modelo de epileptogénesis en rebanadas organotípicas de corteza rinal-hipocampo^14. Bajo privación gradual y controlada del suero, las rebanadas organotípicas de la corteza-hipocampo rinal representan la evolución epiléptica-como acontecimientos, a diferencia de rebanadas análogas guardadas siempre en un medio suero-que contiene.

En epilepsia, como en muchas enfermedades agudas y crónicas del sistema nervioso central, la visión neurocéntrica no puede aclarar los mecanismos que son la base del inicio y de la progresión de la enfermedad. La evidencia clínica y experimental apunta a la inflamación cerebral, en la que la microglía y los astrocitos juegan un papel relevante, como uno de los actores clave que contribuyen al proceso epiléptico. Los experimentos farmacológicos en modelos animales de epilepsia sugieren que los efectos antiepileptogénicos pueden lograrse mediante la focalización de vías proinflamatorias, y hoy en día la neuroinflamación se considera una opción novedosa para el desarrollo de enfoques terapéuticos para la epilepsia¹⁵.

Aquí, describimos a fondo la preparación de las culturas organotípicas de la rebanada de la corteza rinal-hipocampo, así como los detalles para registrar actividad epileptiforme espontánea de ellos. Destacamos que este sistema imita varios aspectos neuroinflamatorios de la epilepsia, siendo así conveniente explorar el papel de las células gliales y del neuroinflammation en esta patología. Además, representa una plataforma fácil de usar para la detección de posibles enfoques terapéuticos para la epilepsia.

Protocolo

La legislación portuguesa y las directrices de la Unión Europea (2010/63/UE) se respetaron en todos los procedimientos relativos a la protección de los animales con fines científicos. Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el Organismo Institucional de Bienestar Animal (ORBEA-iMM) de la IMM y la autoridad nacional competente (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).

1. Preparación de rodajas de corteza rinal-hipocampo

NOTA: La preparación de las rebanadas de la corteza rinal-hipocampo utiliza ratas P6-7 Sprague-Dawley.

1. Configuración de la cultura y preparación del medio
   1. El día antes de la cultura, preparar los medios requeridos y colocarlos a 4 °C.
   2. Preparar el medio de disección: 25 mM de glucosa en la solución salina balanceada de Gey (GBSS).
   3. Preparar medio de cultivo: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Suero de Caballo (HS), 25 mM de glucosa, 30 μg/mL de Gentamicina.
   4. Preparar medio de mantenimiento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/mL Gentamicina, HS (15%, 10%, 5% y 0%).
2. Cosecha del cerebro
   1. Justo antes de comenzar el cultivo, agregue 1.1 mL de medio de cultivo a cada pozo de la placa de 6 pozos con una pipeta P1000 y colóquele a 37 °C.
   2. Coloque todo el equipo (microscopio de disección, helicóptero de tejidos, lámpara de disección, herramientas de disección, electrodos, placas, insertos y papeles de filtro) dentro del gabinete de seguridad biológica y esterilice bajo luz UV durante 15 minutos.
   3. Ajuste el grosor de la rebanada a 350 μm.
   4. Retire el GBSS de la nevera. Añadir 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Se requerirán seis placas de Petri por animal.
   5. Eutanasiar al cachorro de rata. Realizar la decapitación mediante el uso de una tijera afilada en la base del tronco encefálico del animal.
   6. Lave la cabeza del animal tres veces en GBSS frío y llévelo dentro del gabinete de seguridad.
3. Aislamiento de tejidos y preparación de rodajas
   1. Inserte firmemente las órceps afiladas en las cuencas de los ojos para sostener la cabeza.
   2. Usando una tijera delgada cortar la piel / cuero cabelludo a lo largo de la línea media a partir del agujero vertebral hacia los lóbulos frontales y ponerlo a un lado.
   3. Cortar de la misma manera el cráneo y a lo largo de la fisura transversal cerebral (espacio entre el cerebro y el cerebelo). Con fórceps largos curvos, muévalo aparte.
   4. Deseche los bulbos olfativos con una espátula. Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en el SGB helado con la superficie dorsal hacia arriba (Figura 1A).
   5. Inserte las fórceps finas en el cerebelo y vaya a lo largo de la línea media con la espátula abriendo cada hemisferio con mucho cuidado (Figura 1B).
   6. Con fórceps de curva corta, retire cuidadosamente el exceso de tejido que cubre el hipocampo, sin tocar la estructura del hipocampo. Luego con una espátula, cortar debajo de cada hipocampo (Figura 1C).
   7. Coge un hemisferio y colótalo, con el hipocampo hacia arriba, sobre un papel de filtro. Repita el procedimiento con el otro hemisferio y colólelo paralelo al primero, en el papel de filtro. Ponga el papel de filtro en el helicóptero de tejido, con los hemisferios perpendiculares a la hoja, y corte los hemisferios en rodajas de 350 μm (Figura 1D).
   8. Coloque el tejido cortado en rodajas en una placa de Petri con GBSS frío (Figura 1E).
   9. Separe cuidadosamente las rebanadas utilizando los electrodos de punta redonda(Figura 1F). Mantenga solo las rebanadas con una corteza rinal e hipocampo estructuralmente intactos. Las áreas DG y CA deben estar perfectamente definidas, así como la corteza entorrinal y perirhinal (Figura 1G).
   10. Coloque cada rebanada sobre el inserto (Figura 1H-I), con una espátula y un electrodo de punta redonda. Retire el exceso de medio de disección alrededor de cada rebanada con una pipeta P20 (Figura 1J). Cuatro rebanadas de corteza rinal-hipocampo se pueden cultivar en un solo inserto (Figura 1K).
4. Mantenimiento de la cultura
   1. Cambie el medio cada dos días.
   2. Calentar el medio a 37 °C.
   3. Tome los platos de la incubadora. Recoja cada inserto sosteniendo el borde de plástico con fórceps (Figura 1L).
   4. Utilice una mano libre para aspirar el medio del pozo. Colocar el inserto de nuevo en el pozo y añadir 1 mL, con una pipeta P1000, de medio fresco calentado (Figura 1M). Repita el tiempo para todas las inserciones. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre la membrana y el medio.

