Summary
Denne protokollen gjør det mulig å utarbeide tverrgående deler av kornfrø (f.eks. ris) for analyse av endosperm og stivelsesgranulatmorfologi ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.
Abstract
Stivelsesgranulat (SGs) viser forskjellige morfologier avhengig av plantearter, spesielt i endospermen til Poaceae-familien. Endosperm fenotyping kan brukes til å klassifisere genotyper basert på SG morphotype ved hjelp av skanning elektron mikroskopisk (SEM) analyse. SGs kan visualiseres ved hjelp av SEM ved å kutte gjennom kjernen (pericarp, aleurone lag, og endosperm) og utsette organellarinnholdet. Strømmetoder krever at riskjernen bygges inn i plastharpiks og seksjoneres ved hjelp av en mikrotom eller innebygd i en avkortet pipettespiss og seksjoneres for hånd ved hjelp av et barberblad. Den tidligere metoden krever spesialisert utstyr og er tidkrevende, mens sistnevnte introduserer en ny rekke problemer avhengig av risgenotype. Chalky ris varianter, spesielt, utgjør et problem for denne typen seksjonering på grunn av friable naturen av deres endosperm vev. Presentert her er en teknikk for å forberede gjennomsiktige og krittaktig riskjerne seksjoner for mikroskopi, som bare krever pipettespisser og et skalpellblad. Forberedelse av seksjonene innenfor rammene av en pipettespiss forhindrer riskjerne-endospermen i å knuse (for gjennomsiktige eller "glasslegeme" fenotyper) og smuldrer (for krittaktige fenotyper). Ved hjelp av denne teknikken kan endosperm cellemønster og strukturen av intakte SGs observeres.
Introduction
Stivelsesgranulat (SGs) viser forskjellige morfologier avhengig av plantearter, spesielt i endospermen til Poaceae-familien 1,2. Endosperm fenotyping kan brukes til å klassifisere genotyper basert på SG fenotype ved hjelp av skanning elektron mikroskopisk analyse. SGs kan visualiseres ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM) ved å kutte kjernen og lirke bort endospermcelleveggene2.
Formålet med denne teknikken er å enkelt forberede tverrgående riskjerneseksjoner utelukkende for den raske SEM-analysen. Utviklingen av denne teknikken var motivert av nødvendigheten av en rask tverrsnittstilnærming der prøver er forberedt på SEM-mikroskopi umiddelbart før visualisering ved hjelp av minimalt utstyr.
Denne teknikken innebærer innsetting av den huskede riskjernen i pipettespissen for fullstendig immobilisering. Dette er spesielt viktig når tverrsnitt av kritt riskjernefenotyper, som er sprø og lett smuldrer under trykk3. Chalkiness er en uønsket kvalitet i ris siden det påvirker utseendet til kjernen og får kjernen til å bryte lett under polering og fresing3. Chalkiness presenterer som et ugjennomsiktig område i et tverrsnitt av kjernen som kan observeres av det blotte øye; På mikroskopisk nivå er kalkhet preget av små, løst pakkede stivelsesgranulat. Årsaker til kritt kan være genetisk4,5 eller miljømessig6,7.
Kornfrø tverrsnitt har tradisjonelt blitt utarbeidet ved hjelp av kjemiske festemetoder og seksjonering etter prøveinnbygging i parafinvoks eller en annen solid matrise4,8,9,10. I 2010 ble Matsushima-metoden introdusert som en måte å unngå komplisert og tidkrevende riskjerneprøveforberedelse4. Denne metoden involverte innsetting av den huskede riskjernen i en avkortet pipettespiss. Spissen holdes stasjonær av en blokktrimmer, og tynne, delvise endosperm-seksjoner høstes ved hjelp av et håndholdt barberblad. En annen rask teknikk utviklet i 2016 tillot tynn hel seksjonering av et bredt utvalg av tørre frø, inkludert krittaktige varianter10. Disse metodene motiverte utviklingen av den raske teknikken som presenteres her.
