Un ensayo de alimentación oral bacteriana con mosquitos tratados con antibióticos

Los mosquitos se consideran los vectores más importantes de las enfermedades patógenas humanas, transmitiendo más de un centenar de patógenos, incluyendo el virus del Zika, el virus del Dengue y los parásitos Plasmodium ¹. Cuando los mosquitos toman una comida de sangre para adquirir nutrientes para la oviposición, pueden ingerir accidentalmente patógenos de un huésped infectado a través del tracto digestivo². Es importante destacar que el medio mosquito, que desempeña un papel fundamental tanto en la digestión de las comidas en sangre como en la entrada de patógenos, alberga un microbioma altamente dinámico^3.

Varios estudios han caracterizado la microbiota de mosquitos criada en laboratorio y recogida en el campo utilizando un método dependiente del cultivo o un ensayo de secuenciación de bacterias^4,,5,,6. Especies como Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiay Enterococcus se suelen aislar de los mosquitos en diversos estudios^5,7,8,9. Curiosamente, la microbiota intestinal de los mosquitos fluctúa dinámicamente tanto en la diversidad comunitaria como en la cantidad de especies bacterianas, afectadas por la etapa de desarrollo, las especies, el origen geográfico y el comportamiento de alimentación⁴. Los estudios muestran que la alimentación sanguínea aumenta dramáticamente la carga bacteriana total con una rápida expansión de las especies de Enterobacteriaceae y una reducción de la diversidad general^10,11. Además, la microbiota intestinal del mosquito de la etapa larval generalmente se erradica cuando el insecto sufre metamorfosis durante la pupación y eclosión; por lo tanto, los mosquitos adultos recién surgidos necesitan repoblar su microbiota⁴.

La microbiota intestinal modula la fisiología de los insectos en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la inmunidad, el desarrollo, la reproducción y la competencia vectorial¹². Las larvas de mosquitos estribicos no se desarrollan más allá de la primera estrella, mientras que un suministro oral de bacterias rescata el desarrollo, lo que indica que el microbio intestinal del mosquito es esencial para el desarrollo larvario^13,14. Además, el agotamiento de las bacterias intestinales retrasa la digestión de las comidas en la sangre y la absorción de nutrientes, afecta la maduración de los ovocitos y disminuye la oviposición¹⁵. Además, los mosquitos con microflora intestinal provocan respuestas inmunitarias más altas en comparación con los mosquitos tratados con antibióticos, con una expresión de péptido antimicrobiano constantemente elevada contra otros patógenos para infectar a¹⁶. Por lo general, los antibióticos se administran por vía oral para eliminar las bacterias del intestino de la sartén en estos estudios, y luego se llevan a cabo experimentos para comparar la diferencia entre los mosquitos oxenicos y los mosquitos con microbios commensales. Sin embargo, el mosquito midgut alberga una comunidad diversa de microbios, y cada especie de bacteria podría ejercer un efecto distintivo hacia la fisiología anfitriona.

La microbiota de mosquitos regula la competencia vectorial con efectos divergentes. La colonización por Proteus aislada de mosquitos derivados del campo de las zonas endémicas de dengue confiere la expresión de péptidos antimicrobianos reguladas y la resistencia contra la infección por el virus del dengue¹⁶. El hongo entomopatógeno Beauveria bassiana activa la vía inmune Toll y JAK-STAT contra la infección por arbovirus¹⁷. Por el contrario, el hongo Talaromyces aislado de Aedes aegypti midgut facilita la infección por el virus del dengue mediante la modulación de la actividad de tripsina intestinal¹⁸. Además, Serratia marcescens promueve la transmisión del arbovirus a través de una proteína secretora llamada SmEnhancin, que digiere la capa de mucina en el epitelio intestinal de los mosquitos^19.

Este procedimiento proporciona un método sistemático e intuitivo para la disección del pasto del mosquito, el aislamiento de colonias de bacterias cultivables, la identificación de las especies de bacterias y la reintroducción a través de la alimentación oral. Proporciona resultados representativos de la alimentación de la sangre con una bacteria commensal, Chryseobacterium meningosepticum,sobre el desarrollo del ovario de mosquitos y la oviposición.

