Artículo de método

Entrega in vitro e in vivo de hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sistema de administración personalizado

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DOI:

10.3791/61413

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2 de julio de 2020

 ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Geisel School of Medicine, Dartmouth College

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la entrega precisa de la hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sofisticado sistema de entrega y monitoreo.

Resumen

La hipertermia se ha utilizado durante mucho tiempo en el tratamiento del cáncer. Las técnicas han variado desde la inserción intratumoral de barras de hierro calientes, hasta nanopartículas magnéticas dirigidas a anticuerpos tumorales administradas sistémicamente, a temperaturas de 39 ° C (nivel de fiebre) a 1.000 ° C (electrocauterio) y tiempos de tratamiento de segundos a horas. La relación temperatura-tiempo (dosis térmica) dicta el efecto con altas dosis térmicas que resultan en la ablación tisular y dosis térmicas más bajas que resultan en efectos subletales como aumento del flujo sanguíneo, acumulación de medicamentos y estimulación inmune. Una de las terapias médicas actuales más prometedoras es la hipertermia por nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica consiste en activar nanopartículas magnéticas, que pueden administrarse sistémica o intratumoralmente, con un campo magnético alterno no invasivo y no tóxico. El tamaño, la construcción y la asociación de las nanopartículas magnéticas y la frecuencia y la intensidad de campo del campo magnético son los principales determinantes del calentamiento. Hemos desarrollado instrumentación y técnicas sofisticadas para administrar hipertermia de nanopartículas magnéticas reproducibles en modelos de animales grandes y pequeños y células cultivadas. Este enfoque, que utiliza un monitoreo continuo de la temperatura en tiempo real en múltiples ubicaciones, permite la administración de dosis térmicas bien definidas al tejido o células diana (tumor) al tiempo que limita el calentamiento del tejido no objetivo. El control y monitoreo precisos de la temperatura, en múltiples sitios, y el uso del algoritmo estándar de la industria (minutos equivalentes acumulados a 43 ° C / CEM43), permite una determinación y cuantificación precisas de la dosis térmica. Nuestro sistema, que permite una amplia variedad de temperaturas, dosis térmicas y efectos biológicos, se desarrolló a través de una combinación de adquisiciones comerciales y desarrollos internos de ingeniería y biología. Este sistema ha sido optimizado de una manera que permite la rápida conversión entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo diseñar, desarrollar e implementar una técnica y un sistema efectivos para administrar hipertermia de terapia de nanopartículas magnéticas (mNP) reproducible y precisa.

Introducción

La hipertermia se ha utilizado históricamente en la terapia del cáncer, ya sea sola o en combinación con otros tratamientos. Aunque tiene una larga historia de uso, el método más ventajoso para administrar este tratamiento aún se está debatiendo y depende del sitio y la ubicación de la enfermedad. Los métodos para la administración de hipertermia incluyen microondas, radiofrecuencia, ultrasonido focalizado, láser y nanopartículas metálicas (como oro u óxido de hierro)1,2,3,4. Estos métodos de administración pueden conducir a un rango de temperaturas de tratamiento desde el nivel de fiebre hasta cientos de grados C. El efecto biológico de la hipertermia depende principalmente de las temperaturas utilizadas y de la duración del tratamiento5. Para este manuscrito y propósito, nos estamos centrando en la hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite cambios de temperatura enfocados, localizados, bien monitoreados y controlados, utilizando nanopartículas de óxido de hierro no tóxicas, aprobadas por la FDA.

Una trampa de otras modalidades de hipertermia es la falta de orientación celular precisa; La hipertermia no tiene una relación terapéutica inherentemente alta, por lo tanto, es necesaria una termometría cuidadosa y una focalización6. mNPH permite la inyección sistémica o intratumoral de mNPs, y el calor solo se genera donde se encuentran los mNPs, dirigiendo así el tratamiento directamente al tumor. mNPH puede ser eficaz cuando las nanopartículas magnéticas se encuentran dentro o fuera de la célula. Para la terapia del cáncer, la visión general de mNPH es que las nanopartículas magnéticas se inyectan (intratumoral o intravenosamente), luego se aplica un campo magnético alterno, lo que hace que los polos magnéticos de nanopartículas se realineen constantemente, lo que lleva a un calentamiento localizado de las células y tejidos asociados con las nanopartículas 7,8 . Al ajustar el volumen de nanopartículas y la frecuencia / fuerza del campo magnético alterno (AMF), es posible controlar cuidadosamente la temperatura generada dentro del tejido.

