Artículo de método

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/61388

⸱

14 de noviembre de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Resumen

El accidente cerebrovascular isquémico es una condición clínica caracterizada por hipoperfusión del tejido cerebral, que conduce a la privación de oxígeno y glucosa, y la consiguiente pérdida neuronal. Numerosas pruebas sugieren que la interacción entre las células gliales y neuronales ejerce efectos beneficiosos después de un evento isquémico. Por lo tanto, para explorar posibles mecanismos de protección, es importante desarrollar modelos que permitan estudiar las interacciones neurona-glia en un entorno isquémico. Aquí presentamos un enfoque sencillo para aislar astrocitos y neuronas de la corteza embrionaria de ratas, y que mediante el uso de medios de cultivo específicos, permite el establecimiento de cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos o cultivos de neurona-glia con alto rendimiento y reproducibilidad.

Para estudiar la conversación cruzada entre astrocitos y neuronas, proponemos un enfoque basado en un sistema de co-cultivo en el que las neuronas cultivadas en cubrelips se mantienen en contacto con una monocapa de astrocitos chapadas en placas multipocillos. Las dos culturas se mantienen separadas por pequeñas esferas de parafina. Este enfoque permite la manipulación independiente y la aplicación de tratamientos específicos a cada tipo de célula, lo que representa una ventaja en muchos estudios.

Para simular lo que ocurre durante un accidente cerebrovascular isquémico, los cultivos se someten a un protocolo de privación de oxígeno y glucosa. Este protocolo representa una herramienta útil para estudiar el papel de las interacciones neurona-glia en el accidente cerebrovascular isquémico.

Introducción

Según datos de la Organización Mundial de la Salud, alrededor de 5,5 millones de personas mueren cada año a causa del accidente cerebrovascular isquémico1. Esta condición se caracteriza por la interrupción del flujo sanguíneo a una determinada región cerebral, lo que resulta en una pérdida reversible o irreversible en el suministro de oxígeno y nutrientes al tejido, que altera la función tisular y conduce a la disfunción mitocondrial, desregulación del calcio, excitotoxicidad glutamato, inflamación y pérdida celular2,,3.

Aparte de las células vasculares, las células neuronales y gliales están involucradas en la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico4. En particular, los astrocitos son esenciales para el mantenimiento de las neuronas y recientemente se demostró que desempeñan un papel crítico en la respuesta a la lesión isquémica5. Este tipo de célula glial realiza funciones de soporte estructural, defensa contra el estrés oxidativo, síntesis de neurotransmisores, estabilización de la comunicación célula-célula, entre otros6. Junto con las neuronas, los astrocitos juegan un papel directo en la transmisión sináptica, regulando la liberación de moléculas como el trifosfato de adenosina, el ácido gamma-aminobutírico y el glutamato7. Parte de la lesión inducida por la isquemia es causada por la liberación excesiva de glutamato y su acumulación en la hendidura sináptica, lo que conduce a la desactivación excesiva de los receptores de N-metil-D-aspartato, activando cascadas de señalización aguas abajo, resultando en última instancia en excitotoxicidad8. Dado que los astrocitos son capaces de eliminar el glutamato de la hendidura sináptica y convertirlo en glutamina, son cruciales en la defensa contra la excitotoxicidad, ejerciendo así un efecto neuroprotector sobre la isquemia. Estas células también juegan un papel en la neuroinflamación inducida por isquemia. Después del insulto isquémico, los astrocitos activados sufren cambios morfológicos (hipertrofia), proliferan y muestran un aumento en la expresión de la proteína ácida fibribrinaria glial (GFAP). Pueden volverse reactivas (astrogliosis), liberando citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral-α, interleucina-1 e interleucina-1o, y produciendo radicales libres, incluyendo óxido nítrico y superóxido, que a su vez pueden inducir la muerte neuronal9,,10. Por el contrario, los astrocitos reactivos también pueden reproducir un efecto neuroprotector, ya que liberan citoquinas antiinflamatorias, como la transformación del factor de crecimiento β, que se regula al al al ras detrás del accidentecerebrovascular 11. Además, pueden generar una cicatriz glial, que puede limitar la regeneración tisular mediante la inhibición de la brotación axonal; sin embargo, esta cicatriz glial puede aislar el sitio de la lesión del tejido viable, evitando así una onda en cascada de daño tisular incontrolado12,13.