1. Disección de la parte media y aislamiento de bacterias cultivables

1. Preparen el mosquito para la disección.
   1. Recoger los mosquitos 7-9 días después de la aparición con un aspirador. Anestesia a los mosquitos recogidos sometiéndolos a una temperatura de 4oC durante 3-5 min y mantén a los mosquitos anestesiados en un plato de Petri helado hasta la disección.
2. Esterilice los instrumentos de laboratorio y la superficie del mosquito.
   1. Esterilice el banco del experimento, el microscopio de disección, los fórceps y el deslizamiento de vidrio rociando un 75% de etanol para evitar la contaminación por bacterias del medio ambiente.
   2. Preparar un plato estéril de Petri que contenga 75% de etanol y dos platos de Petri que contengan solución salina estéril tamponada 1x fosfato (1x PBS).
   3. Esterilizar la superficie del mosquito sumergiéndolo y agitando en 75% de etanol durante 3 minutos, y enjuagar dos veces con 1x tampón PBS en caso de que el etanol afecte la flora intestinal diseccionada.
3. Disecciona el mosquito en la parte media.
   1. Transfiera el mosquito esterilizado por la superficie en el portaobjetos de vidrio con una gota de tampón estéril 1x PBS. Disecciona bajo el microscopio diseccionando.
   2. Bajo el aumento inferior del microscopio diseccionado, retire cuidadosamente las patas, las alas y la cabeza del mosquito para evitar el escape. Retire la última somita del mosquito cortando directamente, en lugar de tirar de ella, para evitar que el tracto digestivo se rompa.
   3. Sujete el tórax del mosquito y el extremo del abdomen con fórceps. Tire suavemente del tracto digestivo del mosquito. El tracto digestivo adquirido generalmente contiene el cultivo, el foregut, el midgut, el hindgut y los tubos malpighianos.
   4. Ajuste el microscopio de disección a un aumento más alto. Retire el cultivo, el foregut, el hindgut y los tubos malpighianos del tracto digestivo diseccionado para obtener el intestino medio del mosquito.
   5. Tenga cuidado mientras retira el cultivo, ya que el cultivo se infla y se asemeja a la parte media después de que el mosquito toma una comida de azúcar. Los tubos malpighianos, un grupo de tubos excretores largos y delgados, se encuentran en el límite entre la parte media y la parte posterior.
4. Aislar las bacterias intestinales.
   1. Transfiera el midgut diseccionado a un tubo estéril de 1,5 ml con 200 ml de tampón estéril de 1x PBS.
   2. Moler el punto medio en un banco estéril a fondo con un pestillo estéril para permitir la liberación completa de bacterias intestinales al tampón.
   3. Serial diluir el homogeneizar a tres diluciones de 10 veces. Agregue 50 l de cada dilución a la placa de agar LB (caldo de Luria), y luego extiéndala en la placa. Si el midgut contiene una alta concentración de flora intestinal, es esencial hacer más diluciones en serie para elegir colonias individuales.
   4. Incubar la placa a 37oC durante 1-2 días hasta que las colonias sean visibles.
5. Identificación de especies
   1. Escoja colonias individuales e inocularlas respectivamente en un matraz cónico de 150 ml que contenga 50 ml de medio de caldo LB.
   2. Agitar las bacterias a 37 oC durante la noche.
   3. Extraer ADN total por kit de extracción de ADN genómico bacteriano. Amplificar 16S rDNA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
      NOTA: Hay varios segmentos en 16S rDNA que se conservan. Sobre la base de estas regiones conservadas, las imprimaciones universales para bacterias se pueden diseñar para amplificar fragmentos de ADNr 16S de todas las bacterias. Estas imprimaciones son específicas de las bacterias, y la diferencia en la región variable de 16S rDNA se puede utilizar para distinguir diferentes bacterias. Por lo tanto, 16S rDNA es ampliamente utilizado para la identificación bacteriana.
   4. Recuperar y purificar fragmentos de ADN de productos de PCR mediante electroforesis de gel de agarosa y un kit de recuperación de gel comercial.
   5. Realizar la secuenciación del ADN en los fragmentos de ADN purificado para obtener secuencias genéticas bacterianas.
   6. Compare la secuencia del gen 16S rRNA con la secuencia bacteriana disponible en GenBank. Seleccione la base de datos Bacterias y Arqueas.
      NOTA: La identificación al nivel de la especie se definió como la similitud de la secuencia de ADNr del 99% 16S con la entrada más cercana de GenBank. El aislado fue asignado al género correspondiente cuando su similitud de secuencia de ADNr 16S fue de <99% y 95%.