Denne nye teknikken passer for forskere som ønsker å oppnå intakte tverrsnitt av riskjerner for endosperm fenotyping og stivelsesmorfologianalyse ved hjelp av SEM.
Denne protokollen representerer en tilpasning av Matsushima avkortet pipettespissmetode4, med flere bemerkelsesverdige modifikasjoner: (1) kjerner er ikke imbibed på noe tidspunkt i teknikken; (2) verken en blokktrimmer eller en ultramikrotomi er nødvendig for å forberede seksjonene. En vill type 'gjennomsiktig' cultivar (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) og en mutagenisert 'chalky' linje av Nipponbare (ssg1, substandard stivelse korn1)4 ble undersøkt i denne studien. Disse to kultivarer ble valgt ut til analysen her for å demonstrere de tekniske og visuelle forskjellene i behandling av gjennomsiktige og kalkaktige risseksjoner.
Protocol
1. Tilberedning av tverrgående risseksjon
- De-husk tørre, intakte kjerner som vist i figur 1A.
- Løsne huskene og dehull riskjernene ved å slipe kjernene mellom to flate gummipropper. Fjern de huskede riskjernene fra panikken, om nødvendig.
- Plasser en enkelt kjerne på en flat gummipropp på en arbeidsbenk (Figur 1B). Kontroller at denne proppen står stille.
- Bruk en ekstra flat gummipropp (figur 1C) til å slipe kjernen ved å vri den inn mot den første gummiproppen ved hjelp av tilstrekkelig trykk (Figur 1D). Fjern husk fra kjernen, pass på at du ikke knuser endospermen. Fjern eventuell gjenværende husk ved hjelp av fine tang. En avskallet kjerne vises i figur 1E.
- Bruk fine tang til å sette inn en enkeltskallet kjerne i en pipettespiss av plast (250 μL størrelse, ett frø/spiss) (Figur 1F). Påse at embryoenden av kjernen vender mot den (koniske) enden av pipettespissen (Figur 1G).
MERK: Hvis du setter inn kjernen på denne måten, sikrer du at kjernen passer så godt som mulig inn i pipettespissen, da kjernen er smalere mot den proksimale enden. - Sett inn en ekstra 250 μL pipettespiss for å tvinge kjernen inn i pipettespissen og for å holde kjernen immobil under seksjonering, pass på at du ikke skader kjernen eller bøyer den andre pipettespissen (Figur 1H). Riktig "teleskop"-montering er angitt i figur 1I.
- Legg pipettespissen flatt på en arbeidsbenk og hold den på plass for hånd (Figur 1J). Med den annen side bruker du et skarpt skalpellblad (nr. 20) til å skjære gjennom midten av kjernen og kutte enden av pipettespissen av (Figur 1K). Bruk skalpellen til å kutte 1 mm tykke deler av riskjernen (Figur 1L).
MERK: Kjernedelen er tett omsluttet av plast (Figur 1M). Gjennomsnittlig seksjonstykkelse for tre eksemplariske genotyper finnes i tabell 1. Seksjoner som er betydelig tynnere enn 1 mm, vil knuse eller smuldre. Det er viktig å merke seg hvilken del av kjernen hver seksjon stammer fra hvis dette eksperimentet utføres på flere varianter av ris til sammenligning, da stivelsesmorfologi varierer gjennom endosperm11.
2. Reflektert lysmikroskopi av tverrgående risseksjoner
- Bruk fine tang til å plassere tverrgående risseksjoner (fremstilt i avsnitt 1) på et svart stykke svart papir med tung måler.
- Få lette bilder av tverrgående deler av Nipponbare ved hjelp av et stereomikroskop med montert goosenecks for skrå belysning, som vist i figur 1N-S.
- Vær oppmerksom på endospermmorfologi under minst 10x forstørrelse.
MERK: Enhver epilyskilde er å foretrekke fremfor lysfeltmikroskopi, da seksjoner oppnådd ved hjelp av denne teknikken ikke er tynne nok til at lyset kan passere gjennom.