Por lo tanto, es imperativo establecer modelos que permitan estudiar las interacciones de la neurona-glia bajo una lesión isquémica con el fin de encontrar estrategias terapéuticas que limiten o reviertan los efectos de la lesión isquémica. En comparación con otros modelos utilizados para estudiar lesiones isquémicas, a saber, los modelos in vivo 14,15,16, cultivos organotípicos17,18,19 y rebanadas cerebrales agudas20,21,22, cultivos de células primarias son menos complejos, lo que hace posible el estudio de las contribuciones individuales de cada tipo de célula en la fisiopatología de los accidentes cerebrovasculares isquémicos y cómo cada tipo de célula responde posible a las metas terapéuticas posibles. Típicamente, con el fin de estudiar las interacciones entre cultivos enriquecidos con neuronas y cultivos enriquecidos con astrocitos, las neuronas y células gliales de origen posnatal se utilizan23,,24, o células gliales postnatales y neuronas embrionarias25,,26. Aquí se propone un enfoque simple para establecer cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos y cultivos de neurona-glia del mismo tejido. Estas células primarias se obtienen de corteza embrionaria de rata, una región frecuentemente afectada por el accidente cerebrovascular27,,28. Además, la disociación del tejido se realiza sólo mediante un procedimiento mecánico. Por lo tanto, este protocolo permite aislar las células en la misma etapa de desarrollo, de una manera rápida y económica, y con alto rendimiento y reproducibilidad.

La conversación cruzada entre astrocitos y neuronas se puede explorar utilizando un sistema de co-cultivo en el que las neuronas cultivadas en cubreobjetos se mantienen en contacto con una monocapa de astrocitos sembrados en placas multipocillos. Se pueden utilizar pequeñas esferas de parafina para garantizar la separación de los dos cultivos celulares. Este enfoque permite la manipulación independiente de cada tipo de celda antes de que se entren en contacto. Por ejemplo, es posible silenciar un gen específico en los astrocitos y ver cómo puede influir en la vulnerabilidad neuronal o la protección contra el daño inducido por isquémica. Un método establecido para inducir condiciones isquémicas in vitro es la privación de oxígeno y glucosa (OGD)3, que consiste en reemplazar la atmósfera regular (95% aire y 5% CO2)por una atmósfera anóxica (95% N2 y 5% CO2), asociada con la omisión de glucosa.

El método descrito es adecuado para estudiar las interacciones entre neuronas y astrocitos en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico, de una manera simple, rápida, reproducible y económica.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los animales utilizados fueron criados en el Centro de Investigación Científica de la Salud CICS-UBI de acuerdo con los requisitos éticos nacionales para la investigación animal y con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para fines experimentales y otros fines científicos (Directiva 2010/63/UE).

