Artículo de método

Caracterización de células inmunes y mediadores proinflamatorios en el ambiente pulmonar

DOI:

10.3791/61359

⸱

24 de junio de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el uso de la citometría de flujo para identificar los cambios en la composición de las células inmunitarias, el perfil de citoquinas y el perfil de quimiocinas en el entorno pulmonar después de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media, un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La expansión, activación y tráfico de células inmunes a los pulmones, que están controlados por la expresión de múltiples citoquinas y quimiocinas, pueden verse alterados por una lesión cerebral grave. Esto se evidencia por el hecho de que la neumonía es una causa importante de mortalidad en pacientes que han sufrido un accidente cerebrovascular isquémico. El objetivo de este protocolo es describir el uso del análisis citométrico de flujo multicolor para identificar 13 tipos de células inmunes en los pulmones de ratones, incluidos macrófagos alveolares, macrófagos intersticiales, células dendríticas (DC) CD103 + o CD11b +, CD plasmocitoides, eosinófilos, monocitos / células derivadas de monocitos, neutrófilos, células T y B derivadas de linfoides, células NK y células NKT, después de la inducción isquémica de accidente cerebrovascular por oclusión transitoria de la arteria cerebral media. Además, describimos la preparación de homogeneizados pulmonares utilizando un método de homogeneización de perlas, para determinar los niveles de expresión de 13 citoquinas o quimiocinas diferentes simultáneamente mediante matrices de perlas multiplex junto con análisis citométrico de flujo. Este protocolo también se puede utilizar para investigar la respuesta inmune pulmonar en otros entornos de enfermedades, como la enfermedad pulmonar infecciosa o la enfermedad alérgica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los pulmones son un órgano barrera, expuestos al ambiente externo y, por lo tanto, están constantemente recibiendo desafíos inmunológicos como patógenos y alérgenos1. La activación de las células inmunes residentes en los pulmones y la infiltración de células inmunes de la periferia son necesarias para eliminar los patógenos del entorno pulmonar. Además, las células inmunes residentes en los pulmones mantienen la tolerancia a las bacterias comensales, lo que sugiere que estas células desempeñan un papel en la eliminación de patógenos y en el mantenimiento de la homeostasis1. Los macrófagos alveolares e intersticiales se encuentran entre las células inmunes centinela residentes en los pulmones que detectan patógenos a través de receptores de reconocimiento de patrones y eliminan estos patógenos por fagocitosis2. Las células dendríticas residentes en los pulmones unen la respuesta inmune innata y adaptativa a través de la presentación del antígeno3. Además, las células inmunes innatas locales activadas producen citoquinas y quimiocinas que amplifican la respuesta inflamatoria y estimulan la infiltración de células inmunes como monocitos, neutrófilos y linfocitos en los pulmones1. Se ha demostrado que el accidente cerebrovascular isquémico modifica la inmunidad sistémica y conduce a una mayor susceptibilidad a la infección pulmonar; Sin embargo, pocos estudios han evaluado el compartimento pulmonar después del accidente cerebrovascular isquémico, aunque algunos estudios lo han examinado durante condiciones inflamatorias 4,5,6,7,8,9. El objetivo de los métodos descritos en este documento es determinar simultáneamente la patología pulmonar, la composición de las células inmunes y los niveles de expresión de citoquinas y quimiocinas en los pulmones para evaluar las alteraciones en el compartimiento pulmonar y evaluar las posibles alteraciones en la respuesta inmune pulmonar después del ataque isquémico.

Aquí se describe un protocolo para obtener suspensiones de células individuales de los pulmones de los ratones para identificar 13 tipos de células inmunes. Este protocolo se basa en la digestión de tejidos con colagenasa D sin necesidad de un disociador tisular automatizado. Además, desarrollamos un protocolo para preparar homogeneizados tisulares que se pueden usar para determinar los niveles de expresión de 13 citoquinas o quimiocinas diferentes utilizando matrices de perlas multiplex basadas en citometría de flujo. Este protocolo se utilizó con éxito para investigar los efectos del accidente cerebrovascular isquémico en la inmunidad pulmonar y también se puede utilizar en otros modelos de enfermedad.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los protocolos y procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de West Virginia. Los ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos en el vivero de la Universidad de Virginia Occidental.