2. Tratamiento antibiótico y reintroducción de bacterias

1. Prepare la solución antibiótica.
   1. Pesar la cantidad necesaria de sacarosa, penicilina y estreptomicina para preparar una solución de sacarosa del 10%que incluya 20 unidades de penicilina y 20 g de estreptomicina por ml.
2. Alimente a los mosquitos con la solución antibiótica.
   1. Anestfetizar a los mosquitos en 4 oC durante 3-5 min. Transfiera los mosquitos a una taza de papel. Cubra la parte superior con gasa y enviva la gasa con cinta adhesiva para evitar que los mosquitos escapen.
   2. Sumerja las bolas de algodón estériles en la solución antibiótica y colóquelas cuidadosamente en la taza del mosquito. Apriete las bolas de algodón antes de usarlas para evitar que los mosquitos se ahoguen en las bolas de algodón goteando.
   3. Cubra las bolas de algodón con un plato Petri de 10 cm para evitar la evaporación de la humedad. Sustituya las bolas de algodón dos veces al día durante tres días consecutivos.
3. Confirmar la eficacia del tratamiento con antibióticos.
   1. Según el método anterior, disecciona el medio de los mosquitos tratados con antibióticos.
   2. Transfiera las placas medias diseccionadas a un tubo estéril de 1,5 ml con 200 ml de tampón estéril de 1x PBS.
   3. Moler las vías medias en un banco estéril a fondo con un pestillo estéril para permitir la liberación completa de bacterias intestinales al tampón.
   4. Extraer el ADN microbiano intestinal mediante un kit de extracción de ADN genómico bacteriano.
   5. Realizar la cuantificación bacteriana por PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) en ADN genómico utilizando imprimaciones de eubacterias universales (16S rRNA F: TCCTACGGGAGAGCAGT y R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).
4. Preparación de la suspensión bacteriana
   1. Mida la solución bacteriana con un espectrofotómetro. Añadir 1 OD (OD600) suspensión bacteriana en un tubo de 1 ml. Centrifugar la suspensión a 5.000 x g durante 5 min a 4oC.
   2. Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de tampón estéril 1x PBS al tubo de 1,5 ml para la precipitación de la suspensión.
   3. Centrífuga a 5.000 x g durante 5 min a 4oC; descartar el sobrenadante.
   4. Repita los pasos 2.4.2 y 2.4.3.
   5. Añadir 200 l de tampón estéril de 1x PBS a la precipitación bacteriana.
   6. Añadir 600 l de solución de sacarosa al 10%, 200 ml de ATP de 10 mm (que actúa como un fagostimulante) y 200 l de suspensión bacteriana en un tubo estéril de 1,5 ml. Mezclar por vórtices. Alternativamente, suspenda el pelet bacteriano en sangre inactivada por calor.
   7. Preparación de sangre inactivada por calor
      1. Recoger sangre fresca con un tubo anticoagulante.
      2. Tomar de 2 a 3 ml de sangre fresca. Centrifugar a 1.000 x g durante 10 min a 4 oC para separar el plasma y las células sanguíneas. Tenga en cuenta que la sangre se perderá durante el proceso de centrifugación y lavado; hay una necesidad de calcular el uso por adelantado.
      3. Recoger el plasma en un nuevo tubo de 1,5 ml y inactivar el calor a 56 oC durante 1 h.
      4. Añadir 500 l de tampón estéril de 1x PBS al tubo de 1,5 ml para la suspensión de las células sanguíneas. Centrifugar a 1.000 g durante 10 min a 4oC y luego deseche el sobrenadante.
      5. Repita el paso 2.4.7.4 dos veces.
      6. Resuspender las células sanguíneas con plasma termoactivado para obtener sangre inactivada por calor.
      7. Siga los pasos 2.4.1 a 2.4.4 para obtener 1 OD gestido bacteriano.
      8. Resuspender las bacterias peletadas con 1 ml de sangre inactivada por calor.
5. Alimente al mosquito con suspensión bacteriana.
   1. Muestrese a los mosquitos durante 24 horas, permitiendo que los antibióticos se metabolicen antes de alimentar a las bacterias.
   2. Montar el sistema de alimentación por membrana.
   3. Selle la unidad alimentadora esterilizada con un parafilm, alternativamente una membrana de colágeno.
   4. Ponte un anillo de plástico y fíjelo con parafilm para evitar roturas debido a la fricción durante la alimentación.
   5. Agregue lentamente la solución bacteriana preparada a la unidad alimentadoras. Tenga en cuenta que solo se puede llenar un pozo de la unidad de alimentación de dos pozos con la solución y cubrir la unidad alimentador solo desde el lado de caída del reactivo.
   6. Conecte la unidad alimentador a un sistema de alimentación precalentado a 37 oC, que simula la temperatura humana para atraer a los mosquitos. Coloque el dispositivo de alimentación sobre una taza de papel llena de mosquitos y alimente durante 90 minutos.
   7. Después de la alimentación, anestesia a los mosquitos sometiéndolos a una temperatura de 4oC durante 3-5 min y mantener a los mosquitos anestesiados en un plato de Petri helado.
   8. Escoge los mosquitos completamente engordados para más estudios.

