El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo murino de cicatrización de la quemadura. Se indujo una quemadura térmica en la piel dorsal de los ratones utilizando una plantilla de latón precalentada. El tejido quemado fue desbridado y superpuesto con un injerto de piel cosechado de la cola de un ratón donante genéticamente similar.
Artículo de método
Un modelo murino de una herida de quemadura reconstruida con un injerto de piel alogénico
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las heridas superficiales triviales sanan sin complicaciones por intención primaria. Las heridas profundas, como las quemaduras de espesor completo, se curan por intención secundaria y requieren desbridamiento quirúrgico e injerto de piel. La integración exitosa del injerto del donante en un lecho de herida receptor depende del reclutamiento oportuno de células inmunitarias, la respuesta angiogénica robusta y la nueva formación de matriz extracelular. El desarrollo de nuevos agentes terapéuticos, que se dirigen a algunos procesos clave implicados en la cicatrización de heridas, se ven obstaculizados por la falta de modelos preclínicos fiables con una evaluación objetiva optimizada del cierre de la herida. Aquí, describimos un modelo barato y reproducible de la herida de quemadura experimental de espesor completo reconstruida con un injerto de piel alogénico. La herida se induce en la superficie del dorso de ratones salvajes endogácidos anestesiados de los fondos BALB/C y SKH1-Hrhr. La quemadura se produce utilizando una plantilla de latón de 10 mm de diámetro, que se precalienta a 80 oC y se entrega a una presión constante durante 20 s. La escara de quemadura se extirpa 24 horas después de la lesión y se reemplaza con un injerto de espesor completo cosechado de la cola de un ratón donante genéticamente similar. No se requiere equipo especializado para el procedimiento y las técnicas quirúrgicas son fáciles de seguir. El método puede ser implementado y reproducido sin esfuerzo en la mayoría de los entornos de investigación. Ciertas limitaciones están asociadas con el modelo. Debido a dificultades técnicas, la cosecha de injertos de piel de espesor dividido más delgados no es posible. El método quirúrgico que describimos aquí permite la reconstrucción de heridas por quemaduras utilizando injertos de piel de espesor completo. Se puede utilizar para llevar a cabo pruebas terapéuticas preclínicas.
Introducción
El desbridamiento quirúrgico y el injerto de piel son prácticas clínicas comunes utilizadas en el manejo de heridas crónicas1,heridas por quemaduras2,y heridas agudas como heridas traumáticas3. El injerto de piel se refiere al procedimiento quirúrgico, que consiste en la eliminación de la piel sana de una parte del cuerpo y la transferencia a otra. Los injertos de donantes reemplazan el tejido perdido y proporcionan un andamio estructural para la migración celular y el crecimiento. Tras la integración en el sitio receptor, los injertos de piel reemplazan la barrera cutánea perdida proporcionando protección contra la invasión microbiana, los efectos nocivos del entorno externo y la pérdida excesiva de humedad4. La integración exitosa del injerto de piel depende de varios factores. Estos incluyen respuestas inmunitarias adecuadas en presencia de infecciones microbianas y resolución oportuna de la inflamación, angiogénesis robusta en el lugar de la herida y establecimiento de anastomosas vasculares entre el lecho receptor y el injerto del donante5. A medida que el injerto comienza a degradarse, las células dérmicas residentes deben ser reemplazadas por células capaces de producir nueva matriz extracelular. Al mismo tiempo, los queratinocitos epidérmicos deben arrastrarse sobre la matriz recién producida para formar la neoepidermis y volver a epitelizar la herida. Por lo tanto, es evidente que la migración eficiente de células desde el lecho receptor al injerto del donante es otro factor determinante que influye en la incorporación exitosa del injerto. Dada la gran cantidad de factores involucrados en la cicatrización de heridas6, que pueden ser imposibles de controlar en los ensayos en humanos debido a limitaciones éticas, son necesarios modelos de injerto de piel experimental preclínica. El desarrollo de modelos preclínicos de cicatrización de heridas por quemaduras e injertos de piel asociados será importante para la comprensión de mecanismos complejos implicados en la reparación del tejido cutáneo y esenciales para la prueba de nuevos agentes terapéuticos. Los modelos in vitro de cicatrización de heridas son incapaces de imitar con precisión la complejidad del tejido cutáneo. Los modelos animales in vivo son una herramienta de investigación indispensable para comprender los mecanismos involucrados en la reparación de tejidos.