1. Cultivo de la corteza primaria de la corteza de embriones de rata

  1. Preparación de medios culturales
    1. Preparar el medio neurobasal (NBM) añadiendo los siguientes suplementos: 2% B27, 0,5 mM de glutamina, glutamato de 25 m y gentamicina de 120 g/ml. Homogeneizar, ajustar el pH a 7.2 y esterilizar el medio con un paso de filtración al vacío, utilizando un filtro de 0,22 m. Para el cultivo celular de la neurona-glia, complementar el medio de cultivo celular NBM con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (HI-FBS).
    2. Preparar el medio mínimo esencial de águila media (MEM) con los siguientes suplementos: carbonato de hidrógeno sódico 2,2 g/L, insulina del páncreas bovino 5 mg/L, D-glucosa anhidra 3,4 g/L, penicilina (12 U/ml) /estreptomicina (12 g/ml) y 10% HI-FBS. Homogeneizar, ajustar el pH a 7.2 y esterilizar el medio con un paso de filtración.
  2. Preparación de materiales y equipos
    1. Perfore la parte terminal de una punta de micropipeta de plástico de 1 ml de lado a lado, utilizando una aguja con un diámetro específico (0,5 mm para S; 0,6 mm para M; 0,8 mm para L) y selle la abertura de la punta utilizando una llama.
    2. Esterilice toda la cristalería. A lo largo de la disección, mantenga las herramientas utilizadas (por ejemplo, tijeras, pinzas, bisturí) sumergidas en 70% de etanol. Rocíe los materiales con 70% de etanol antes de introducirlos en la cámara de flujo laminar.
    3. Ajuste la temperatura del baño de agua a 37 oC y coloque el medio de cultivo celular en el baño de agua antes de iniciar el procedimiento.
      NOTA: Para ensayos de inmunocitoquímica, el recubrimiento de poli-D-lisina debe realizarse en placas multipocillos que contengan cubreobjetos.
  3. Cultivo de corteza embrionaria de rata
    1. Retirar los embriones de rata de una rata Wistar hembra con 15-16 días de gestación (el final del apareamiento, que debe durar 24 h, se considera el1o día del desarrollo embrionario). Para ello, anestesiar a la hembra con ketamina (87,5 mg/kg) y xilazina (12 mg/kg) y eliminar los embriones. Luego eutanasia la rata hembra por luxación cervical, siguiendo el protocolo estándar.
    2. Coloque los embriones en un tubo estéril de 50 ml, agregue la solución salina tampón de fosfato (PBS) hasta que cubra los embriones y llévenlos rápidamente a la sala de cultivo.
    3. Todavía dentro del saco de yema, coloque los embriones en un plato de Petri que contenga 25 ml de PBS frío. Con la ayuda de tijeras y pinzas, romper el saco de yema, quitar el embrión y transferirlo a otro plato de Petri que contenga también PBS frío. El PBS en el plato Petri debe ser suficiente para cubrir todo el embrión.
      NOTA: Tenga cuidado al abrir el saco de yema para evitar dañar el embrión. En 1.3.3 y 1.3.4 utilizamos platos Petri de 90 mm de diámetro colocados encima de paquetes de hielo cubiertos con papel absorbente para mantener el PBS a baja temperatura.
    4. Para la disección del embrión, transfiéralo a otro plato de Petri que contenga 30 ml de PBS frío. Coloque el embrión bajo un microscopio diseccionado e inmovilícese con una pinza. Hacer la incisión inicial paralela a la corteza, pasando desde la cavidad ocular hasta el final del hocico y tenga cuidado de no decapitar al animal.
    5. Retire cuidadosamente el cuero cabelludo y las meninges usando pinzas, con el fin de no dañar el tejido cerebral cortical. Haga la siguiente incisión para separar la corteza. Transfiera el tejido cortical a un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de PBS utilizando una pipeta Pasteur.
    6. Realizar la digestión mecánica del tejido cerebral cortical utilizando las puntas de plástico de 1 ml preparadas en 1.2.1. Triturar 10 veces con una pipeta regular y repetir el proceso utilizando pipetas con agujeros progresivamente más pequeños (L, M y S), hasta que los trozos se hayan desmoronado.
    7. Después de la digestión mecánica, centrifugar la suspensión a 400 x g durante 3 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento con el medio de cultivo celular apropiado previamente calentado a 37 oC.
    8. Determinar el número total de células presentes en la suspensión celular (densidad celular) utilizando una cámara Neubauer, hacer las diluciones apropiadas y placar las células. La densidad celular inicial se definió sobre la base de un estudio anterior5.
      1. Para un cultivo enriquecido con neuronas, utilice 0.21 x 106 células/cm2 como densidad celular inicial y mantenga las células en el medio de cultivo NBM sin HI-FBS.
      2. Para los cultivos de neurona-glia utilizar 0.14 x 106 células/cm2 como la densidad celular inicial y mantener las células en medio de cultivo NBM complementado con 10% HI-FBS.
      3. Para un cultivo enriquecido con astrocitos, utilice 0.26 x 106 células/cm2 como la densidad celular inicial y mantenga las células en MEM complementadas como se indicó anteriormente.
      4. Colocar las células en una incubadora a 37oC, 95% O2 y 5% CO2.
        NOTA: Para períodos de cultivo más largos, se debe añadir un antimitético como 27 m 5-fluoro-2o-desoxiuridina con uridina de 68 m para suprimir el crecimiento celular.