Las vías medias de los mosquitos tratados con antibióticos y sin antibióticos fueron sacados para la extracción de ADN, y qPCR se realizó con imprimaciones bacterianas universales. La Figura 1 muestra la expresión de RRNA bacteriana 16S en el grupo de control y en el grupo de tratamiento antibiótico. Los resultados muestran que alrededor del 98% de las bacterias intestinales se han eliminado, y la esterilización intestinal de penicilina y estreptomicina fue exitosa.

Con los métodos descritos, las cepas bacterianas fueron aisladas e identificadas. C. meningosepticum es un bacilo aeróbico gram-negativo sin fermentación, oxidasa-positiva, perteneciente a Chryseobacterium. La Figura 2 muestra el promedio de huevo puesto por mosquito después de la alimentación sanguínea de mosquitos tratados con antibióticos con C. meningosepticum. La Figura 3 muestra la expresión de genes relacionados con el desarrollo ovárico 24 h después de la comida de sangre que contiene C. meningosepticum. En la Tabla 1se ofrece una visión general de los genes y secuencias de imprimación relacionados con el desarrollo ovárico.

La cepa aislada de las bacterias intestinales de las que se eliminaron las bacterias intestinales y luego los mosquitos completamente engordados se dividieron en tres grupos. Se utilizaron cinco hembras en el primer grupo y el segundo grupo para contar la cantidad de desove, y se utilizaron 10 hembras en el tercer grupo para detectar la expresión génica relacionada con el desarrollo ovárico después de las 24 horas de cada mosquito hembra después de alimentarse, respectivamente. Los resultados muestran que no hay ningún cambio significativo en la producción de óvulos del grupo de control y del grupo de alimentación.

Figura 1: Expresión de RRNA 16S después del tratamiento con antibióticos. Los mosquitos con antibióticos no tratados sirvieron como grupo de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efecto del microbio intestinal en la oviposición de mosquitos. Las cepas bacterianas indicadas se mezclaron con sangre y se alimentaron con mosquitos tratados con antibióticos. Los mosquitos con microbios commensales intestinales no tratados sirvieron como grupo de control. Los datos se presentan como medias de SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Expresión de genes relacionados con la reproducción después de la alimentación sanguínea. Expresión de La catepsin B (A), inhibidor del ATPasa mitocondrial (B), brix de proteína biogénesis ribosoma(C) y serine/threoína-proteína quinasa rio2 (D) después de la alimentación sanguínea de mosquitos tratados con antibióticos durante 24 h con las cepas bacterianas indicadas. Los mosquitos con microbios commensales intestinales no tratados sirvieron como grupo de control. Cada punto representa un mosquito y cada línea representa el valor medio del grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Genes relacionados con el desarrollo ovárico y secuencias de imprimación.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.