Se desarrollaron varios métodos de técnica de injerto de piel en roedores para imitar la escisión quirúrgica y la reconstrucción de la herida porquemaduras 7,8,9. Sin embargo, la mayoría de los procedimientos descritos anteriormente no lograron inducir una lesión por quemadura térmica antes del injerto de piel. En lugar de la herida quemada, se indujo una herida escisional de espesor completo, que luego fue reconstruida con un aloinjerto de piel de espesor completo7. Varios puntos de referencia anatómicos como el oído, la cola y la espalda se han utilizado para la cosecha de la piel del donante en roedores7,,8. Se notificaron diferentes técnicas de fijación y estabilización del injerto, incluyendo una "técnica sin sutura"9,suturas7 y pegamento quirúrgico10,11,12.
El propósito de este estudio fue desarrollar un modelo murino de una herida por quemadura de espesor completo que recapitulizaría el enfoque estándar de oro actual en el tratamiento de quemaduras, que implica escisión de tejido no viable e injerto de piel. Se indujo una quemadura térmica en la superficie del dorso de un ratón utilizando una plantilla de latón precalentada. Burn eschar fue extirpado y reemplazado por un injerto de espesor completo cosechado de la cola de un ratón donante. Este modelo experimental tiene tres ventajas clave. En primer lugar, se puede inducir más de una herida por quemaduras en la parte posterior del ratón receptor, y cuatro injertos de piel del donante pueden ser cosechados de una sola cola del ratón donante. Esto significa que se pueden comparar varios tratamientos experimentales y de control utilizando el mismo receptor y animales donantes. Dependiendo de la vía de administración deseada, el tratamiento de control puede incluir la administración local o sistémica del vehículo o control placebo (por ejemplo, aplicación tópica de pomada, inyección subcutánea, intraperitoneal o intravenosa de la solución). En segundo lugar, se puede controlar el momento del tratamiento y el punto final del experimento. En tercer lugar, este modelo depende de la reconstrucción de heridas utilizando injertos de espesor completo cosechados de la cola, que se sabe que tienen una mayor probabilidad de incorporación exitosa en el sitio del donante en comparación con la piel cosechada de la parte posterior13. Esto puede deberse al menor número de células epidérmicas de Langerhans, que desempeñan un papel clave en la inmunobiología cutánea, y están asociadas con el rechazo del injerto de piel14.
El modelo propuesto de cicatrización de heridas e integración de injertos bien puede aplicarse a ratones transgénicos y knockout. El uso de ratones modificados genéticamente ayudará a esclarecer los roles que ciertos genes pueden desempeñar durante la reparación de la herida. También se puede considerar la aplicación exógena de preparados tópicos de heridas o la administración subcutánea de anticuerpos terapéuticos en el lugar de la lesión.
Debido a dificultades técnicas, los injertos de piel de espesor dividido que consisten en la epidermis y parte de la dermis son difíciles de obtener en ratones. Se sabe que los injertos de piel de espesor completo que consisten en la epidermis y la dermis de espesor completo requieren un lecho de heridas bien vascularizado para una integración exitosa. La incapacidad para cosechar injertos de piel de espesor dividido en ratones puede considerarse como una limitación de este modelo. La fijación del injerto de piel en el lecho de la herida receptora se logró a través de la aplicación del pegamento adhesivo quirúrgico, que se asocia con menos trauma y degradación rápida en comparación con otros medios de fijación de tejido15. Estudios anteriores han demostrado que la sutura se asocia con una fijación de tejido más fuerte que el pegamento quirúrgico a las 24 horas después del procedimiento quirúrgico15, que puede considerarse como una desventaja del procedimiento. Sin embargo, en momentos posteriores, la fuerza biomecánica de las heridas tratadas con un adhesivo quirúrgico se vuelve comparable a las suturas15 y mejor que la fijación de grapas16. Después de la fijación del tejido con el pegamento quirúrgico, las heridas deben cubrirse con un vendaje de la herida. Aunque las heridas en la superficie dorsal del ratón son difíciles de alcanzar para el animal, el vendaje de la herida, por otro lado, es fácil de manipular y quitar para el animal. Se pueden justificar cambios frecuentes en el vendaje de la herida.
La hipotermia inducida por anestesia en pequeños roedores es un fenómeno bien documentado17. La hipotermia es un efecto secundario de este procedimiento, que causa complicaciones, y potencialmente compromete la salud animal y la calidad de los datos. Por lo tanto, este método justifica la implementación de estrategias de gestión de la temperatura, especialmente si se utiliza SKH1-Hrhr sin pelo.