3. Skanning av elektronmikroskopi av tverrgående risseksjoner
- Plasser prøvene på en karbondisk som sitter fast på en aluminiumsstubb og plasser dem på en prøveholder for ladereduksjon. Fjern plastringen fra pipettespissbraketten ved hjelp av fine tang for å hindre at plasten kommer inn i vakuumapparatet til SEM.
MERK: Bilder av endospermceller, SGs og subgranules er hentet ved hjelp av en stasjonær SEM-maskin som ikke krever at prøver skal sputterbelagt. - Få bildene ved hjelp av en høysensitiv multi-modus backscatter elektron (BSE) detektor ved 10 kV.
Representative Results
Wild type Nipponbare (Figur 2A) og ssg1 seksjoner (Figur 2B) ble undersøkt under tre forstørrelser: 260x, 920x og 4200x. Denne teknikken gjør det mulig å klargjøre deler av tilstrekkelig kvalitet for å observere hele endospermcellen (figur 3A), sammensatte stivelsesgranulat (figur 3B) og individuelle subgranules (figur 3C). Huskede kjerner tar lengre tid å behandle enn polerte kjerner, da de tørre skrogene må fjernes ved slitasje før seksjonering. Chalky kjerner tar også lengre tid å behandle enn polerte gjennomsiktige kjerner, da det må tas hensyn til ikke å knuse kjernen under seksjonering. En riktig forberedt risseksjon skal være ca. 0,9 mm tykk (Tabell 1) med minimal til ingen knusing av endospermen (figur 1N) og intakte perikarp- og aleuronlag (figur 1O). Feil plassering av skalpellen på pipettespissen når seksjonering kan føre til "flisede" seksjoner (figur 1P). På samme måte viste lyse feltbilder av optimale tverrgående deler av ssg1 (figur 1Q) intakt endosperm-, perikarp- og aleuronlag intakt og tilgjengelig for visualisering (figur 1R). En ødelagt kalkkjernedel (figur 1S) kan fortsatt brukes til visualisering hvis det eneste formålet er å observere SGs, men endospermcellemønsteret vil ikke være synlig. En ødelagt seksjon kan være vanskelig å håndtere for analyse. Mer skjæring av endospermcellevegger ble observert i vill type Nipponbare, da cellene er tettere pakket og mindre sprø enn ssg1-kjernene. Ingen skjæring av endospermceller ble observert i ssg1-seksjonene, og sammensatte stivelsesgranulat er intakte.
Figur S1 viser påliteligheten til resultatene ved hjelp av "teleskop"-teknikken for å seksjonere riskjerner. Rislinjer identifisert som gjennomskinnelige kjerneprodusenter - wild type Resistant Starch (RS) hybridlinje Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 ( FigurS1A) og koboltgenerert mutant RS11113,15 ( FigurS1B) produserte seksjoner gjennom hvilket lys var synlig ved hjelp av et stereoskop. De tilsvarende SEM-bildene viste at disse linjene produserer den "normale" ris endosperm fenotypen: tettpakkede, polyhedral stivelse granulat. Chalky kjerneprodusenter, kommersiell variasjon Yi-Tang16 (Figur S1C) og RS413, en mutant av RS11115 (Figur S1D), utstilte hvite, ugjennomsiktige kjernedeler. De tilsvarende SEM-bildene viste markant forskjellig morfologi sammenlignet med den ville typen gjennomskinnelig RS-bakgrunnslinje: stivelsesgranulat var runde og løst pakket. Wild type Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Figur S1E) og dens mutant, KMD1 (Kemingdao1), som uttrykker Cry1Ab-genet for å hemme insektpredasjon17,18,19 ( FigurS1F) utstilte seksjoner og endosperm morfotyper som ligner på de gjennomsiktige RS-linjene.