2. Sistema de co-cultura

  1. Preparación de materiales
    1. Calentar la parafina a 150oC en un bloque de calentamiento durante aproximadamente 7 min. Mantener a 150 oC hasta que finalice el procedimiento. A continuación, con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio estéril de 1 mm de diámetro, agregue una pequeña gota sobre los cubreobjetos esterilizados y recubiertos con PDL. Las esferas de parafina son irregulares, pero tienen aproximadamente 2 mm de diámetro. Las esferas permitirán separar las dos culturas por aproximadamente 1,25 mm.
    2. Como la parafina no es estéril, coloque el multipozo con las esferas de parafina bajo radiación ultravioleta durante 15 minutos.
    3. Para establecer el co-cultivo, transfiera el cubreobjetos con las esferas de parafina utilizando una pinza previamente sumergida en 70% de etanol durante 15 min.
  2. Cocultura
    1. Cuando los dos cultivos estén listos para usar (es decir, después de 7 días en cultivo en las condiciones mencionadas en el paso 1.3.8), transfiera las neuronas sembradas en los cubreobjetos con esferas de parafina a los pozos que contienen los astrocitos.
    2. 24 horas antes de que las dos culturas entren en contacto, cambie el medio de cultivo de las neuronas y astrocitos a NBM complementado, o no, con HI-FBS, dependiendo del propósito del experimento.
    3. Después de poner ambos tipos de células en contacto, espere 8-12 h antes de comenzar los diferentes estímulos y procedimientos.
      NOTA: La representación esquemática del sistema de codecultura se muestra en la Figura 1.

3. Privación de oxígeno y glucosa

  1. Preparación de Medios de Cultura
    1. Para los experimentos de OGD, utilice la Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hank. Preparar el medio HBSS con los siguientes reactivos: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4 . Homogeneizar y ajustar el pH a 7.2. Esterilice el medio por filtración.
      NOTA: Si procede, suplementar la solución HBSS con glucosa (HBSSglu+), añadiendo 5,56 mM de glucosa. Para cultivos sometidos a OGD no complementar el medio HBSS con glucosa (HBSSglu-).
  2. Procedimiento OGD
    1. 7 días después de la siembra de las células, retire el medio de cultivo y lave dos veces con HBSSglu-. Después del lavado agregue el medio de cultivo celular HBSSglu- y coloque el multipozo en la cámara de hipoxia.
    2. Selle la cámara de hipoxia y añada una mezcla de gas que contenga 95% N2/5% CO2 durante 4 min con un flujo de 20 L/min para eliminar el oxígeno presente en el interior de la cámara. Después de esto, detenga el flujo y coloque la cámara de hipoxia en una incubadora a 37 oC durante 4 h o 6 h, dependiendo de la extensión de la isquemia prevista.
    3. Después del período de OGD, sustituya el medio HBSSglu- por el medio de cultivo adecuado para los procedimientos restantes.
      NOTA: El experimento OGD tiene como objetivo simular las condiciones in vitro que sufren las células durante un evento isquémico, por lo que es importante certificar que se han eliminado todos los medios utilizados anteriormente.

4. Ensayo de inmunocitoquímica

NOTA: Realizar el ensayo de inmunocitoquímica como se describió anteriormente5.

  1. Brevemente, para caracterizar los diferentes cultivos corticales, incubar las células durante la noche a 4oC con conejo anti-GFAP (1:2000) y proteína asociada al ratón antimicrotúbulo 2 (MAP2; 1:500); y luego 1 h a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos secundarios: anti-conejo conjugado a Alexa Fluor 546 y anti-ratón conjugado a Alexa Fluor 488, ambos a 1:1000 dilución.
  2. Etiquete los núcleos celulares por incubación con 2 M de Hoechst 33342 durante 10 min a temperatura ambiente.
  3. Monte los cubreobjetos en el medio de montaje de fluorescencia y adquiera imágenes en un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 63x.