NOTA: Epiléptico-como las rebanadas experimentan una privación gradual y controlada del suero en el medio. A partir de los 9 días in vitro (DIV), las rebanadas se mantienen en NBA sin HS^14.

Figura 1: Procedimiento detallado para la preparación de rodajas organotípicas de corteza rinal-hipocampo. (A) Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en el SGB helado con la superficie dorsal hacia arriba. (B) Inserte los fórceps en el cerebelo. Abra el cerebro a través de la línea media y elimine el exceso de tejido sobre el hipocampo. (C) Con una espátula cortada debajo del hipocampo, como lo indican las flechas. (D) Coloque ambos hipocampos hacia arriba y paralelos entre sí en el papel de filtro y corte las rodajas de 350 μm en el helicóptero de tejidos. (E) Coloque el hipocampo en rodajas en GBSS helado. (F) Separe las rebanadas con la ayuda de electrodos de vidrio con punta redonda. (G) Elija sólo las rebanadas que representan una corteza rinal intacta y el hipocampo. (H, I) Con la ayuda de un electrodo de vidrio con punta redonda empuje cada rebanada a la espátula y colóquela en el inserto. (J) Quite el GBSS que rodea el segmento. (K) Colocar cuatro rodajas por inserto. (L) Para cambiar el medio, levante el inserto y aspire el medio con una pipeta de vidrio. (M)Añadir medio fresco colocando la pipeta entre el inserto y las paredes de la placa de 6 pozos. Asegúrese de que no haya burbujas de aire debajo de las rebanadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

2. Grabaciones electrofisiológicas

NOTA: Las grabaciones electrofisiológicas fueron realizadas en rebanadas organotípicas de la corteza-hipocampo rhinal en 7, 14 y 21 DIV en un interfaz-tipo compartimiento. Las grabaciones se obtuvieron con un amplificador, se digitalizaron y analizaron con software. Todas las grabaciones fueron filtradas por paso de banda (filtro Bessel de ocho polos a 60 Hz y filtro gaussiano a 600 Hz).