1. Preparación de soluciones

  1. Preparar tampón de perfusión (solución salina tamponada con fosfato, PBS). Use aproximadamente dos alícuotas de 10 ml de PBS helado por ratón.
  2. Preparar el medio de células pulmonares/tampón FACS. El tampón del FACS contiene PBS suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 1%. Mantener el medio frío durante todo el proceso de escisión y transferencia pulmonar. Preparar aproximadamente 8 ml por muestra de pulmón. Prepare un medio fresco/tampón FACS antes de los experimentos.
  3. Preparar el tampón de disociación para el aislamiento de una sola célula. El tampón contiene 1 mg/ml de colagenasa D y 200 μg/ml de DNasa I en la solución salina tamponada de Hank (HBSS). Preparar fresco de la solución madre (100 mg/ml de colagenasa D y 10 mg/ml de DNasa I) antes de los experimentos. Se necesitan aproximadamente 6 ml por muestra pulmonar. Asegúrese de que el tampón alcance la temperatura ambiente antes de su uso.
  4. Preparar el tampón de homogeneización para la homogeneización del tejido pulmonar. El tampón contiene PBS y 1x cóctel de inhibidores de proteinasa y fosfatasa (stock = 100x). Recién preparado antes de los experimentos. Mantenga el tampón frío durante todo el proceso de homogeneización. Aproximadamente 200 μL del tampón es suficiente para homogeneizar un solo lóbulo derecho de los pulmones.

2. Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO)

NOTA: Los procedimientos para tMCAO a través de la inserción de monofilamento en la arteria cerebral media se documentaron en detalle previamente10. En estos experimentos, se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de 8 a 12 semanas de edad, con un peso de 25-30 g.

  1. En resumen, administrar por vía subcutánea 2 mg/kg de meloxicam a los ratones antes de la cirugía. Anestesiar profundamente a los ratones en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 5%. Confirme la anestesia profunda utilizando el método de pellizco del dedo del pie. Mantener la anestesia con isoflurano al 1-2% durante la cirugía utilizando un cono nasal. Mantenga la temperatura corporal a 36.5 - 38 ° C durante todo el procedimiento colocando una manta caliente debajo de los ratones. Todas las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas en autoclave un día antes de la cirugía.
  2. Afeite y prepare la piel del cuello ventral con etanol al 70% seguido de exfoliante de clorhexidina. Administrar por vía subcutánea 2 mg/kg de bupivacaína sobre el área de la incisión antes de hacer la primera incisión. Use ungüento para los ojos para cubrir los ojos y prevenir la sequedad. Haga una incisión en la línea media del cuello. Retire suavemente los tejidos blandos alrededor de la tráquea.
  3. Identificar la arteria carótida común izquierda y la arteria carótida externa.
  4. Aplique una sutura temporal (tamaño 6/0) a la arteria carótida común para detener el flujo de la sangre. Haga una incisión en la arteria carótida externa.
  5. Inserte un monofilamento recubierto de goma de silicona (tamaño 6-0) en la arteria carótida externa, luego avance el monofilamento a la arteria cerebral media. Dejar el monofilamento en la arteria cerebral media durante 60 min (oclusión).
  6. Controle la tasa de flujo sanguíneo utilizando la flujometría láser Doppler. Una reducción en la tasa de flujo a la arteria cerebral media que es > 80% indica una oclusión exitosa.
  7. Después de los 60 minutos de oclusión, retire el monofilamento para permitir que ocurra la reperfusión. Cierre la incisión.
  8. En ratones operados con simulacro, realice los pasos 2.1-2.6 sin la inserción del monofilamento. En estos ratones, la tasa de flujo sanguíneo debe permanecer estable durante todo el procedimiento.
  9. Monitorizar diariamente los ratones y medir los déficits neurológicos utilizando criterios de puntuación estándar11. 0 – sin déficit neurológico; 1 – retrae la pata delantera contralateral cuando se levanta por la cola; 2- círculos a la contralateral cuando se levanta por la cola; 3- caer a la contralateral mientras camina; 4 – no camina espontáneamente o está en coma; 5 – muerto.
  10. Proporcionar inyecciones subcutáneas de solución salina normal y analgésico (meloxicam, 2 mg/kg) cada 24 horas durante 3 días después de la cirugía.
  11. Aislar los pulmones 24 y 72 h después de tMCAO para el análisis posterior.