5. Análisis estadístico

  1. Expresar datos como porcentaje del número total de celdas o como porcentaje de control y presentarse como la media ± error estándar de la media (SEM) de al menos 3 experimentos independientes realizados en triplicado.
  2. Realice análisis estadísticos con software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), utilizando la prueba t del estudiante no con par. Los resultados se consideraron significativos cuando los valores de p < 0.05.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para caracterizar los cultivos, la inmunocitoquímica para evaluar el número de células que expresaron GFAP o MAP2, se realizaron marcadores ampliamente utilizados de astrocitos y neuronas (Figura 2), en cada tipo de cultivo cortical. Este análisis reveló que los cultivos enriquecidos con astrocitos presentaban el 97% de las células que expresaban GFAP (Figura 2A). En cuanto al cultivo enriquecido con neuronas, el 78% de las células expresaron MAP2, el 4% de las ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El método aquí descrito consiste en el aislamiento de astrocitos y neuronas del tejido cortical embrionario de rata, permitiendo el establecimiento de cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos o cultivos de neurona-glia. Fue adaptado de un estudio previo de nuestro grupo5,donde se describió el aislamiento de las neuronas corticales-glia y los cultivos embrionarios enriquecidos con neuronas y se caracterizaron los dos cultivos. Usando estas culturas, Roque et al. encontraron que los astrocito...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores reconocen el apoyo de financiación de la Fundación para la Ciencias y la Tecnología a través de los Proyectos UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 y la beca SFRH/BD/135936/2018 a JP, por ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" a través del proyecto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 y financiación a la Plataforma PPBI-Portugués de BioImaging a través del Proyecto POCI-01-0145-FEDER-022122.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo de 24 pocillosThermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 cilindro de gasArLí quido
Anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488InvitrogenA11001dilución 1/1000; período de incubación - 1 h a temperatura ambiente
Anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 546InvitrogenA11010dilución 1/1000; período de incubación - 1 h a temperatura ambiente
suplemento B27 (50x)Gibco17504-044
Dako Fluorescencia Medio de montajeDakoS3023
D-glucosa anhidraFisher ScientificG/0450/603.4 g/L
Microscopio de epifluorescenciaZeissAxioObserver Z1x63x objetivo
Suero fetal bovino (FBS)BiochromS061510%
GentamicinaSigma-AldrichG1272120 µ g/mL
glutamatoSigma-AldrichG841525µ M
GlutaminaSigma-AldrichG31260.5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 µ M; Período de incubación: 10 min a temperatura ambiente
Cámara de incubación de hipoxiaStemcell Technologies27310Cámara utilizada para la inducción de OGD
Insulina de páncreas bovinoSigma-AldrichI55005 mg/L
KetaminaSigma-AldrichK-00287.5 mg/Kg
Mínimo Medio Esencial Eagle medioSigma-AldrichM0268calentamiento hasta 37 ° C antes
de usar Mouse Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-74421dilución 1/500; período de incubación durante la noche a 4 & grados; C
Medio neurobasalGibco21103-049calentamiento hasta 37 ° C antes
de usar Pastillas de parafina para histologíaSigma-Aldrich1.07164Punto de solidificación 56-58° C
ParaformaldehídoSigma -AldrichP61484% en PBS
Penicilina/EstreptomicinaBiochromA 2213penicilina (12U/mL) /estreptomicina (12µ g/mL)
Poly-D-lisinaSigma-AldrichP1024
Conejo Anti-GFAPDAKOZ0334dilución 1/2000; período de incubación durante la noche a 4 & grados; C
Hidrogenocarbonato de sodioFisher ScientificS/4240/602.2g/L
XilacinaSigma-AldrichX112612 mg/Kg
de

Referencias

  1. Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165(2018).
  2. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
  3. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
  4. Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287(2012).
  5. Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
  6. Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
  7. Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
  8. Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
  9. Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
  10. Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
  11. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  12. Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
  13. Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
  14. Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
  15. Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
  16. Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156(2018).
  17. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
  18. Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
  19. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  20. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  21. Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
  22. Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
  23. Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
  24. Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
  25. Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
  26. Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74(2019).
  27. Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
  28. Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
  29. Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
  30. Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
  31. Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
  32. Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
  33. De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
  34. Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
  35. Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
  36. Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Modelo de accidente cerebrovascular isqu micoprivaci n de ox geno y glucosacocultivo de astrocitos y neuronascorteza embrionaria de ratacultivo celular primariosistema de esferas de parafinat cnica de aislamiento celularan lisis de inmunohistoqu micamicroscop a de fluorescencia

Artículos relacionados