Este tratamiento funciona bien en tumores que están cerca de la superficie del cuerpo, ya que los tumores más profundos requieren una AMF más fuerte, por lo que el riesgo de calentamiento por corrientes de Foucault aumenta9. Existe evidencia de que la hipertermia se utiliza clínicamente como monoterapia, sin embargo, a menudo la hipertermia se combina con radioterapia o quimioterapia, lo que lleva a un efecto anticancerígeno más dirigido10,11,12. La evidencia clínica de hipertermia que funciona en combinación con radioterapia se revisa en una publicación anterior13. Nuestro laboratorio ha tratado con éxito una variedad de animales, desde ratones hasta cerdos y cánceres caninos espontáneos, utilizando el método mNPH12,14,15. Este protocolo está diseñado para aquellos interesados en investigar los efectos del tratamiento de la hipertermia localizada, ya sea solo o en combinación con otras terapias.

Uno de los factores más importantes en la hipertermia es poder medir y comprender, en tiempo real, la dosis térmica que se administra al tejido diana/tumoral. Una forma estándar de calcular y comparar la dosis es mediante la demostración de los minutos equivalentes acumulados de calentamiento a 43 °C; Este algoritmo permite la comparación de dosis independientes del sistema de administración, temperaturas máximas y mínimas (dentro de un rango específico) y parámetros de calentamiento / enfriamiento 5,16. El cálculo CEM funciona mejor para temperaturas entre 39-57 °C5. Por ejemplo, en algunos de los estudios que hemos realizado, hemos elegido una dosis térmica de CEM43 30 (es decir, 30 min a 43 °C). La elección de esta dosis nos permitió observar efectos inmunogenéticos seguros y efectivos in vitro, tanto solos como en combinación con una sola dosis de radiación17.

Con la hipertermia de nanopartículas magnéticas, hay varios factores que deben considerarse en la construcción de un sistema de administración apropiado. El diseño de la instrumentación incluye importantes factores de seguridad, como el uso de un enfriador para garantizar que el equipo de suministro de campo magnético permanezca frío incluso cuando se opera a alta potencia, y procedimientos a prueba de fallas que evitan que el sistema se encienda si no se han activado todos los sistemas de temperatura, evaluación de potencia y control. Además, hay factores biológicos importantes que deben considerarse tanto para situaciones in vivo como in vitro. Cuando se utilizan células cultivadas, es necesario tratar en medios de crecimiento y mantener a una temperatura viable constante para evitar cambios fisiológicos que podrían afectar los resultados. Para los tipos de nanopartículas individuales, es importante conocer la tasa de absorción específica (SAR) al calcular los parámetros de calentamiento basados en AMF. Del mismo modo, es importante conocer la concentración de mNP/Fe, en células y tejidos, que es necesaria para lograr el calentamiento deseado. Los métodos in vivo requieren aún más atención a los detalles, ya que el animal debe mantenerse bajo anestesia durante el tratamiento y la temperatura corporal central del animal debe mantenerse a un nivel normal durante todo el tratamiento. Permitir que la temperatura corporal del animal baje, como sucede bajo anestesia, puede afectar los resultados generales, con respecto a la dosis térmica del tejido que se está tratando.