3. Recolección de los tejidos pulmonares

  1. Anestesiar profundamente al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina. Confirme la anestesia profunda utilizando el método de pellizco del dedo del pie.
  2. Para realizar la perfusión transcárdica de todo el cuerpo12, fije el ratón a la plataforma quirúrgica y moje el pelaje con etanol al 70% para reducir la distribución del pelaje en la cavidad corporal. Use tijeras de disección fina para hacer una incisión transversal en el abdomen caudal y luego una incisión en la línea media del peritoneo, deteniéndose en la cavidad torácica antes de perforar el diafragma.
    1. No corte a través del músculo/piel en la cavidad peritoneal y no continúe la incisión más allá del abdomen.
  3. Detenga la incisión tan pronto como se haya alcanzado la cavidad torácica antes de perforar el diafragma. Tenga cuidado de no dañar el corazón y los pulmones que puedan comprometer la calidad de la perfusión o la recuperación celular
  4. Usando tijeras de disección fina haga una incisión en la línea media del peritoneo deteniéndose en la cavidad torácica antes de perforar el diafragma.
  5. Agarre al ratón por el extremo distal del esternón con fórceps y levántelo hacia arriba mientras corta a través del diafragma asegurándose de no dañar el corazón, los pulmones o la vasculatura. Una vez que los órganos sean visibles, haga una incisión a través de la caja torácica y separe y fije la caja de la costilla para que el corazón y los pulmones estén completamente expuestos.
  6. Haga con cuidado una pequeña incisión en la aurícula derecha cerca del arco aórtico. Esto servirá como salida para la perfusión.
  7. Inmediatamente después, inserte suavemente una aguja de 25 G x 5/8 conectada a una jeringa llena con 10 ml de PBS frío en la superficie superior distal del ventrículo izquierdo. Tenga cuidado de no insertarse a través del tabique ventricular en el ventrículo derecho. La aguja apenas debe insertarse en el ventrículo izquierdo.
    NOTA: Si se perfora el tabique ventricular, el líquido saldrá corriendo de la nariz del ratón. Esto disminuirá la calidad de la perfusión y dará lugar a la pérdida de células.
  8. Si se desea, se puede usar una pinza para mantener la aguja firmemente en su lugar en el ventrículo izquierdo durante la perfusión.
  9. Empuje de manera constante pero suave 10 ml de PBS frío en el corazón. El tejido del ratón debe comenzar a perfundir y limpiar la sangre a medida que el líquido sale de la aurícula derecha.
    1. Empuje una segunda alícuota de 10 ml de PBS hasta que se haya producido suficiente aclaramiento sanguíneo. El hígado tendrá una apariencia marrón claro y los pulmones pasarán de un color rosa rojizo a un color mayormente blanco.
  10. Usando fórceps y tijeras de disección fina, retire cuidadosamente todos los tejidos circundantes, incluidos el corazón, la tráquea, el esófago, el timo, el tejido conectivo, los ganglios linfáticos y los bronquios grandes.
  11. Separe los lóbulos pulmonares individuales y coloque los lóbulos en una placa de Petri sobre hielo que contenga una alícuota de 1-2 ml de medio de células pulmonares frías.