La limitación más significativa del uso de ratones para imitar el cierre de la herida humana es la diferencia entre la anatomía de la piel y la fisiología. Las heridas de ratón sanan principalmente a través de la contracción, mientras que las heridas humanas sanan a través de la formación de tejido de granulación y la ree epitelización18. Para tener en cuenta esta discrepancia, el modelo actual puede modificarse y utilizarse en combinación con un anillo de férula firmemente adherido alrededor de la herida para evitar la contracción de la piel19. Dadas algunas ventajas y desventajas de este protocolo in vivo, este modelo podría servir como una herramienta para estudiar ciertos procesos involucrados en la cicatrización de heridas que son imposibles de estudiar in vitro.
Protocolo
Todos los experimentos fueron aprobados por el Departamento francés de Educación Superior e Investigación (Número de estudio: 1221620171116517670v2 y DAP180012). Todos los ratones fueron de una sola casa a su llegada a jaulas de plástico y se les permitió un período de aclimatación de 7 días antes del estudio. La sala de animales se mantuvo en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h (luces encendidas a las 07:00). Se proporcionaron alimentos y agua del grifo ad libitum. Los ratones BALB/c y SKH1-Hrhr fueron alimentados con dieta tradicional a base de trigo/soy. Se proporcionó ropa de cama de aserrín junto con material de anidación.
1. Preparación del equipo
- Preparar un dispositivo de combustión para el procedimiento y ajustarlo a 80 oC utilizando el controlador de temperatura(Figura 1A). Verifique la temperatura de la plantilla de latón (Figura 1B,C) utilizando la cámara termográfica infrarroja.
- Asegúrese de que el manómetro digital funciona correctamente.
- Cubra el escenario con una cortina quirúrgica y ajuste la altura de la mesa(Figura 1A).
2. Cuidado animal preoperatorio e intraoperatorio
- Adquirir ratones BALB/c y SKH1-Hrhr, 6-8 semanas de edad.
- Añadir la suspensión del paracetamol a 3 mg/ml al agua potable y suministrar 12 horas antes y hasta 72 horas después del procedimiento.
- Con una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G, administrar buprenorfina por vía subcutánea a 0,05 g/g 30 min antes del procedimiento y cada 6 horas durante las primeras 72 horas después del procedimiento.
- Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G, administre lidocaína al dorso del ratón y 2-3 mm distal en el área de la herida quemada. Inyectar lidocaína a 0,05 g/g por vía subcutánea 15 minutos antes de la inducción de la herida quemada.
- Anestesiar ratones utilizando una inyección intraperitoneal de xilazina a 10 mg/kg y ketamina 100 mg/kg. Utilice una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G para administrar la inyección.
- Paso crítico: Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla calentada y mantenga el ratón caliente para prevenir la hipotermia durante los primeros 30 minutos después de la inducción de la anestesia y durante al menos 15 minutos después de la recuperación de la anestesia. Además de la almohadilla calentada, se pueden utilizar otras modalidades, como lámparas de calor,líquidos calientes circulantes o aire, y depósitos de calor precalentados para regular la temperatura corporal.
- Aplicar gel de lubricación en los ojos del ratón para prevenir la deshidratación de la córnea.
- Utilice el reflejo de abstinencia de pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del de la parte del de la parte del de la parte del de la parte del de la de
- Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G administre 200 l de solución de Ringer lactatada complementada con 5% dextrosa. Administrar el reemplazo de líquidos por vía subcutánea inmediatamente después de la inducción de la anestesia y 6 horas después del procedimiento para prevenir la deshidratación.
3. Inducción de la herida de quemadura de espesor completo
- Afeitar el ratón anestesiado con los cortapelos.
- Aplicar crema depiladora en la superficie del dorso del ratón durante 1 minuto. Limpie la crema con una gasa estéril y limpie el área con un trozo de gasa húmeda. Blot la piel con un poco de gasa hasta que se seque.
- Coloque el ratón en el escenario cubierto con una cortina quirúrgica y mueva el escenario hacia arriba más cerca de la plantilla de latón precalentada.
- Aplique la plantilla de latón circular en la parte posterior del ratón (80 oC para 20 s) utilizando una presión constante de 0,15 N (Figura 2).
