Este protocolo de imágenes celulares de células bacterianas vivas permite visualizar las interacciones entre múltiples especies bacterianas a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten la observación de cada especie bacteriana en monocultivo o cocultura para interrogar las interacciones entre especies en comunidades bacterianas multiespecies, incluida la motilidad celular individual y la viabilidad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las comunidades polimicrobianas son omnipresentes en la naturaleza, pero estudiar sus interacciones a nivel de una sola célula es difícil. Por lo tanto, se ha desarrollado un método basado en microscopía para observar las interacciones entre especies entre dos patógenos bacterianos. El uso de este método para interrogar las interacciones entre un patógeno Gram-negativo móvil, Pseudomonas aeruginosa y un patógeno Gram-positivo no móvil, Staphylococcus aureus se muestra aquí. Este protocolo consiste en co-inocular cada especie entre un cubreobjetos y una almohadilla de agarosa, que mantiene las células en un solo plano y permite la visualización de comportamientos bacterianos tanto en el espacio como en el tiempo.
Además, la microscopía de lapso de tiempo que se ha demostrado aquí es ideal para visualizar las interacciones tempranas que tienen lugar entre dos o más especies bacterianas, incluidos los cambios en la motilidad de las especies bacterianas en el monocultivo y en el cocultivo con otras especies. Debido a la naturaleza del espacio limitado de la muestra en la configuración de la microscopía, este protocolo es menos aplicable para estudiar las interacciones posteriores entre las especies bacterianas una vez que las poblaciones celulares son demasiado altas. Sin embargo, hay varias aplicaciones diferentes del protocolo que incluyen el uso de tinción para imágenes de células bacterianas vivas y muertas, la cuantificación de la expresión génica o proteica a través de reporteros fluorescentes, y el seguimiento del movimiento celular bacteriano en experimentos de una sola especie y multiespecie.
Introducción
Las comunidades polimicrobianas son de naturaleza común, abarcando una variedad de ambientales1,,2,3 y nichos humanos4,5. Algunas de las infecciones polimicrobianas más notorias en enfermedades humanas incluyen biopelículas dentales6, heridas crónicas7,8, e infecciones respiratorias en individuos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica9, neumonía asociada al respirador10, y la enfermed....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Puede encontrar una descripción completa y números de catálogo para todos los suministros de este protocolo en la Tabla de materiales.
1. Preparación de medios mínimos M8T
- Preparar 1 L de base de sales mínimas M8 (5x) disolviendo 64 g de Na2HPO4a7H 2O, 15 g de KH2PO4y 2,5 g de NaCl en 800 ml de agua ultrapura (UPW, resistividad 18 M/cm) en una botella de 2 L. pH a 7,6. Volumen completo a 1 L con UPW. Autoclave durante 45 min.
- Preparar 500 ml de una solución de glucosa (20% p/v) disolviendo 100 g de glucosa en 400 ml de UPW en una botella de 1 L. Solución comple....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El uso correcto del método descrito dará lugar a una serie de fotogramas que generan un vídeo en el que las interacciones entre especies se pueden observar a lo largo del tiempo. El esquema de la Figura 1 proporciona un objeto visual para resaltar los pasos clave implicados en la preparación de materiales para la creación de imágenes. El uso de este método ha permitido la demostración de células P. aeruginosa exhibiendo diferentes comportamientos en monocultivo versus en cocultura c.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los métodos presentados aquí describen un protocolo para la toma de imágenes de células vivas de interacciones de especies bacterianas a nivel de una sola célula con modificaciones para otras aplicaciones, incluido el seguimiento celular y la supervisión de la viabilidad celular. Este método abre nuevas vías para estudiar los comportamientos unicelulares de los microorganismos en la cocultura con otras especies a lo largo del tiempo. Específicamente, el protocolo demuestra la utilidad de este método de cocultura en la ob.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la financiación del Premio de Transición Postdoc-to-Faculty de la Fundación De la Cis fibrosis LIMOLI18F5 (DHL), el Premio de Reclutamiento de la Facultad Juvenil de la Fundación de Fibrosis Quística LIMOLI19R3 (DHL), y la Beca de Formación NIH T32 5T32HL007638-34 (ASP). Agradecemos a Jeffrey Meisner, Minsu Kim y Ethan Garner por compartir los protocolos iniciales y consejos para la creación de imágenes y la fabricación de almohadillas.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarose pads | |||
| 35 mm Plato con fondo de vidrio con Micropocillo de 20 mm #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Uno para moldes de almohadillas de agarosa, uno para experimento |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | Para hacer almohadillas de |
| agarosaEspátulas de fondo redondo | VWR | 82027-492 | |
| Espátulas cónicas redondas | VWR | 82027-530 | |
| Aisladores de silicona, Press-to-Seal, 1 pocillo, diámetro D 2,0 mm 20 mm, silicona/adhesivo | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | Para moldes de almohadillas de agarosa |
| Placas de Petri estériles, 85 mm | Kord-Valmark /vendido por RPI | 2900 | |
| Pinzas | VWR | 89259-944 | |
| M8T Medios mínimos | |||
| D (+) Glucosa | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | ||
| DF0123173 cámara Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | . 4,2 megapíxeles retroiluminado sCMOS, 11 μ píxel m, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, montura F. |
| Cubo de filtro GFP | Nikon | 96372 | Cubo de filtro |
| Cubo de filtro TxRed | Nikon | 96375 | Cubo |
| de filtro H201-NIKON-TI-S-ER | Incubadora Okolab | 77057447 | Stagetop |
| Nikon NIS-Elements AR con GA3 y seguimiento 2D y 3D | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software para el análisis de datos |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Modelo de | Microscopio |
| CFI Plan Apo ƛ Objetivo 20x (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objetivo |
| CFI Plan Apo ƛ Objetivo Ph3 DM de aceite 100x (1.45NA) | Objetivo MRD31905 Nikon | ||
| ThermoBox con sopladores calefactores incorporados | Carcasa Tokai Hit | TI2TB-E-BK | |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Autótrofo | |
| no mucoidePseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Cepa resistente a meticilina LAC sin plásmidos | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC Δ agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Mancha de viabilidad | |||
| Propidium Yoduro | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight&comercio; Kit de Viabilidad Bacteriana |
Referencias
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
- Cursino, L., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