1. Preparación del programa de instalación
   1. Preparar 50 mL de medio NBA con 1 mL de B27 y 250 μL de L-Glutamina. Calentar a 37 °C.
   2. Establezca la configuración de electrofisiología en circuito cerrado. Verifique si el caudal es de 2 mL/min.
   3. Abra la válvula carbox (5% CO₂/95% O₂₎y compruebe el nivel de agua en el sistema.
   4. Coloque el papel de filtro en la cámara de grabación de la interfaz para drenar el exceso de medio y el papel de limpieza de la lente debajo del marco para suministrar el medio a la rebanada.
   5. Encienda el controlador de temperatura, los amplificadores y el micromanipulador.
   6. Deje que la temperatura en la cámara de interfaz se estabilice a 37 °C antes de iniciar las grabaciones.
   7. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1.2 mM NaH₂PO_4,25 mM NaHCO_3,10 mM glucosa, 2 mM CaCl_2,1 mM MgSO₄ con pH 7.4) y utilizarlo para llenar el electrodo de vidrio con una jeringa. Colótelo en el electrodo receptor.
2. Registros de actividad espontánea
   1. Una vez que la temperatura sea estable, retire la placa de la incubadora y corte una rebanada del inserto con una cuchilla muy afilada. Colóquelo en una placa de 60 mm con una gota de medio. Llébalo a la cámara de grabación de la interfaz.
   2. Coloque la rebanada en la cámara de interfaz con el hipocampo en la parte inferior derecha. Coloque el electrodo receptor en la capa de celda piramidal CA3.
   3. Proceder al protocolo de adquisición continua y grabar durante 30 min.

3. Ensayo de absorción de PI

NOTA: La muerte celular fue evaluada supervisando la absorción celular del yoduro fluorescente del propidium del tinte (pi). El PI es un compuesto polar, que entra en las células con las membranas celulares dañadas e interactúa con el ADN emitiendo fluorescencia roja (absorbancia 493 nm, emisión 630 nm). Dado que el PI no es permeante a las células vivas, se utiliza para detectar células muertas en una población.

1. Incubación de PI
   1. Preparar, en medio de cultivo, una dilución fresca 1:10 de pi stock.
   2. Para el ensayo de absorción de PI, retire la placa de la incubadora y levante cuidadosamente el inserto. Añadir 13 μL de PI al medio, con una pipeta P20, obteniendo una concentración final de 2 μM.  Agte lentamente la placa antes de volver a colocar el inserto en su lugar. Asegúrese de que no haya burbujas debajo de las rebanadas.
   3. Vuelva a colocar las rodajas en la incubadora de 37 °C durante 2 h.
   4. Continúe con el protocolo de inmunohistoquímica, como se describe en la siguiente sección. Cubra las placas con aluminio, ya que PI es sensible a la luz.

4. Inmunohistoquímica

NOTA: En inmunohistoquímica se utilizó un anticuerpo específico de la neurona, así como anticuerpos capaces de discriminar fenotipos de reposo y reactivos de la microglía y los astrocitos, para evaluar la extensión de la muerte neuronal y la gliosis en la corteza rinal-hipocampo epiléptico-como rebanadas organotípicas.