4. Homogeneización del tejido pulmonar para matrices de perlas multiplex utilizando homogeneizador de perlas

  1. Preenfríe un tubo de tapón de rosca cónico de 2 ml que contenga 3 perlas estériles de zirconia/sílice de 2,3 mm. Añadir 200 μL de tampón de homogeneización en frío al tubo.
  2. Pesar el lóbulo, transferir el lóbulo al tubo cónico preenfriado que contiene las perlas y el tampón de homogeneización.
    NOTA: Aproximadamente 50-100 mg de tejido homogeneizado en 200 μL de tampón serán suficientes para detectar la expresión de citoquinas y quimiocinas en la muestra.
    1. Homogeneice el lóbulo usando un homogeneizador a base de cuentas (consulte la Tabla de materiales) a 4,000 rpm durante 2 min.
    2. Asegúrese de que el tejido esté completamente homogeneizado. Aumente el tiempo si es necesario.
  3. Después de la homogeneización, centrifugar el tubo en una microcentrífuga preenfriada (4 °C) a 15.870 x g durante 3 min.
  4. Transfiera los sobrenadantes a un microtubo preenfriado de 1,5 ml.
  5. Coloque la muestra directamente sobre hielo para su uso inmediato o guárdela a -80 °C para usarla en el futuro. Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación.

5. Disociación del tejido pulmonar y aislamiento unicelular

  1. Vierta el medio de células pulmonares de los lóbulos pulmonares restantes para evitar la dilución del tampón de disociación. Luego, inserte cuidadosamente una jeringa de 1 ml con 25G y una aguja de 5/8 que contenga 1 ml del tampón de disociación en el tejido pulmonar.
  2. Inyecte pequeñas fracciones (aproximadamente 1/4a 1/5ª) del tampón de disociación en cada lóbulo pulmonar e infle suavemente.
    NOTA: La mayor parte del búfer se precipitará poco después de inflarse ya que el lóbulo ha sido extirpado.
  3. Repita la inyección del tampón de disociación 1-2x.
  4. Incubar los lóbulos pulmonares con tampón de disociación durante 2 min a temperatura ambiente.
  5. Picar finamente los lóbulos pulmonares en trozos pequeños con tijeras de disección fina.
  6. Transfiera las piezas pulmonares picadas con el tampón de disociación a un tubo centrífugo de 15 ml.  Suplemento con tampón de disociación adicional hasta un total de 6 mL. Vórtice vigorosamente durante 1 min.
  7. Incubar la muestra durante 45 min a 37 °C. Vórtice vigorosamente cada 7-8 min.
  8. Después de 45 minutos de incubación, vortex la muestra vigorosamente durante 1 minuto para obtener resultados óptimos.
  9. Disocie aún más la muestra pasando a través de un filtro de células de 100 μm para eliminar el tejido conectivo e intersticial residual, no deseado.
  10. Centrifugar la muestra durante 10 min a 380 x g, desechar el sobrenadante.
  11. Agregue 5 ml de medio de células pulmonares frías a la muestra. Resuspender el pellet celular mediante un vórtice suave.
  12. Centrifugar la muestra durante 10 min a 380 x g, desechar el sobrenadante.
  13. Agregue 1 ml de medio de células pulmonares frías. Resuspender el pellet celular mediante un vórtice suave.
  14. Pasar a través de un filtro de células de 100 μm y contar células.

6. Análisis citométrico de flujo para el nicho de células inmunes pulmonares

  1. Semilla 1-2 x 106 células/anticuerpo colocadas en una placa inferior redonda de 96 pocillos (3 juegos en total). Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
  2. Resuspender el pellet celular en 50 μL de PBS frío que contenga tinción viva/muerta reparable. Prepare la mancha de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Incubar las celdas a 4 °C durante 20 min protegidas de la luz. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
  4. Resuspender el pellet celular con 25 μL de tampón FACS frío que contenga 5 μg/ml de anticuerpo CD16/32 anti-ratón. Incubar a 4 °C durante 10-15 min.
  5. Añadir a las células 25 μL de tampón FACS frío que contenga las combinaciones de anticuerpos enumeradas en la Tabla 1 . Mezclar con un suave pipeteo.
    NOTA: El volumen total del tampón FACS para la tinción de anticuerpos es de 50 μL. Por lo tanto, cuando se prepara una mezcla maestra de anticuerpos en 25 μL, la concentración de anticuerpos debe ser el doble de la concentración final.
  6. Incubar las celdas a 4 °C durante 20 min protegidas de la luz. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
  7. Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
  8. Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Transfiera a un tubo FACS de fondo redondo de poliestireno de 5 ml que contenga 150 μL de tampón FAC adicional. Analice la muestra inmediatamente con un citómetro de flujo.
    NOTA: La fijación celular mediante los siguientes pasos permite analizar las muestras más adelante.
  9. Después del paso 6.7., resuspender la muestra con 100 μL de paraformaldehído al 1% en PBS.
  10. Incubar la muestra a 4 °C durante 15 min protegida de la luz. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
  11. Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Centrifugar las células durante 3 min a 830 x g. Deseche los sobrenadantes.
  12. Resuspender las células con 100 μL de tampón FACS frío. Conservar las células a 4 °C, protegidas de la luz. Analizar la muestra en un plazo de 72 h.