- Paso crítico: Inmediatamente después de la inducción de la quemadura, coloque el animal anestesiado en la almohadilla calentada para prevenir la hipotermia y mantener el ratón caliente durante y después del procedimiento. Una vez recuperado de la anestesia, devolver el ratón a la jaula.
- Paso crítico: Proporcione una dieta de puré en el suelo de la jaula durante las primeras 72 horas después del procedimiento quirúrgico. Los ratones a veces son reacios a alcanzar un tubo de sipper para beber agua después de una lesión por quemaduras.
4. Cosecha del injerto del donante
- Haga una incisión longitudinal con un bisturí en la parte superior de la cola del ratón donante y retire suavemente la piel usando fórceps quirúrgicos.
- Coloque la piel de la cola en un plato estéril de Petri lleno de 10 ml de solución salina estéril al 0,9%. Utilice una regla para medir injertos individuales y cortar la piel de la cola en pedazos, cada uno de 15 mm, utilizando un bisturí.
- Una vez preparados, mantener los injertos de piel en una solución salina al 0,9% a 4 oC durante un máximo de 2 horas.
5. Escisión quirúrgica e injerto de piel
- Veinticuatro horas después de la inducción de la quemadura, preparar el ratón para la anestesia por inhalación de isoflurano. Coloque el ratón en la cámara de inducción e induzca la anestesia con 5% de isoflurano en oxígeno al 100% a un caudal de 4 L/min. Para mantener la anestesia durante la cirugía, utilice 2% de isoflurano a 2 L/min.
- Coloque una cortina quirúrgica en el ratón y corte una ventana para exponer el campo quirúrgico. Usando la técnica aséptica, frote la herida primero con povidona-yodo y luego con 70% de alcohol.
- Recoge suavemente el tejido quemado con un par de pinzas quirúrgicas e incluye todo el tejido necrótico y no viable con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas. Retire la capa panniculus carnosus de la hipodermis para crear un lecho receptor estable.
- Coloque el injerto de piel en el lecho de la herida recién preparado. Tire suavemente de la piel circundante hacia el injerto de piel usando pinzas quirúrgicas. Aplique un poco de adhesivo quirúrgico para fijar el injerto al lecho de la herida y presione suavemente para alinear los bordes de la piel. Paso crítico: El tamaño del lecho de la herida debe ser ligeramente mayor que el tamaño del injerto de piel para asegurar el injerto exitoso.
- Deje que el ratón se recupere de la anestesia. Paso crítico: Coloque el ratón sobre una almohadilla calentada. Mantenga el ratón caliente durante y después del procedimiento para prevenir la hipotermia.
- Aplique apósito de gasa de parafina inerte y apósito secundario adhesivo sobre la herida injertada.
- Coloque el ratón en una jaula individual. Paso crítico: Proporcione un poco de dieta de puré en el suelo de la jaula durante las primeras 72 horas después del procedimiento quirúrgico y monitoree diariamente.
- Proporcionar juguetes y enriquecer el medio ambiente.
6. Imagen digital y recolección de heridas post mortem
- Fotografíe las heridas con una cámara digital colocando una regla junto a la herida(Figura 3).
- En el punto final del experimento, eutanasia a los animales por exposición al dióxido de carbono y luxación cervical. Paso crítico: La acción excesiva de tracción de la piel durante la luxación cervical puede dañar el injerto.
- En la autopsia, extirpa quirúrgicamente las heridas por quemadura dorsal a la fascia usando tijeras. Heridas de bisect. Fijar la mitad en 10% formalina amortiguada y proceso para histología e inmunohistoquímica. Congelar rápidamente la otra mitad en nitrógeno líquido para la extracción de ARN y la cuantificación de proteínas y mantener a -80 oC.
7. Histología de la piel, inmunohistoquímica y visualización del colágeno
- Incrustar muestras de piel en la parafina, cortar a secciones de 4 m y colocar en diapositivas cargadas positivamente.
- Utilice diapositivas manchadas con hematoxilina y eosina para evaluar la tasa de reepitelización (% de la herida original). El área de la herida cubierta con neoepídermis puede expresarse como un porcentaje de toda la herida (Figura 4). Utilice una aplicación de microscopio digital y el software ImageJ para realizar el análisis microscópico de las secciones.
- Utilice secciones histológicas (espesor de 4 m) preparadas a partir de tejido fijado en formalina y de parafina y someterlos a inmunohistoquímica.