1. Fijación tisular
   1. Retire la placa de la incubadora y aspire el medio. Fije las rebanadas con paraformadehído al 4% (PFA) durante 1 h en RT, añadiendo 1 mL de PFA debajo y por encima de las rodajas, con una pipeta P1000.
   2. Quite el PFA y agregue 1 mL de PBS. También agregue PBS debajo y por encima de las rebanadas.
   3. Mantenga las rodajas a 4 °C, en PBS, hasta su posterior uso. Siempre ponga parafilm alrededor de las placas para evitar el secado.
2. Pasos de inmunotenstenimiento
   1. Lavar dos veces, 10 min cada vez, con 1 mL de PBS.
   2. Preparar una solución de permeabilización/bloqueo que contenga 1% de Tritón-X100, 10% de SA y 10% de BSA en PBS. Prepare la solución 5% BSA.
   3. Dibuja dos rectángulos con la pluma hidrofóbica (Figura 2A). Corte las rebanadas del inserto (Figura 2B) con una hoja muy afilada. Ponga dos rebanadas por diapositiva (Figura 2C) y agregue 140 μL de solución de permeabilización/bloqueo en la parte superior de cada rebanada, utilizando una pipeta P200. Incubar durante 3 h en RT.
   4. Diluir los anticuerpos primarios a la dilución de trabajo en BSA al 5% en PBS. Incubar con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
   5. Incubar con los anticuerpos secundarios durante 4 h a rt. A partir de este paso, proteja la placa de la luz ya que se está trabajando con fluoróforos.
   6. Colocar una gota de 50 μL de solución de Hoechst en la parte superior de cada rebanada e incubar durante 20 min a rt.
   7. Lavar entre incubaciones. Siempre lave tres veces, durante 10 minutos cada vez, con PBS-T.
   8. Retire Hoechst y lave como se recomienda.
   9. Añadir 50 μL de medio de montaje en la parte superior de cada rebanada. Cubrir con una cubierta de vidrio y rodear con esmalte de uñas (Figura 2D).
   10. Dejar secar a RT durante 24 h.
   11. Visualice el immunostaining bajo un microscopio confocal. Mantenga las rodajas manchadas a -20 °C.

Figura 2: Procedimiento específico para el ensayo inmunohistoquístico. (A) Con la pluma hidrofóbica dibujar dos cuadrados en el tobogán. (B) Cortar el trozo de inserto que contiene la rebanada. (C) Coloque cada rebanada en los cuadrados dibujados con la pluma hidrofóbica e inicie el paso de permeabilización / bloqueo. (D) Después de concluir el protocolo, terminar montando las rebanadas en medio de montaje, cubriendo con una cubierta de vidrio y rodeándolo con esmalte de uñas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Resultados

De acuerdo con descripciones anteriores del análisis epiléptico de la señal en rebanadas hippocampal organotypic, las descargas epileptiformes interictal se definen aquí como descargas paroxismales que se distinguen claramente de la actividad de fondo, con un cambio precipitado en polaridad y que ocurren en la frecuencia baja (<2 Hz). Las descargas paroxísticas que duran más de 10 s y ocurren en una frecuencia más alta (≥2 hertzios) se caracterizan como actividad epileptiforme ictal. Si un evento ictal ocurre dentro de 10 s después del anterior, estos dos eventos se consideran como un solo evento ictal.

Las rebanadas organotípicas de corteza rinal-hipocampo a 7 DIV(Figura 3A)representan una actividad interictal e ictal mixta. A los 14 DIV(Figura 3B),la actividad espontánea se caracteriza por altas ictales, que evolucionan a una actividad ictal abrumadora a los 21 DIV, con eventos ictales que duran >1 min (Figura 3C).

Figura 3: Actividad epileptiforme espontánea de las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo. Eventos electrográficos representativos similares a las convulsiones, registrados desde el área CA3 en una cámara de tipo interfaz, después de(A)7 DIV,(B)14 DIV y(C)21 DIV. Los detalles de la incautación se muestran en trazas más bajas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Ensayo de captación de PI seguido de inmunohistoquímica contra el marcador neuronal NeuN dirigido a identificar la muerte neuronal. La absorción de PI por neuronas granulares y piramidales se observó en 7 rebanadas div (flechas en la Figura 4A),pero el número de neuronas PI⁺ aumentó a 14 DIV (flechas en la Figura 4B),corroborando un aumento de la muerte neuronal con progresión de la epileptogénesis.