Teknikken som presenteres her er optimal for å forberede prøver av kalkaktige riskjerner for fenotypisk analyse, men gir også fordeler for seksjonering av gjennomsiktige riskjernefenotyper20: kutting av prøvene ved hjelp av trykk ovenfra reduserer risikoen for å knuse endospermen og dislokasjonen. Prøver kan enkelt tilberedes i løpet av sekunder (Tabell 2). Flere genotyper ble analysert ved hjelp av denne teknikken for å teste effekten (tabell 3). Som vist i Figur S2, kan denne teknikken brukes på frø av andre arter. Modellen monocot Brachypodium distachyon produserer svært harde frø som bare inneholder B-granulat stivelse21, som mangler puroindoline A, et protein som gir mykhet til stivelsesgranulat22. Det var fortsatt mulig å få en intakt tverrgående seksjon (Figur S2A). Det var utfordrende å få en intakt tverrsnitt fra myk hvit vinterhvete (SWWW), men kan utføres (Figur S2B). SWWW frø er høye i puroindoline A og store sammenlignet med B. distachyon frø og riskjerner. Disse frøene smuldrer ofte når de seksjonerer ved hjelp av teleskopmonteringen.
| Genotype | Gjennomsnittlig seksjonsbredde (μm) ved hjelp av teleskopmontering | Gjennomsnittlig inndelingsbredde (μm) som deler frihånd |
| Nipponbare (husket) | 971.7 ± 152.4ab | 1059.571 ± 394.2ab |
| Xieyou 7954 | 825,1 ± 128,3b | 1306.187 ± 179.1a |
| RS4 | 910.6 ± 165.0ab | 1126.694 ± 395.3ab |
| Midler etterfulgt av de samme bokstavene er ikke signifikant forskjellige ved P < 0,01 ved hjelp av en enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) og Tukeys test (n = 10). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av JMP 15 programvare. | ||
Tabell 1: Gjennomsnittlig tykkelse på kjernedelen.
| Genotype | Gjennomsnittstid(er)* |
| Nipponbare (husket) | 14.7 ± 1,36a |
| Xieyou 7954 | 9,81 ± 0,98b |
| RS4 | 11.9 ± 1.28c |
| *Bruke teleskopmonteringen. | |
| Midler etterfulgt av de samme bokstavene er ikke signifikant forskjellige ved P < 0,01 ved hjelp av en enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) og Tukeys test (n = 10). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av JMP 15 programvare. | |
Tabell 2: Gjennomsnittlig prøveforberedelsestid.
| Genotype | Bakgrunn | Kvalitet |
| Nipponbare | Vill type | Gjennomskinnelig |
| Substandard stivelse korn1 (ssg1) | Nipponbare | Chalky |
| Motstandsdyktig stivelse (RS) Xieyou 7954 | Vill type | Gjennomskinnelig |
| RS111 | Xieyou 7954 | Gjennomskinnelig |
| RS4 | RS111 | Chalky |
| Yi-Tang, 'Nytt liv', Lujuren merkevare | Xieyou 7954 | Chalky |
| Xiushui 11 | Vill type | Gjennomskinnelig |
| Kemingdao1 (KMD1) | Xiushui 11 | Gjennomskinnelig |
Tabell 3: Risgenotyper undersøkt i denne studien.