- Para evaluar la expresión de colágeno I y fibronectina en heridas, aplicar anticuerpos primarios e incubar durante 1 h. La detección puede realizarse mediante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP).
- React secciones con: (i) HRP,3,3'-diaminobenzidina (DAB) o (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Tabla de Materiales), que produce un color rojo brillante (Figura 5). Escanee las secciones utilizando un instrumento y analícelos con la aplicación de microscopio digital e ImageJ.
- Para permitir la evaluación histológica de la deposición de colágeno, realice tinción tricroma en secciones histológicas utilizando un kit comercial.
- Para la visualización de la fibra de colágeno, utilice la microscopía multifotona y la segunda técnica de generación armónica (Figura 5). Utilice un microscopio multifoto para la toma de imágenes de tejido como se describió anteriormente20. Utilice un láser Ti:Sapphire con una longitud de onda central a 810 nm como fuente láser para generar señales de fluorescencia excitadas de segunda armónicas y de dos fotgenes (TPEF).
- Utilice un rayo láser equipado con un objetivo de 25x/0.95 W para recoger y excitar la segunda generación armónica (SHG) y TPEF. Detecte señales como se describió anteriormente21 por detectores NDD PMT. Utilice software para el control de escaneo láser y la adquisición de imágenes.
Resultados
Los resultados demuestran que el protocolo desarrollado es un método sencillo, que permite la inducción de una herida por quemadura de espesor completo en ratones. Las quemaduras se inducen utilizando una plantilla de latón precalentada(Figura 1A-C). El área quemada aparece como una herida circular con una escara blanca y una zona hiperémica. El tamaño de la herida por quemadura es ligeramente mayor a las 24 horas después de la lesión por quemaduras como resultado del fenómeno bien descrito conocido como la progresión de la lesión por quemaduras, que posiblemente se debe a la inflamación aguda22. Después de la escisión, las heridas por quemaduras se reconstruyen utilizando injerto de piel alogénico (Figura 3). El día 7 después de la lesión por quemaduras, las heridas se vascularizan5,lo que es una indicación de un injerto exitoso. Los queratinocitos epidérmicos migran de la piel receptora adyacente en el esfuerzo por cerrar la herida y cerrar la brecha entre los dos bordes de las heridas. El análisis microscópico de la sección teñida de H y E de las heridas reveló que la longitud de la neoeptodermis se hace significativamente más larga en el día 7 después de la lesión por quemaduras en comparación con el día 3 después de la lesión por quemaduras (Figura 4B). Antes de realizar un gran estudio, es muy recomendable que los investigadores completen un estudio piloto, que permita la exploración de una intervención novedosa, la evaluación de la viabilidad, la identificación de modificaciones al método para garantizar la reproducibilidad. Los efectos estadísticamente significativos son difíciles de detectar en muestras más pequeñas, mientras que aumentar el tamaño de la muestra es una forma de aumentar la potencia estadística de una prueba. Por ejemplo, para detectar una diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05) en la tasa de ree epitelización de la herida (Figura 4) entre grupos, el tamaño de la muestra debe estar entre seis y ocho ratones por grupo. Todos los experimentos deben repetirse al menos dos veces. A medida que las células productoras de matriz, como los fibroblastos, migran del tejido receptor al injerto, los componentes clave de la matriz extracelular, incluyendo el colágeno I y la fibronectina se expresan altamente en la matriz recién formada (Figura 5).