Figura 4: Imágenes representativas de neun y pi manchadas de corteza rhinal-hipocampo organotípicas. Las imágenes de neun teñido neuronas maduras y células PI-positivas se adquirieron en(A)7 DIV y(B)14 DIV, en un microscopio láser confocal con un objetivo 20x. Se muestran imágenes ampliadas de las áreas discontinuas. Las flechas apuntan a las neuronas de la muerte (en naranja). Escala-barra, 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Una coloración doble de Iba1, junto con CD68, fue utilizada para evaluar fenotipo de la microglia. Iba1 es un marcador de microglía/macrófagos, mientras que CD68 es una proteína lisosomal expresada en niveles altos por microglía reactiva y en niveles bajos por microglía en reposo. A 7 rebanadas DIV, las microglías ramificadas con una expresión CD68 baja (flechas en la Figura 5A)son más abundantes que Iba1⁺/CD68⁺ microglía reactiva (puntas de flecha en la Figura 5A),mientras que a las 14 DIV, en todas las áreas del hipocampo, Iba1⁺/CD68⁺ microglía M1 tupida/ameboide (puntas de flecha en la Figura 5B)superan a la microglía con una expresión CD68 baja (flechas en la Figura 5B). A los 14 DIV se pueden localizar algunas células^Iba1+/CD68+ con una apariencia de hiper-ramificación (puntas de flecha abiertas en la Figura 5B),lo que podría sugerir la aparición del fenotipo antiinflamatorio M2 de la microglía. Sin embargo, este asunto requiere un estudio más profundo.

Estudios recientes demostraron que diferentes lesiones del SNC iniciador pueden provocar al menos dos tipos de astrocitos reactivos, A1 y A2, siendo los astrocitos A1 neurotóxicos^16. El subtipo A1 de astrocitos se caracteriza por una mayor expresión del Complemento C3^16,17,18. El complemento C3, que desempeña un papel central en la activación del sistema del complemento, genera C3b, que se degrada aún más a iC3b, C3dg y C3d^19. Así, una coloración doble de GFAP y de C3d fue empleada para evaluar astrogliosis. A los 7 DIV la expresión de C3d es apenas detectable(Figura 6A),mientras que en 14 rodajas DIV se pueden observar GFAP hipertróficos⁺/C3d⁺ astrocitos (puntas de flecha en la Figura 6B),lo que sugiere una activación progresiva de los astrocitos A1.

Los resultados demuestran una activación progresiva de la microglía y los astrocitos a lo largo del curso de la epileptogénesis, imitando los eventos descritos en pacientes con epilepsia y en modelos animales de esta patología.

Figura 5: Imágenes representativas de iba1 y CD68 manchadas de corteza rinal-hipocampo organotípicas. Las imágenes de la microglía manchada Iba1 y CD68, y de los núcleos manchados Hoechst, fueron adquiridas en(A)7 DIV y(B)14 DIV, en un microscopio laser confocal con un objetivo 20x. Se muestran imágenes ampliadas de las áreas discontinuas. Las flechas apuntan a Iba1⁺/CD68^- microglía en reposo, las puntas de flecha indican Iba1⁺/CD68⁺ microglía tupida/ameboide y las puntas de flecha abiertas revelan Iba1⁺/CD68⁺ microglía hiper-ramificada. Escala-barra, 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6: Imágenes representativas de rebanadas organotípicas de corteza rinal-hipocampo teñidas de GFAP y C3d. Las imágenes de los astrocytes manchados GFAP y de C3d, y de los núcleos manchados Hoechst, fueron adquiridas en(A)7 DIV y(B)14 DIV, en un microscopio laser confocal con un objetivo 20x. Se muestran imágenes ampliadas de las áreas discontinuas. Las puntas de flecha apuntan a GFAP⁺/C3d⁺ astrocitos reactivos A1 (en amarillo). Escala-barra, 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Discusión

Los modelos animales de epilepsia han sido cruciales para el descubrimiento de muchos AEDs, sin embargo requieren muchos animales y la mayoría de ellos son lentos debido al período latente para el inicio de asimiento. La inducción del bajo-magnesio de la actividad epileptiforme en rebanadas agudas hippocampal también se ha revisado a fondo en la literatura^3,pero las rebanadas agudas tienen una viabilidad de 6-12 h que hace imposible evaluar cambios de largo plazo. Las rebanadas organotípicas se pueden mantener en cultivo de días a semanas, permitiendo superar el corto tiempo de viabilidad de las rebanadas agudas, y se han propuesto modelos de epileptogénesis en rodajas organotípicas del hipocampo^3,7,8.