En este manuscrito, discutimos los métodos utilizados para diseñar y construir un sistema versátil de hipertermia de nanopartículas magnéticas, así como los factores de uso importantes que deben considerarse. El sistema descrito permite la entrega robusta, consistente, biológicamente apropiada, segura y bien controlada de la hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, debe tenerse en cuenta que los estudios de mNPH que realizamos a menudo involucran otras terapias como radiación, quimioterapia e inmunoterapia. Para que estos resultados sean significativos, es importante determinar cómo el calor suministrado puede afectar la eficacia y/o seguridad-toxicidad de otras modalidades (o viceversa) y el bienestar del animal. Por esta razón y las situaciones dosimétricas y terapéuticas mencionadas anteriormente, es esencial prestar estricta atención a la precisión de la dosificación de hipertermia de nanopartículas magnéticas y las mediciones continuas del núcleo y la temperatura objetivo. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método y una descripción sencillos y consistentes para la administración de hipertermia de nanopartículas magnéticas segura y efectiva.

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Protocolo

El Programa de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College está acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (iAAALAC) y se adhiere a todas las pautas y regulaciones de UDSA y NIH (Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio). Todos los estudios in vivo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College (IACUC). El procedimiento de eutanasia se adhiere a las Directrices AVMA 2020 para la eutanasia de animales.

1. Instrumentación/diseño del sistema

  1. Diseñe una antena AMF personalizada (bobina) para que sea un circuito cerrado, eligiendo formas para crear el campo magnético deseado. Utilice fórmulas y características de inductancia de la elección del generador de energía para diseñar bobinas compatibles para generar el campo deseado. Utilice diferentes diseños para experimentos in vitro e in vivo.
  2. Asegúrese de que la inductancia de la antena AMF esté dentro del rango aceptable del generador de energía. Suma o resta condensadores para que coincida (sintonice) la antena con el generador de energía.
  3. Para experimentos in vitro, diseñe una bobina helicoidal de 14 vueltas, diámetro interior 2 cm y longitud 14 cm, que pueda contener tubos de 1,5 ml, lo que permite el tratamiento de múltiples muestras simultáneamente. Aísle la bobina con un polímero de vinilo y use un espaciador de poliestireno para separar la bobina de los tubos. Los detalles de las especificaciones de diseño y las consideraciones están presentes en el Archivo Suplementario 1.
  4. Para experimentos in vivo, adquiera una bobina helicoidal de cuerpo entero construida a medida de un fabricante con información de diseño patentada. Use tubos cuadrados de 8 mm (ya que crea un campo más uniforme dentro del orificio de la bobina) y un concentrador en el área de tratamiento objetivo. Haga que el concentrador tenga 5.0 cm de largo, con un total de 5 vueltas que resultan en un diámetro interno de 3.6 cm, un diámetro exterior de 5.2 cm, y tenga su ubicación en el área de tratamiento objetivo. Rodee la bobina con una carcasa de policarbonato.
  5. Utilice un generador AMF con potencia y frecuencia ajustables, con una potencia nominal de 10 kW o superior como fuente de alimentación. La inductancia hace coincidir la fuente de alimentación y las antenas/bobinas a un rango de 0,62 a 1,18 μHenries (μH), lo que permite frecuencias que oscilan entre 30-300 kHz. Enfriar el generador utilizando agua reciclada a través de una bomba de refuerzo centrífuga, presión regulada a 50 psi.
  6. Enfríe las bobinas con un enfriador de capacidad de enfriamiento de 5.6 toneladas que bombea un fluido de transferencia de calor a base de etilenglicol al 25% diluido con agua a través de la antena AMF. Ajuste la temperatura del enfriador de tal manera que la antena no caliente ni enfríe la muestra.
  7. Para la contención del animal, construya un soporte tubular que pueda suspenderse en el centro de la bobina con un espacio de aire de 0,5 cm entre el soporte y la superficie de la bobina. Conecte una bomba de aire acondicionado ajustable que haga circular aire a través de la carcasa alrededor de la bobina y configúrela para mantener una temperatura central normal del animal. Conecte la máquina de anestesia al soporte tubular del animal cerca de la cabeza del animal para garantizar la administración adecuada de la anestesia.
  8. Para la contención celular, cree un aparato que haga circular el agua de un baño de agua a través del espaciador donde se colocan los tubos. Ajuste la temperatura de este baño de agua de tal manera que los tubos estén rodeados de agua a 37 ° C.
  9. Use sondas de fibra óptica para monitorear las temperaturas dentro del tumor, el núcleo del animal y el entorno animal o para estudios in vitro, monitoreando la temperatura del pellet celular y el agua que rodea los tubos.
  10. Utilice nanopartículas magnéticas de óxido de hierro que tengan un tamaño de 100 nm para todos los experimentos.
    NOTA: La concentración y la tasa de absorción específica (SAR) son dos características que deben considerarse al elegir nanopartículas, ya que afectan directamente el posible calentamiento y la dosis térmica18.

