La regulación intacta de la absorción de glucosa muscular es importante para mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo. Este protocolo presenta una evaluación de la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en el músculo esquelético maduro aislado e incubado al delinear el impacto de varias intervenciones fisiológicas en el metabolismo de la glucosa en todo el cuerpo.
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Artículo de método
Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
El músculo esquelético es un tejido sensible a la insulina y generalmente absorbe la mayor parte de la glucosa que ingresa a la sangre después de una comida. Además, se ha informado que el músculo esquelético puede aumentar la extracción de glucosa de la sangre hasta 50 veces durante el ejercicio en comparación con las condiciones de reposo. El aumento en la absorción de glucosa muscular durante el ejercicio y la estimulación de la insulina depende de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) de los compartimentos intracelulares a la membrana de la superficie de la célula muscular, así como de la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato por la hexoquinasa II. El aislamiento e incubación de músculos de ratón como m. soleus y m. extensor digitorum longus (EDL) es un modelo ex vivo apropiado para estudiar los efectos de la insulina y la contracción inducida eléctricamente (un modelo para el ejercicio) en la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro. Por lo tanto, el modelo ex vivo permite la evaluación de la sensibilidad a la insulina muscular y permite igualar la producción de fuerza muscular durante la contracción, asegurando un reclutamiento uniforme de las fibras musculares durante las mediciones de la absorción de glucosa muscular. Además, el modelo descrito es adecuado para pruebas farmacológicas de compuestos que pueden tener un impacto en la sensibilidad a la insulina muscular o pueden ser de ayuda cuando se trata de delinear la complejidad reguladora de la absorción de glucosa del músculo esquelético.
Aquí describimos y proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo medir la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en preparaciones musculares aisladas e incubadas de sóleo y EDL de ratones que utilizan [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol como marcador extracelular. Esto permite una evaluación precisa de la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro en ausencia de factores de confusión que puedan interferir en el modelo animal intacto. Además, proporcionamos información sobre la viabilidad metabólica del músculo esquelético de ratón incubado, lo que sugiere que el método aplicado posee algunas advertencias bajo ciertas condiciones al estudiar el metabolismo de la energía muscular.
Introducción
El músculo esquelético posee la capacidad de extraer grandes cantidades de glucosa del espacio extracelular en respuesta a la insulina y el ejercicio. Esto ayuda a mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo y asegura el suministro de glucosa durante los momentos de alta demanda de energía. Dado que se ha demostrado que la regulación intacta de la absorción de glucosa del músculo esquelético es importante para la salud general y el rendimiento físico 1,2, las mediciones de la absorción de glucosa muscular durante diversas afecciones han recibido mucha atención. En humanos y animales, la pinza hiperins....
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Protocolo
Los procedimientos en los que participen animales de investigación deben realizarse de conformidad con las directrices pertinentes y la legislación local. Todos los experimentos con animales utilizados para este estudio cumplieron con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para Fines Experimentales y otros Fines Científicos y fueron aprobados por la Inspección Danesa de Experimentación Animal.
1. Preparación del aparato experimental y de los bucles de sutura
NOTA: Para este estudio, utilice un sistema de miógrafo de tira muscular integrado con ganchos de incubación personaliza....
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Resultados
Como se muestra en la Figura 2, las tasas de absorción de glucosa basal fueron similares entre el sóleo aislado y el músculo EDL de ratones hembra. Esto también se ha reportado varias veces antesde 12,13,19,20. La absorción de glucosa aumentó en ~ 0.8 y ~ 0.6 veces alcanzando 12 y 9 μmol / g de proteína / h en el músculo sóleo y EDL.......
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Discusión
La regulación intacta de la absorción de glucosa en el músculo esquelético es importante para preservar la salud general1. Por lo tanto, la investigación de la absorción de glucosa muscular a menudo sirve como una lectura primaria al evaluar varias intervenciones que alteran la salud. Aquí describimos un método ex vivo para medir la absorción de glucosa en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones en respuesta a la insulina y las contracciones inducidas eléctricamente. El método es rápi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Danés para la Investigación Independiente - Ciencias Médicas (FSS8020-00288B) y la Fundación Novo Nordisk (NNF160C0023046). Este trabajo también fue apoyado por una beca de investigación a Rasmus Kjøbsted de la Academia Danesa de Diabetes, que está financiada por la Fundación Novo Nordisk, número de subvención NNF17SA0031406. Los autores desean agradecer a Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Departamento de Nutrición, Ejercicio y Deportes, Facultad de Ciencias, Universidad de Copenhague) por su hábil asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| [14C]D-manitol | Productos químicos radiomarcados americanos, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-desoxi-D-glucosa | Productos químicos radiomarcados de Estados Unidos, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Desoxi-D-glucosa | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP sutura quirúrgica de nailon no estéril | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Estreptavidina/HRP (conjugado) | DAKO | P0397 | Se utiliza para detectar el |
| anticuerpo Akt2 | Señalización celular | 3063 | |
| AMPKα 2 anticuerpo | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinina | Sigma | A1153 | |
| benzamidina | Sigma | B6505 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Kit de calibración (fuerza) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Quimioluminiscencia | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucosa | Merck | 1084180100 | |
| D-Manitol | Sigma | M4125 | |
| Programa de recolección de datos | LabVIEW de National Instruments versión 7.1 | ||
| Tubo de diálisis | Visking | DTV.12000.09 Tamaño No.9 | |
| Sistema de imagen digital | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Estimulador de impulsos eléctricos | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulina | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck 1049361000 | ||
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptina | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Sistema de miógrafo de tiras musculares | Danish Myo Technology A/S | Modelo 820MS | |
| Na-Ortovanadato | Sigma | S6508 | |
| Na-pirofosfato | Sigma | 221368 | |
| Na-piruvato | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 anticuerpo | Señalización celular | 3661 | |
| anticuerpo pAkt Thr308 | Señalización celular | 9275 | |
| pAMPK Thr172 anticuerpo | Señalización celular | 2531 | |
| fenilmetilsulfonililfluoruro | Sigma | P7626 | |
| Electrodos de platino | Danés Tecnología Myo A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 anticuerpo | Señalización celular | 8730 | |
| Contador de centelleo | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Fluido de centelleo | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Software de análisis estadístico | Systat | SigmaPlot versión 14 | |
| TBC1D4 anticuerpo | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Agua ultrapura | Merck | Milli-Q Referencia A+ System | |
| β-glicerofosfato | Sigma | G9422 |
Referencias
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feed....
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Reimpresiones y permisos