Aquí describimos la preparación de rebanadas organotípicas, que comprenden la corteza rinal y el hipocampo. Estas rebanadas tardan 15-20 minutos en prepararse por animal, comenzando desde el sacrificio de animales hasta la colocación de rodajas en las inserciones, y se pueden obtener 6-8 rodajas por hemisferio. Se debe tener especial cuidado al abrir el hemisferio para exponer el hipocampo y al extraer el pañuelo del papel de filtro después de cortarlo. El exceso de tejido por encima del hipocampo también puede comprometer la integridad de la rebanada durante el corte.

Las rebanadas organotípicas de la corteza-hipocampo rinal representan una evolución epiléptica-como la actividad que se asemeja a epilepsia in vivo. Después de una semana en la cultura, la mayoría de las rebanadas representan la actividad interictal e ictal-como mezclada, que progresa a los acontecimientos ictal-como solamente con tiempo en cultura. Hasta ahora, hemos registrado pocas descargas interictales en rebanadas con 2-3 semanas. En este sistema, epiléptico-como la actividad aparece convertirse más rápidamente que en rebanadas hippocampal organotypic. Esto podría atribuirse a la presencia de la corteza rinal, que preserva la mayor parte de la entrada funcional al hipocampo. Para abordar completamente este problema, actualmente se está realizando una caracterización completa de las señales epilépticas mostradas por estas rebanadas a lo largo del tiempo en cultivo, como el número y la duración de los eventos ictales, junto con su amplitud y frecuencia.