Figur 1: Tilberedning av tverrgående risseksjoner. (A) Wild type Nipponbare kjerne med intakt husk. (B). Kjernen er plassert på en flat gummipropp med fire tommer diameter. (C) Husks ble fjernet ved å slipe kjernen mellom to apposing gummipropper. Husker skilt fra riskjernen. (E) Nærbilde avskallet riskjerne. Embryoende er indikert. (F) Innsetting av kjernen i pipettespissen ved hjelp av fine tang. (G) Kjernen ble satt inn i den distale enden av pipettespissen. (H) Innsetting av den andre pipettespissen for å immobilisere kjernen for seksjonering ('teleskop'-monteringen). (I) Riskjernen ble montert godt inn i den distale enden av pipettespissen. (J) Seksjonering av riskjernen i monteringen. (K) Nærbilde av seksjonskuttet. (L) En del av kjernen vedlagt av plasten annulus. (M) Nærbilde av tverrsnittet. (N) Tverrgående del av wild type Nipponbare. (O) Nærbilde av endospermen i den ville nipponbare delen. (P) Dårlig, suboptimal del av wild type Nipponbare kjerne. (Q) Tverrgående del av Nipponbare mutant ssg14. (R) Nærbilde av endospermen i ssg1-delen. (S) Dårlig, suboptimal del av ssg1. Stolpe (panelA , N-S) = 1 mm. Hele riskjernen og seksjonene ble avbildet ved hjelp av et stereomikroskop med et digitalt zoomkamera og gooseneck-lys. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SEM-bilder av tverrgående kjernedeler. (A) Wild type Nipponbare, en gjennomskinnelig kultivar. De sammensatte stivelsesgranulatene ble sementert tett til hverandre; (B) Nipponbare mutant ssg14, en krittaktig fenotype. De sammensatte stivelsesgranulatene var løst pakket og mangler sementert natur av vill type Nipponbare stivelse morphotype. Forstørrelse fra venstre mot høyre: 260x, 920x og 4200x. Stanglengden er angitt i paneler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: SEM mikroskopisk anatomi av en tverrgående kjernedel av Xiushui 11. (A) En enkelt endospermcelle er omrisset av rødt. 260x forstørrelse. (B) En sammensatt stivelsesgranulat er skissert i rødt. 920x forstørrelse. (C) Flere stivelsesundergranuler er omrisset av rødt. 2250x forstørrelse. Stanglengder er angitt i panelene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1: Tverrgående deler av andre risgenotyper som er klargjort for SEM ved hjelp av denne teknikken. (A) Motstandsdyktig Stivelse (RS) Xieyou 795412. (B) RS111, en gjennomsiktig mutant med høy RS på 795413. (C) RS4, en kalkaktig mutant på RS11115. (D) Yi-Tang, et kommersielt utvalg av høy amylose ris16. (E) Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. 10x forstørrelse for bilder med lyse felt. Hvit stolpe = 1 mm. 2250x forstørrelse for SEM-bilder. Stanglengder er angitt i panelene. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Figur S2: Teknikken er nyttig for andre frø. (A) Tverrgående del av falsk lilla brom (Brachypodium distachyon L. tiltredelse Bd21) frø. (B) Tverrgående del av myk hvit vinterhvete (Triticum aestivum L. cv. Augusta) frø. Lyst felt, 20x forstørrelse. Bar = 1 mm. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Discussion
Teknikken som presenteres her representerer en rask, enkel og ivrig tilnærming til å forberede tverrgående ris tverrsnitt for desktop SEM-visualisering. Denne seksjoneringsteknikken muliggjør rask observasjon av endospermstruktur, endospermcelleform, størrelse og mønster, sammensatte granulater og stivelsesmorfologi. For endosperm fenotyping og bakterieplasma screening, er det viktig å oppnå et helt tverrsnitt av riskjernen4,23,24. Det er viktig å sette kjernen helt inn i pipettespissen for å forhindre at trykket på skalpellbladet tvinger endospermen til å smuldre eller knuse. Forutsatt at "teleskop" -monteringen er riktig konstruert, kan prøver klargjøres for visualisering innen 15 sekunder (tabell 2) ved hjelp av materialer som allerede er i hånden i en typisk laboratorieinnstilling. Denne teknikken gjelder for tverrsnitt av ethvert ellipformet frø omtrent fire millimeter i diameter på det bredeste punktet. Frø av modellgresset Brachypodium distachyon (Figur S2A) kan også deles, men forblir ikke omsluttet av annulus. Større frø, som hvete, brudd lett og krever forsiktighet ved seksjonering (Figur S2B).
