Este artículo proporciona protocolos para el diseño y autoensamble de nanoestructuras a partir de oligómeros de ácido nucleico modificados gamma en mezclas de disolventes orgánicos.
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Artículo de método
Autoensamble de ácidos nucleicos de péptidos modificados con gamma en nanoestructuras complejas en mezclas de disolventes orgánicos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las estrategias actuales en nanotecnología de ADN y ARN permiten el autoensamble de una variedad de nanoestructuras de ácido nucleico en medios acuosos o sustancialmente hidratados. En este artículo, describimos protocolos detallados que permiten la construcción de arquitecturas de nanofibra en mezclas de disolventes orgánicos a través del autoensamble de baldosas de ácido nucleico péptido modificado en gamma, de una sola cadena, direccionables de forma única. Cada tesela de una sola cadena (SST) es un oligómero de 12 bases de LANA compuesto por dos dominios modulares concatenados de 6 bases cada uno. Cada dominio puede unirse a un dominio mutuamente complementario presente en las hebras vecinas utilizando la complementariedad programada para formar nanofibras que pueden crecer a micras de longitud. El motivo SST está hecho de 9 oligómeros totales para permitir la formación de nanofibras de 3 hélices. En contraste con las nanoestructuras de ADN análogas, que forman estructuras monodispersas de diámetro, estos sistemas de ARPna forman nanofibras que se agrupan a lo largo de sus anchuras durante el autoensamble en mezclas de disolventes orgánicos. Por lo tanto, los protocolos de autoensamble descritos aquí también incluyen un tensioactivo convencional, el sulfato de dodetil sódico (SDS), para reducir los efectos de agrupación.
Introducción
Construcción exitosa de numerosas nanoestructuras complejas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 en medios acuosos o sustancialmente hidratados hechos con natural ácidos nucleicos que ocurren tales como ADN1,2,
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Protocolo
1. Diseño de la secuencia de la ADNA
- Descargue DNA Design Toolbox22 desarrollado por Winfree Lab en Caltech23 en la carpeta que contiene scripts de programación para diseñar secuencias.
- Dentro de esa carpeta de diseño de secuencia, abra un lenguaje de programación de cuarta generación compatible con la extensión de archivo ".m" y, a continuación, agregue la carpeta "DNAdesign" descargada anteriormente a la ruta de acceso mediante el siguiente comando:
>> addpath DNAdesign - Posteriormente, ejecute el siguiente script denominado "PNA3nanofiber.m" (consulte la figura complementaria 1<....
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Resultados
Los protocolos discutidos en las secciones anteriores describen el diseño de un motivo SST adaptado a partir de nanofibras de ADN para la generación robusta de estructuras automontadas de nanofibras utilizando múltiples oligómeros de ARPna distintos. Esta sección describe la interpretación de los datos obtenidos de la recreación exitosa de los protocolos descritos.
Siguiendo el protocolo descrito en la sección 5 para la toma de imágenes TIRF de muestras de oligómeros de ARPna recocidos en 75% .......
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Discusión
Este artículo se centra en adaptar y mejorar los protocolos de nanotecnología de ácido nucleico existentes hacia las mezclas de disolventes orgánicos. Los métodos descritos aquí se centran en las modificaciones y la solución de problemas dentro de un espacio experimental definido de disolventes orgánicos aproticos polares seleccionados. Todavía existe un potencial inexplorado para que otros protocolos establecidos de nanotecnología de ácido nucleico se adapten dentro de este espacio. Esto podría mejorar las aplicaciones .......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros competidores.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1739308 de la National Science Foundation, la subvención NSF CAREER 1944130 y por la subvención FA9550-18-1-0199 de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea. Las secuencias de la ADP fueron un regalo generoso del Dr. Tumul Srivastava de Trucode Gene Repair, Inc. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Erik Winfree y al Dr. Rizal Hariadi por sus útiles conversaciones sobre el código MATLAB de DNA Design Toolbox. También queremos dar las gracias a Joseph Suhan, Mara Sullivan y el Centro de Imágenes Biológicas por su asistencia en la recopilación de datos de TEM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| y gamma; Cadenas/oligómeros de PNA | Trucode Gene Repair Inc. | Sección 2.1 | |
| Espectrofotómetro UV-Vis | Agilent | Varian Cary 300 | Sección 3.1.2 |
| Cubetas de cuarzo | Starna | 29-Q-10 | Sección 3.1.1 |
| Termociclador | Bio Rad | C1000 touch | Sección 4.1 |
| Tubos de PCR de 0,2 ml | VWR | 53509-304 | Sección 4.5 |
| Anhidro DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Sección 4.6 |
| Sección DMSO | ANHIDRA VWR | EM-MX1457-6 | 4.6 |
| 1,4-dioxano anhidro | AC615121000 | Científico | de Fisher 4.6 |
| Solución salina tamponada con fosfato 10X (PBS) | VWR | 75800-994 | Sección 3.1.1 |
| Portaobjetos de microscopio | VWR | 89085-399 | Sección 5.2 |
| Cubreobjetos de vidrio | Sección VWR | 48382-126 | 5.2 |
| 2% de colodión en acetato de amilo | Sigma-Aldrich | 9817 | Sección 5.2 |
| Acetato de isoamilo | VWR | 200001-180 | Sección 5.2 |
| Albúmina sérica bovina biotinilada (biotina-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Sección 5.3 |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Sección 5.4 |
| Estreptavidina | Sigma-Aldrich | 189730 | Sección 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Sección 5.7 |
| Microscopio de fluorescencia de reflexión interna total | Nikon Nikon | Nikon Ti2-E | Sección 5.8 |
| Microscopio electrónico de transmisión | Joel | JEM 1011 | Sección 6.6 |
| Pinzas | Dumont | 0203-N5AC-PO | Sección 6.3 |
| Acetato de uranilo | Electrón Ciencias de la Microscopía | 22400 | Sección 6.1 |
| Formvar, malla 300, Rejillas de cobre | Ted Pella Inc. | 1701-F | Sección 6.2 |
| Formvar-Monóxido de silicio Tipo A, malla 300, Rejillas de cobre | Ted Pella Inc. | 1829 | Sección 6.2 |
| Oligómeros/hebras de ADN | IDT | Sección 7.1 | |
| Sulfato de dodecilo de sodio (SDS) | VWR | 97064-860 | Sección 8.1 |
Referencias
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
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Reimpresiones y permisos