Este sistema puede mantenerse en cultivo durante más de tres semanas, e imita muchos correlatos moleculares de la epilepsia, como la muerte neuronal, la activación de la microglía y los astrocitos y el aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias^14,lo que permite una caracterización a largo plazo de estos aspectos. También representa una plataforma de cribado fácil de usar, donde se pueden implementar intervenciones farmacológicas dirigidas a vías celulares específicas y se pueden probar posibles dianas terapéuticas. Indudablemente, el sistema aquí presentado puede ayudar a aclarar más lejos los mecanismos del epileptogenesis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de centrífuga de 50 mL, fondo cónico	Corning	430829
70% de etanol	Manuel Vieira, Lda	UN1170
Amplificador	Axon Instruments	Axoclamp 900A
Amplificador	Axon Instruments	Digidata 1440A
Anti-C3d (cabra)	R& D Systems	AF2655	Diluir en una proporción de 1:1000
Anti-CD68 (ratón)	Abcam	ab31630-125ug	Diluir en una proporción de 1:250
Anti-GFAP (ratón)	Millipore SAS	MAB360	Diluir en una proporción de 1:500
Anti-Iba1 (conejo)	Abcam	ab108539	Diluir en una proporción de 1:600
Anti-NeuN (conejo)	Werfen	16712943S	Diluir en una proporción de 1:500
Líquido cefalorraquídeo artificial (LCR)
B-27 casero; Suplemento (50X), sin suero	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Cuchillas para mango de bisturí	Fine Science Tools	10011-00
Albúmina sérica bovina (BSA)	NZYTech	MB04602	5% BSA se utiliza para diluir los anticuerpos primarios. Agregue 0,5 g de BSA en 10 mL de PBS.
Sistema de cámara de corte de cerebro/tejido	Warner Instruments
Cloruro de calcio dihidratado	Merck Millipore	1.02382.0500
Insertos para cultivos celulares, 30 mm, PTFE hidrófilo	Millipore SAS PICM03050
Fuente de luz fría	SCHOTT	KL 300 LED
Microscopio láser confocal	Zeiss	LSM 710
Incubadora convencional	Thermo Scientific Heraeus	BB15, línea de función	ajustada a 37 ° C y 5% CO2
(+)-Glucosa monohidrato	Merck Millipore	1.08342.1000
Solución de D-(+)-Glucosa, 45% en agua	Sigma	G8769
di-Fosfato de hidrógeno di-sódico dihidratado	Merck Milipore	1.06580.1000
Microscopio/lupa de disección	MEIJI TECHNO CO. LTD
122285Burro anti-cabra IgG (H+L) acoplado a Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11057	Diluir en una proporción 1:200
Burro anti-ratón IgG (H+L) acoplado a Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202	Diluir en una proporción 1:200
Burro anti-ratón IgG (H+L) acoplado a Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10037	Diluir en una proporción 1:200
Burro anti-conejo IgG (H+L) acoplado a Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	Diluir en una proporción 1:500
Burro anti-conejo IgG (H+L) acoplado a Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Diluir en una proporción 1:500
Dumont #5 Pinzas Finas Biologie Inox	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5 Pinzas Standard Inox	Fine Science Tools	11251-20
Pinzas Dumont #7 Standard Dumoxel	Fine Science Tools	11271-30
Dumont Medical #7S Pinzas de Curva Corta Inox	Fine Science Tools	11273-22
gentamicina, 50 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Gey' s Solución salina equilibrada (GBSS)	Biological Industries	01-919-1A
Electrodos de vidrio	Productos científicos	GB150F-10	Pipetas
Pasteur de vidrio de punta redonda, 230 mm	VWR International	612-1702
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	24020-091
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Solución madre a 2 mg/ml en PBS
Suero de caballo, inactivado por calor (HS)	Thermo Fisher Scientific	26050-088
Ácido clorhídrico	Merck Milipore	1.09057.1000
Pluma hidrofóbica	Dako	S200230-2
INCU-Line IL10	VWR	390-0384
Cámara de interfaz	Warner Instruments	BSC-HT Haas Top
Iris Espátula Curvada	Fine Science Tools	10092-12
Labculture Clase II Cabina de seguridad biológica	HERASafe	HS 12
Papel de limpieza de lentes	TIFFEN
Solución de L-glutamina 200 mM (Q)	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Sulfato de magnesio heptahidratado	Merck Millipore	1.05886.0500
Microtubo 0,5 mL, PP	SARSTEDT	72.699
Microtubo 1,5 mL, PP	SARSTEDT	72.690.001
Microtubo 2,0 mL, PP	SARSTEDT	72.691
Micromanipuladores	Sutter Instrumento	MP-285
Miroscopio Cubrevases, 24 mm x 60 mm	Marienfeld	102242
Esmalte de uñas	Cliché
Medio Neurobasal-A (NBA)	Thermo Fisher Scientific	10888-022
Opti-MEM® I Suero reducido Medio	Thermo Fisher Scientific	31985-047
Paraformaldehído, polvo	VWR Chemicals	2,87,94,295
Bomba peristáltica	Gilson	M312
Tampón salino de fosfato (PBS)			Hecho en casa. El PBS con 0,5% de Tween-20 (PBS-T) se utiliza para lavar las rodajas durante el ensayo de inmunohistoquímica.
Soluciones estándar de fosfato, PO43- en agua	BDH ARISTAR	452232C
Juego de pipetas	Gilson	P2, P10, P20, P100, P200, P1000
Platino 5 cuchillas	Gillette
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P5405-250g
Yoduro de propidio (PI)	Sigma-Aldrich	P4170-25MG	Solución madre a 1 mg/mL en agua.
Papel de filtro cualitativo, celulosa, grado 1, 55 mm	Whatman	1001-055	Retención media 11µ m
Papel de filtro cualitativo, celulosa, grado 1, 90 mm	Whatman	1001-090	Retención media 11µ m
Mango de bisturí	Fine Science Tools	91003-12
Jeringa de insulina con punta deslizante sin aguja 1 mL	SOL-M	161000
Cloruro de sodio	VWR Chemicals	27800.360
Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado	Merck Millipore	1.06346.1000
Hidrogenocarbonato de sodio	Merck Millipore	1.06329.1000
Hidróxido de sodio‎	Merck Milipore	535C549998
Estimulador	Astro Med Inc GRASS Grupo de productos	S48 Estimulador
Tijeras para estudiantes Recto SharpSharp 12cm	Herramientas de ciencia fina	91402-12
SuperFrost Plus™ Portaobjetos de adherencia	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
Placa de cultivo de tejidos estéril de 60 x 15 mm	tratada con TC Placas
TC	Corning	CORN3516
controlador de temperatura	MEDICAL SYSTEMS CORP.	TC-102
Picadora de tejidos	The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	Ajustado a 350 μ m
Triton X-100	BDH	14630
Tween-20	Sigma	P2287