Det er imidlertid flere begrensninger i teknikken som presenteres her. Seksjoner oppnådd ved hjelp av denne teknikken er ikke tynne nok til at lyset kan passere gjennom, noe som forbyr bruk av denne teknikken for overførte lysbaserte mikroskopiske tilnærminger som lyst felt (500 μm maksimal prøvetykkelse for riskjerneseksjoner25) og overføringselektronmikroskopi (TEM) (500 nm maksimal prøvetykkelse26) ). Bruken av en pipettespiss som seksjoneringsmatrise begrenser også størrelsen på frø som kan deles ved hjelp av denne teknikken. Ytterligere feilsøking vil være nødvendig for å tilpasse denne teknikken for arter som er svært forskjellige fra ris, og størrelsen på "matrisen" er begrenset av størrelsen på pipettespissene som er tilgjengelige for kjøp.
En annen tydelig fordel som denne teknikken gir er kvaliteten på prøver som kan produseres fra krittaktig fenotype riskjerner. Det er verdt å merke seg at selv Matsushima-studien innrømmet at det var vanskelig å få tverrsnitt ved hjelp av den spesielle metoden for krittaktige fenotyper4, som replikert i denne studien med det formål å sammenligne (Figur 1S). I deres tilfelle ble det nødvendig å kjemisk fikse sine kalkaktige risprøver og legge dem inn i harpiks for seksjonering. Den nye teknikken, sammen med desktop SEM-avbildning, gjør at forskeren enkelt kan tilberede tverrgående deler av riskjerner for mikroskopi med mer konsistens enn uten immobiliseringsstøtte (Tabell 3).
I den nye epoken med fenomener og metabolomikk er det viktig å overvåke mutageniserte linjer og transposonmerkede biblioteker for bedre å forstå funksjonen og betydningen av stivelse i frø. I tillegg har International Rice Genebank over 130 000 ristilganger27. En rask frø fenotyping teknikk som den som presenteres her ville fremskynde klassifisering og prøvetaking for ernæringsmessig kvalitet28. Til slutt kan denne teknikken være nyttig i lys av inngripende klimaendringer. Sesongmessig høytemperatur stress under kornfylling hadde allerede blitt identifisert som en viktig årsak til kritt6, men nyere studier har implisert stigende globale temperaturer i økende kalk av ris gir7,29. Slike fremskyndede endosperm fenotyping kan bidra til å gi et bredt landbruksbilde av effekten av økende globale temperaturer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige til Systems for Research (SFR Corp.) for bruk av deres Phenom ProX Desktop SEM-instrument, samt for teknisk assistanse levert av Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) og Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Fakultet for medisin, Universitetet i Ottawa). Finansieringen ble gitt av Low Carbon Innovation Fund (LCIF) fra regjeringen i Ontarios departement for økonomisk utvikling, jobbskaping og handel, og Proteins Easy Corp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
| Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
| Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
| Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
| SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
| Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
| Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
| Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |
References
- James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M.
- Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives. Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).
- Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants. Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).
- Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).
- Zhao, X., et al. Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments. Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).
- Nagato, K., Ebata, M. Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels. Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).
- Zhao, X., Fitzgerald, M. Climate change: implications for the yield of edible rice. PLoS One. 8 (6), 66218 (2013).
- Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein. LWT - Food Science and Technology. 115, 108436 (2019).
- Feiz, L., et al. Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content. Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).
- Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed. Plant Methods. 14 (1), 16 (2018).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954". Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).
- Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. Slow digestion properties of rice different in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).
- Zhou, H., et al. Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).
- Yang, C. Z., et al. Starch properties of mutant rice high in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).
- Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment. Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).
- Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).
- Liu, H., et al. Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip. Food Control. 107, 106775 (2020).
- Shu, Q., et al. Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species. Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).
- Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties. Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).
- Chen, G., et al. Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina. BMC Plant Biology. 14 (1), 198 (2014).
- Giroux, M. J., Morris, C. F. Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).
- Matsushima, R., Hisano, H. Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice. Scientific Reports. 9, 3745 (2019).
- Matsushima, R., et al. Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm. Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).
- Monjardino, P., et al. Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells. Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).
- Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. Sample preparation for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).
- International Rice Genebank. , Available from: www.irri.org (2018).
- Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties. Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).
- Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change. Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).