2. Hipertermia in vitro

  1. Cultivo de células de melanoma murino B16F10 en medios RPMI con 10% FBS y 1% Pen/estreptococo. Placa 150, 000 células/pocillo en placas de 6 pocillos, con 2 mL de medio completo.
  2. Determinar el tratamiento apropiado para cada pocillo, es decir, células sin mNPs y sin AMF, células con mNPs y sin AMF, células sin mNPs y AMF, células con mNPs y AMF.
    NOTA: Además, asegúrese de que haya controles apropiados si combina hipertermia con otra terapia. AMF se realiza en un laboratorio de banco de investigación estándar adaptado con las capacidades de energía y refrigeración necesarias.
  3. 24 h después del enchapado, agregue mNP a los pozos apropiados según lo determinado en el paso anterior. Añadir mNPs a una concentración de 3 mg de hierro/ml. Asegúrese de que los mNP se distribuyan por todo el pozo, ya sea creando una solución de medios de stock / mNP (eliminando los medios antiguos, agregando esta solución) o agregando los mNP directamente y agitando suavemente las placas para una distribución homogénea.
  4. Comience el tratamiento, 48 h después de la adición de mNPs, cuando los pozos sean ~ 80% confluentes, eliminando los medios y lavando los pozos con medios frescos. Retire el medio.
  5. Agregue 0.5 ml de tripsina a cada estado que se esté tratando y agite suavemente. Use un microscopio para verificar que las células estén separadas.
  6. Agregue 1 ml de medio a cada pocillo para recolectar las células en tubos de 1.5 ml. Recoja todas las celdas del pozo (~1 x 106 celdas). Use un tubo separado claramente etiquetado para cada pozo.
  7. Girar los tubos a 60 x g durante 2-3 min para permitir que las células se granulen. Retener el pellet en el medio.
  8. Coloque tubos en el espaciador llenos de agua dentro de la bobina. Ajuste la temperatura del baño maría de modo que el medio y el pellet de la celda se mantengan a 37 °C. Controle la temperatura dentro del tubo y el baño de agua utilizando sondas de temperatura de fibra óptica separadas.
  9. Encienda el enfriador, verifique que el refrigerante fluya a través de la bobina. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el porcentaje de máximo al campo deseado. Opere la bobina solenoide de 14 vueltas, alimentada por un generador de 10 kW, a 165 kHz y 23,87 kA/m (300 Oe).
  10. Coloque una sonda de temperatura de fibra óptica separada en uno de los tubos. Tratar las células hasta la dosis térmica del protocolo previamente determinada. Un ejemplo es 30 min a 43 °C (CEM43 de 30).
  11. Resuspenda las células en el medio que está en sus tubos y vuelva a colocar en nuevas placas de 6 pocillos. Etiquete claramente las nuevas placas. El objetivo es volver a platear todas las células recolectadas (~1 x 106 celdas).
    NOTA: Se deben usar nuevas placas de 6 pocillos para garantizar que las células que se cultivan reciban tratamiento. Si se usan las placas viejas, todavía podría haber células en las placas que no fueron tripsinizadas con éxito.
  12. Si es necesario, para el siguiente procedimiento experimental, lisar las células para el análisis de expresión de ARN o proteínas.