Figura 1: Configuración del dispositivo de grabación. (A) Colocación y configuración del dispositivo en llamas. El dispositivo de combustión está conectado al controlador de temperatura y está conectado al monómetro digital para permitir la monitorización de la presión. El dispositivo de combustión se suspende por encima de una etapa ajustable : superficie plana sobre la que se colocan ratones para la inducción de la quemadura. (B-C) Una imagen de cerca de la plantilla de latón utilizada para inducir quemaduras de herida. (C) El diámetro de la plantilla de latón es de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración esquemática de los diferentes pasos necesarios para reproducir el modelo experimental descrito en este artículo. Hay tres pasos principales para el procedimiento: (i) inducción de la herida quemada utilizando una plantilla de latón precalentada; (ii) escisión quirúrgica del tejido necrótico inviable a las 24 horas posteriores a la lesión por quemaduras; (iii) reconstrucción quirúrgica de la herida utilizando un injerto de piel alogénico de espesor completo cosechado de un ratón donante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La vista macroscópica de las heridas de quemadura de ratón reconstruidas. Imágenes digitales representativas de heridas por quemaduras reconstruidas con injertos de piel alogénicos los días 0, 1, 3 y 7 después de una lesión por quemaduras. La regla de las imágenes está en milímetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Apariencia microscópica de las heridas a los 3 y 7 días después de la lesión por quemaduras. Secciones de heridas de H&E-stained de heridas 3 y 7 días después de una lesión por quemaduras. La longitud de la neoepídermis (línea de puntos) aumenta significativamente en (A) día 3 heridas en comparación con (B) día 7 heridas. En (A) y( B), la barra de escala es de 100 m. (C) Representación gráfica del porcentaje de ree epitelización de la herida. Esto se evaluó midiendo la longitud de la neoepedermis en los días 3 y 7 después de la lesión por quemaduras y se expresó como un porcentaje de toda la longitud de la herida. Los resultados representan la media de S.E.M. (n a 6 ratones en el grupo del día 3; n a 6 ratones en el grupo del día 7, *p < 0,05; Prueba t del estudiante). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación de la matriz extracelular y visualización del colágeno I. Imágenes representativas del análisis de inmunohistoquímica en el día 7 heridas de ratón teñidas de colágeno (A) y (B) fibronectina. Observe la mancha roja intensa en células I-positivas de colágeno en forma de husillo alargado. Tenga en cuenta la tinción marrón en las células fibronectina positivas en la dermis del día 7 heridas. Barra de escala de 50 m en todas las imágenes. En (A) y (B), e denota epidermis y d denota dermis. (C) Visualización de fibras de colágeno y evaluación histológica de la deposición de colágeno. (D) Imagen representativa de colágeno TPEF/SHG del día 7 heridas de ratón. La adquisición simultánea de TPEF/SHG mediante polarización circular y señales SHG se procesó selectivamente para obtener una distribución binaria de SHG después de aplicar un umbral. Las imágenes TPEF (verdes) y SHG (blancas) eran pseudocoloreadas y superpuestas. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
De acuerdo con la clasificación de espesor de la lesión porquemaduras 23, quemaduras de espesor completo se caracterizan por la implicación evidente de todo el espesor de la piel y cierta porción del tejido subcutáneo. Este tipo de herida puede sanar sólo por contracción o con injerto de piel2. Una limitación inherente del método descrito en este artículo es que sólo los injertos de espesor completo, a diferencia de los injertos de espesor dividido, que se utilizan a menudo en el entorno clínico, se cosecharon de la cola de un ratón. Esto se debió a la dificultad técnica, ya que la piel del ratón es demasiado delgada para obtener injertos de espesor dividido. Hay que señalar que los injertos de espesor completo requieren un lecho de herida bien vascularizado, mientras que los injertos de piel de espesor dividido son capaces de sobrevivir en los sitios de donantes con menos vascularización24. Estudios anteriores mostraron que una herida de quemadura inducida en la parte posterior del ratón se asoció con una formación robusta de nueva vasculatura5. Esto sugiere que un área bien vascularizada, como el dorso del ratón, podría considerarse como el punto de referencia anatómico para la inducción de las heridas quemadas.
La profundidad de la herida de quemadura es un factor importante a tener en cuenta. La profundidad de la herida quemada debe ser consistente entre ratones individuales. La reproducibilidad de la profundidad de la herida de quemadura depende de la temperatura de la plantilla de latón, la presión y la duración de la exposición al calor. La profundidad de la herida quemada debe verificarse histológicamente. Es importante tener en cuenta que la presión excesiva o la exposición prolongada de la piel a la plantilla de latón precalentado pueden dañar el tejido subyacente. El tejido que rodea la columna vertebral, incluidos los componentes del sistema nervioso central y periférico, es sensible al calor y, si está dañado, puede provocar parálisis en las patas traseras.
Aunque ninguna mortalidad postoperatoria se asoció directamente con el procedimiento quirúrgico, un pequeño número de ratones SKH1-Hr sin pelo, que son especialmente sensibles al frío, desarrollaron hipotermia y no se recuperaron después de la anestesia general. Por lo tanto, se debe proporcionar calor suplementario durante todos los eventos estéticos y se requiere una vigilancia constante mientras el ratón está anestesiado.