7. Conjuntos de perlas multiplex para la detección de citoquinas y quimiocinas

NOTA: Se utilizaron paneles multiplex de quimiocinas proinflamatorias e inflamación disponibles comercialmente (ver Tabla de materiales) para determinar la expresión de quimiocinas y citocinas en los pulmones después de la inducción de tMCAO de acuerdo con el protocolo del fabricante, que se ha descrito en detalle13.

  1. En resumen, descongelar los analitos en hielo si se almacenaron a -80 °C después de la homogeneización del tejido. Centrifugar la muestra a 590 x g durante 2 min a 4 °C antes de utilizarla para extraer cualquier tejido residual.
  2. Genere una curva estándar diluyendo en serie el cóctel estándar (C7) que está a una concentración conocida de 10 ng / ml en 7 patrones (C1-6) con el último estándar siendo solo el tampón de ensayo (C0).
  3. Una vez que todos los reactivos se hayan calentado a temperatura ambiente, agregue 25 μL de cada patrón y 25 μL de tampón de ensayo a una placa de pocillos de 96 en el fondo de V.
  4. A cada pocillo de muestra, agregue 25 μL de homogeneizado pulmonar (analito) y 25 μL de tampón de ensayo a una placa de pocillos de 96 en el fondo de V
  5. Vortex las perlas pre-recubiertas vigorosamente, luego agregue 25 μL de perlas pre-recubiertas a cada uno de los pocillos estándar y de muestra.
  6. Selle la placa y protéjala de la luz cubriéndola con papel de aluminio. Agitar la placa a 110 rpm durante 2 h a temperatura ambiente.
  7. Centrifugar a 230 x g durante 5 min. Añadir 200 μL de tampón de lavado a 1x (la solución madre es 20x, diluir a 1x con agua). Incubar durante 1 min.
  8. Centrifugar a 230 x g durante 5 min. Resuspender el patrón y muestrear con anticuerpos de detección de 25 μL.
  9. Selle y cubra la placa para protegerla de la luz. Agitar la placa a 110 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
  10. Agregue 25 μL de estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) a cada patrón y muestree bien.
  11. Selle y cubra la placa para protegerla de la luz. Agitar a 110 rpm durante 30 min a temperatura ambiente.
  12. Gire la placa a 230 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el estándar y las muestras en 1x tampón de lavado.
  13. Transfiera a un tubo FACS de fondo redondo de poliestireno bien etiquetado de 5 ml que contenga 150 μL adicionales de 1x tampón de lavado.
  14. Determine la intensidad de fluorescencia de la señal de PE para los patrones y las muestras utilizando un citómetro de flujo.
  15. Construya una curva estándar para cada quimiocina y citoquina utilizando la intensidad media de fluorescencia (MFI) de PE contra las concentraciones predeterminadas.
  16. Determine la concentración de cada quimiocina y citoquina utilizando la curva estándar y la IMF de cada muestra. El panel multiplex proporciona un software de análisis de datos que se puede utilizar para determinar la concentración de cada analito. El peso del lóbulo apical/superior se utiliza para determinar la concentración de citoquinas o quimiocinas por miligramo de tejido.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recientemente informamos que la inducción isquémica del accidente cerebrovascular en ratones altera la composición de las células inmunes de los pulmones11. Específicamente, la isquemia cerebral transitoria aumentó los porcentajes de macrófagos alveolares, neutrófilos y CD11b + DC, mientras que disminuyó los porcentajes de células T CD4 +, células T CD8 +, células B, células NK y eosinófilos en el compartimiento pulmonar. Además, la alteración celular correspondió a niveles significativamente dism...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los protocolos descritos aquí permiten la identificación de tipos de células inmunes pulmonares y la expresión de quimiocinas o citoquinas en el mismo ratón. Si se desea un estudio histopatológico, se puede extraer y fijar un lóbulo individual para ese propósito antes de proceder a los pasos de aislamiento de células individuales. Una limitación de este método es que este enfoque puede no ser adecuado en algunos entornos de enfermedad si se prevé que el cambio en la composición de las células inmunes y la expresión de qu...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la subvención P20 GM109098 de los NIH y el Programa de Premios a la Innovación de Praespero a Edwin Wan. Los experimentos de citometría de flujo se realizaron en la WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, que cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 y P20 GM103434.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