3. Hipertermia in vivo

  1. Cultivo celular e inoculación
    1. Cultivo de células de melanoma murino B16F10 en medios RPMI con 10% FBS y 1% Pen/estreptococo. Use platos/platos que proporcionen suficientes células para la inoculación del número deseado de animales. Por ejemplo, las placas de 10, 100 mm, chapadas a 100, 000 células serán confluentes con suficientes células para 20 inyecciones de ratones dentro de las 48 h.
    2. Tripsinizar células y recolectar usando medios RPMI puros (sin FBS o pluma/estreptococo).
    3. Cuente las células y cree una solución para la concentración deseada de células, basada en el volumen de inoculación y el número de ratones.
    4. Anestesiar ratones hembra C57Bl/6 de 6 semanas de edad usando isoflurano vaporizado y oxígeno. Coloque a los animales en una caja de plexiglás con 5% de isoflurano y 95% de oxígeno hasta que sea inducido. Una vez inducido, retirar el animal y utilizar un cono facial al 2% de isoflurano para completar los pasos 3.1.5-3.1.7 y 3.3.3-3.3.6.
      NOTA: Para la anestesia durante el tratamiento, use una contención de anestesia incorporada. Siga los protocolos institucionales estándar para la anestesia en ratones. Antes de la experimentación con animales, asegúrese de la aprobación adecuada de IACUC. Después de la anestesia, devuelva al animal a la jaula y controle la recuperación para asegurarse de que no haya complicaciones.
    5. Compruebe la falta de respuesta a los reflejos de enderezamiento.
    6. Afeite el flanco derecho con una afeitadora eléctrica.
    7. Limpie el área de inyección con una toallita con alcohol. Inyectar 1-2 x 106 células, utilizando una jeringa de vidrio de 100 μL con una aguja de 28 G, dispersas en 50 μL de medios por vía intradérmica en el flanco derecho afeitado de los anestesiados.
  2. Crecimiento tumoral/inyección de nanopartículas
    1. Mida los tumores en 3 dimensiones usando calibradores (largo, ancho y profundidad) y calcule los volúmenes por (largo x ancho x profundidad x π)/6.
    2. Cuando los volúmenes tumorales alcancen los 120 mm 3 (+/- 20 mm3), colocar los animales en estudio. Diseñar el estudio, asegurándose de que haya grupos de control y tratamiento apropiados, incluidas cohortes de terapia combinada (es decir, control, mNPH, radiación y la combinación).
    3. Anestesiar a los ratones que vayan a recibir mNPs como se describe en 3.1.4.
    4. Limpie el área con una toallita con alcohol. Inyecte mNPs en el tumor 3 h antes del tratamiento con HMA. Inyecte un volumen tal que la dosis sea de 7,5 mg de hierro/cm3 del tumor.
      NOTA: Los datos no publicados del laboratorio sugieren que la absorción máxima de mNP ocurre a las 3-6 h.
  3. Tratamiento de la HMA
    1. Anestesiar el ratón y colocarlo en una almohadilla térmica para mantener la temperatura central.
    2. Compruebe la falta de respuesta a los reflejos de enderezamiento. Retire la marca auricular o cualquier otro objeto metálico del ratón.
    3. Coloque suavemente una sonda de temperatura de fibra óptica lubricada en el recto del ratón.
    4. Coloque un catéter en el tumor, retirando la aguja. Corte el catéter de manera que no sobresalga demasiado del tumor.
      NOTA: Los catéteres de temperatura de fibra óptica se colocan y retiran mientras los ratones están bajo anestesia general, es decir, los catéteres solo están en su lugar durante el procedimiento de calentamiento del tumor. Los ratones reciben una dosis subcutánea única de un medicamento para la analgesia AINE, ketoprofeno (5 mg / kg), en el momento del procedimiento. No hemos observado molestias o morbilidades a corto o largo plazo asociadas con la colocación de los catéteres.
    5. Inserte una sonda de temperatura de fibra óptica de 3 sensores en el catéter. El catéter protege los sensores de la sonda de temperatura de fibra óptica.
    6. Pegue la sonda rectal e intratumoral a la cola del animal para asegurarse de que permanezcan en su lugar.
    7. Coloque el mouse en un tubo de 50 ml, diríjase hacia abajo. El tubo debe tener un orificio cerca de la cabeza donde se conectará y administrará la anestesia.
    8. Coloque el tubo dentro de la bobina configurada y vuelva a conectar la anestesia.
    9. Coloque una sonda de temperatura de fibra óptica suelta en el tubo para medir la temperatura ambiente.
    10. Encienda el enfriador y asegúrese de que el refrigerante esté circulando.
    11. Compruebe y asegúrese de que el software de la computadora muestra las diversas temperaturas y comience a grabar para permitir que se muestre un cálculo CEM43 en tiempo real. El CEM43 requerido es la dosis previamente determinada.
      NOTA: Antes de encender el imán, asegúrese de que no haya elementos metálicos adheridos al animal, ya que se calentarán rápidamente. Además, asegúrese de que todos en la habitación no tengan un marcapasos y que sea seguro para ellos estar allí.
    12. Encienda el imán a un porcentaje de potencia bajo.
    13. Asegúrese de que las sondas de temperatura de fibra óptica registren los cambios de temperatura. Las temperaturas aumentarán una vez que se active el AMF a medida que aumenta el campo. Asegúrese de que la temperatura central del animal permanezca a 38 °C. Regule la temperatura central utilizando la camisa de aire acondicionado.
    14. Ajuste la fuerza del campo magnético cambiando la potencia del generador, utilizando el dial de control incorporado, que a su vez controla el nivel de temperatura en el tumor.
    15. Cierre la AMF una vez que se logre la dosis deseada, según lo determinado previamente por el usuario (por ejemplo, CEM43 40), dentro del tumor.
    16. Una vez que se haya apagado el AMF, retire el tubo de la bobina.
    17. Retire el ratón del tubo, extrayendo las diversas sondas y el catéter. Si es necesario, etiquete al animal con una nueva marca auricular de metal.
    18. Una vez que se completen los tratamientos, apague el enfriador.
    19. Recuperar a los animales de la anestesia asegurando que no haya complicaciones. Monitoree su comportamiento para asegurar el retorno a la normalidad.

