Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Resumen

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Resumen

El accidente cerebrovascular isquémico es una condición clínica caracterizada por hipoperfusión del tejido cerebral, que conduce a la privación de oxígeno y glucosa, y la consiguiente pérdida neuronal. Numerosas pruebas sugieren que la interacción entre las células gliales y neuronales ejerce efectos beneficiosos después de un evento isquémico. Por lo tanto, para explorar posibles mecanismos de protección, es importante desarrollar modelos que permitan estudiar las interacciones neurona-glia en un entorno isquémico. Aquí presentamos un enfoque sencillo para aislar astrocitos y neuronas de la corteza embrionaria de ratas, y que mediante el uso de medios de cultivo específicos, permite el establecimiento de cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos o cultivos de neurona-glia con alto rendimiento y reproducibilidad.

Para estudiar la conversación cruzada entre astrocitos y neuronas, proponemos un enfoque basado en un sistema de co-cultivo en el que las neuronas cultivadas en cubrelips se mantienen en contacto con una monocapa de astrocitos chapadas en placas multipocillos. Las dos culturas se mantienen separadas por pequeñas esferas de parafina. Este enfoque permite la manipulación independiente y la aplicación de tratamientos específicos a cada tipo de célula, lo que representa una ventaja en muchos estudios.

Para simular lo que ocurre durante un accidente cerebrovascular isquémico, los cultivos se someten a un protocolo de privación de oxígeno y glucosa. Este protocolo representa una herramienta útil para estudiar el papel de las interacciones neurona-glia en el accidente cerebrovascular isquémico.

Introducción

Según datos de la Organización Mundial de la Salud, alrededor de 5,5 millones de personas mueren cada año a causa del accidente cerebrovascular isquémico¹. Esta condición se caracteriza por la interrupción del flujo sanguíneo a una determinada región cerebral, lo que resulta en una pérdida reversible o irreversible en el suministro de oxígeno y nutrientes al tejido, que altera la función tisular y conduce a la disfunción mitocondrial, desregulación del calcio, excitotoxicidad glutamato, inflamación y pérdida celular^2,,3.

Aparte de las células vasculares, las ....

Protocolo

Todos los animales utilizados fueron criados en el Centro de Investigación Científica de la Salud CICS-UBI de acuerdo con los requisitos éticos nacionales para la investigación animal y con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para fines experimentales y otros fines científicos (Directiva 2010/63/UE).

1. Cultivo de la corteza primaria de la corteza de embriones de rata

1. Preparación de medios culturales
   1. Preparar el medio neurobasal (NBM) añadiendo los siguientes suplementos: 2% B27, 0,5 mM de glutamina, glutamato de 25 m y gentamicina de 120 g/ml. Homogeneizar, ajustar el pH a 7.2 y e....

Resultados

Para caracterizar los cultivos, la inmunocitoquímica para evaluar el número de células que expresaron GFAP o MAP2, se realizaron marcadores ampliamente utilizados de astrocitos y neuronas (Figura 2), en cada tipo de cultivo cortical. Este análisis reveló que los cultivos enriquecidos con astrocitos presentaban el 97% de las células que expresaban GFAP (Figura 2A). En cuanto al cultivo enriquecido con neuronas, el 78% de las células expresaron MAP2, el 4% de las .......

Discusión

El método aquí descrito consiste en el aislamiento de astrocitos y neuronas del tejido cortical embrionario de rata, permitiendo el establecimiento de cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos o cultivos de neurona-glia. Fue adaptado de un estudio previo de nuestro grupo^5,donde se describió el aislamiento de las neuronas corticales-glia y los cultivos embrionarios enriquecidos con neuronas y se caracterizaron los dos cultivos. Usando estas culturas, Roque et al. encontraron que los astrocito.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo de 24 pocillos	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 cilindro de gas	ArLí quido
Anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	dilución 1/1000; período de incubación - 1 h a temperatura ambiente
Anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	dilución 1/1000; período de incubación - 1 h a temperatura ambiente
suplemento B27 (50x)	Gibco	17504-044
Dako Fluorescencia Medio de montaje	Dako	S3023
D-glucosa anhidra	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
Microscopio de epifluorescencia	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x objetivo
Suero fetal bovino (FBS)	Biochrom	S0615	10%
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272	120 µ g/mL
glutamato	Sigma-Aldrich	G8415	25µ M
Glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µ M; Período de incubación: 10 min a temperatura ambiente
Cámara de incubación de hipoxia	Stemcell Technologies	27310	Cámara utilizada para la inducción de OGD
Insulina de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
Ketamina	Sigma-Aldrich	K-002	87.5 mg/Kg
Mínimo Medio Esencial Eagle medio	Sigma-Aldrich	M0268	calentamiento hasta 37 ° C antes
de usar Mouse Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	dilución 1/500; período de incubación durante la noche a 4 & grados; C
Medio neurobasal	Gibco	21103-049	calentamiento hasta 37 ° C antes
de usar Pastillas de parafina para histología	Sigma-Aldrich	1.07164	Punto de solidificación 56-58° C
Paraformaldehído	Sigma -Aldrich	P6148	4% en PBS
Penicilina/Estreptomicina	Biochrom	A 2213	penicilina (12U/mL) /estreptomicina (12µ g/mL)
Poly-D-lisina	Sigma-Aldrich	P1024
Conejo Anti-GFAP	DAKO	Z0334	dilución 1/2000; período de incubación durante la noche a 4 & grados; C
Hidrogenocarbonato de sodio	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2g/L
Xilacina	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg

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