B220-APC, clon RA3-6B2Biolegend103212dilución 1:200
Beadbug Homogeneizador de perlas de 3 posicionesBenchmark ScientificD1030Homogeneizador de tejidos
CCR2-BV421, clon SA203G11Biolegend150605Dilución 1:200
CD103-BV421, clon 2E7Biolegend121422dilución 1:200
CD11b-PE/Cy7, clon M1/70Biolegend101216Dilución 1:400
CD11c-PE/Cy7, clon N418Biolegend117318Dilución 1:200
CD11c-Percp/Cy5.5, clon N418Biolegend117328Dilución 1:200
CD4-BV421, clon GK1.5Biolegend100443Dilución 1:200
CD45-FITC, clon 30-F11Biolegend103108dilución 1:200
CD64-APC, clon X54-5/7.1Biolegend139306dilución 1:200
CD8-PE, clon 53-6.7Biolegend100708dilución 1:800
Colagenasa DSigma Aldrich11088882001componente en el tampón de disociación
Tubo cónico con tapón de roscaThermoFisher02-681-344Tubo para homogeneización de tejidos
DNasa ISigma Aldrich10104159001Componente en el tampón de disociación
Fc bloque CD16/32 anticuerpoBiolegend101320Dilución 1:100
disociador genlteMACSMiltenyi Biotec130-093-235Comparación de la digestión pulmonar con o sin disociador mecánico
gentleMACS Tubos CMiltenyi Biotec130-093-237Tubo para la disociación de tejidos con disociador genlteMACS
Inhibidor de la proteasa y la fosfatasaThermoFisher78442Componente en el tampón de homogeneización
Monitor láser dopplerMoorMOORVMS-LDFMonitorización del flujo sanguíneo durante el
panel de quimiocinas proinflamatoriasBiolegend740451Multilegend Array de perlas
LIVE/DEAD fijable Tinción de infrarrojo cercano ThermoFisherL34976Uso para la exclusión de células muertas durante el análisis por citometría de flujo
Ly6C-PE, clon HK1.4Biolegend128008dilución 1:800
Ly6G-BV510, clon 1A8Biolegend127633dilución 1:200
Sutura MCAO L56 reutilizable 6-0 medioDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, clon M5/114.15.2Biolegend107636dilución
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, clon PK136Biolegend108728dilución 1:200
Siglec F-PE, clon E50-2440BD Biosciences 552126dilución 1:200
Hilo de sutura de seda, tamaño 6/0Fine Science Tools18020-60tMCAO
Sistema de anestesia SomnoSuiteKent ScientificSS-01Anestesia de ratón para tMCAO
TCRb-BV510, clon H57-897Biolegend109234:200 Dilución Perlas de
circonio/sílice, 2,3 mmBiospec11079125zPerlas para la homogeneización de tejidos
tMCAO LEGENDplex 1

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777(2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  4. Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
  6. McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051(2017).
  7. Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
  8. Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853(2019).
  9. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038(2012).
  11. Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440(2017).
  14. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  15. Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779(2019).
  16. Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757(2019).
  17. Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
  18. Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
  19. Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
  20. Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
  21. Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73(2017).
  22. Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
  23. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Immune Cell AnalysisFlow CytometryLung Homogenate PreparationMultiplex Bead ArrayCytokine Chemokine DetectionIschemic Stroke ModelMiddle Cerebral Artery OcclusionAlveolar MacrophagesInterstitial MacrophagesDendritic Cells

Artículos relacionados