El método descrito en este estudio no se asoció con la infección del sitio quirúrgico. Sin embargo, se debe utilizar una técnica aséptica para evitar la transferencia de microorganismos a la herida quirúrgica durante el período perioperatorio. La inoculación de la herida con microorganismos bioluminiscentes o fluorescentes puede incorporarse al procedimiento. Esta técnica puede ser útil en el estudio de los organismos infecciosos y su patogénesis25. Por ejemplo, la adición o inyección exógena de bacterias bioluminiscentes puede permitir el control de la carga microbiana utilizando la imagen animal entera in vivo25. Dado que se sabe que el vello de ratón interfiere con la fluorescencia animal entera in vivo y las imágenes de bioluminiscencia, los ratones SKH1-Hrhr sin pelo son los anfitriones ideales para los estudios que involucran a reporteros fluorescentes o bioluminiscentes.
Las muestras de tejido de la herida se pueden recoger en diferentes momentos y procesarse para el análisis histológico e inmunohistoquímico. Las proteínas y el ARN pueden aislarse de la biopsia de piel y se pueden utilizar técnicas de biología molecular para evaluar la expresión de moléculas clave implicadas en la cicatrización de heridas.
En el presente estudio, describimos un modelo experimental de cicatrización de la herida por quemaduras y injerto de piel alogénico. Este procedimiento se puede modificar y servir como modelo para estudios preclínicos.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense y école Polytechnique. Agradecemos a nuestro colega el Sr. Yann Plantier, de la Escuela Politécnica, que ha aportado conocimientos y conocimientos especializados que ayudaron enormemente a la producción del archivo de vídeo. Los autores agradecen al Sr. Benoit Peuteman y a la Sra. Charlotte Auriau, del INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, del Hospital Paul Brousse, Villejuif por su bienestar y cuidado de animales proporcionados durante el transcurso de este proyecto.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 ml jeringa | Terumo | SS + 01T1 | |
| aguja de 26 G | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Placa de Petri | Dutscher | 193199 | |
| Báscula de pesaje para animales | Kern | EMB 5.2K5 | |
| Ratón BALB/c | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6 semanas de edad |
| Almohadillas de espuma para biopsia 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Polímero de enlace Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Bloque de latón | BVG | diseñado a medida Circular de | 10 mm de diámetro |
| Buprenorfina (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administrado por vía subcutánea a una dosis de 0,05 μ g/ g |
| Aparato de combustión Kausistar 400 | Traç aMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungría | |
| Anticuerpo de colágeno I | Abcam | ab34710 | Concentración recomendada 1:50; 1:200 |
| D-(+)- glucosa (Dextrosa) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Cámara digital | NIKON | D3400 | objetivo: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Crema depiladora | Veet | ||
| Bisturíes desechables | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Absoluto de etanol | Productos químicos VWR | 20821.310 | |
| Anticuerpo de fibronectina | Abcam | ab23750 | Dilución recomendada 1:1000 |
| Filtro 0,22 um | Sartorius | 16532 | |
| Tijeras finas | F.S.T. | 14094-11 | |
| Pinzas Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Cortapelos | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Almohadilla térmica | Petelevage | 120070 | |
| Isofluorano | Piramal asistencia sanitaria | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamina | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | anestésico quirúrgico, administrado por vía intraperitoneal a una dosis de 100 mg/kg |
| Solución de Ringers Lactato | Escáner de portaobjetos multietiqueta Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina | Perkin Elmer | ||
| Software LAS | Leica | versión 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Apósito Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk | BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaína | Aguettant | N01BB02 | analgésico local, administrado por vía subcutánea a dosis de 0,05 μ g/ g |
| Manómetro | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Kit de tinción | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Micromesh Casetes de biopsia | Simport | M507 | |
| Multiphoton Soporte invertido Leica SP5 Microscopio Leica | Leica microsystems | DM500 | Detectores NDD PMT |
| Apósito no adherente Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
| Ocrygel | Tvm Francia | ###Paracetamol | |
| 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR químicos | 1169945 | |
| diluido a 1:2 | |||
| SKH1-Hrhr ratón | Charles river | 686SKH1-HR | 6 semanas de edad |
| Portaobjetos | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Adhesivo quirúrgico | BSN medical | 9927 | |
| Gasa estéril | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Agua estéril | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Paño quirúrgico | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Zafiro CamaleónUltra | Coherente | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Cámara termográfica Testo | Testo 868 | ||
| Xilacina (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | anestésico quirúrgico, administrado por vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg |
Referencias
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266(2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145(2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663(2019).
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