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Resultados

Estudios in vitro
Las células solo alcanzarán y mantendrán la temperatura deseada y la dosis térmica si la cantidad y la concentración de las nanopartículas magnéticas / hierro y el AMF se combinan adecuadamente. Cuando se utilizan nanopartículas magnéticas para calentar células in vitro (e in vivo), debe tenerse en cuenta que para lograr hipertermia en células con nanopartículas magnéticas internalizadas, será necesario un nivel específico de mNP / Fe intracelular, y será necesario el número y la pro...

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Discusión

El diseño y la implementación de este sistema proporciona la capacidad de realizar experimentos precisos y reproducibles de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. Es fundamental que el sistema esté diseñado de tal manera que la frecuencia AMF y la intensidad de campo se ajusten adecuadamente al tipo de nanopartícula magnética, la concentración y la ubicación y temperatura del tejido deseadas. Además, el monitoreo preciso de la temperatura en tiempo real es crucial para la seguridad y el cálculo de u...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El estudio fue financiado por los números de subvención: NCI P30 CA023108 y NCI U54 CA151662.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
.25% TripsinaCorning45000-664disponible en muchas empresas Tubos de
1,5 mL EppendorfEppendorf22363204disponible en muchas empresas
Células de melanoma murino B16F10Colección de cultivos tipo americanoCRL-6475
Ratones C57/Bl6Río Charles027C57BL/6Ratones hembra de 6 semanas de edad
EnfriadorCuidado térmicoEnfriador de la serie NQ 5que enfría la bobina
Fluido refrigeranteDow Chemical CompanyDowtherm SR-1fluido de enfriamiento de antena
Suero fetal bovinoHycloneSH30071disponible en muchas empresas
sondas de fibra óptica, software y chasisFISOSoftware de evolución FISO utilizado para leer las temperaturas
Cámara IRFlircámara infrarroja para controlar el calentamiento involuntario
nanopartículas de óxido de hierromicromod Partikeltechnologie GmbHNanoferrita bionizada nanopartículasóxido de hierro recubiertas de dextrano
bobina de ratón, solenoideFluxtrol
Corning45000-652disponible en muchas empresas
Generador de RFHuttingerFuente de alimentaciónTIG 10/300
Medios RPMICorning45000-396disponibles en muchas empresas
de penicilina/estreptomicina a medida

Referencias

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