Este protocolo muestra cómo emplear la microscopía de superresorción para estudiar la co-localización de proteínas en cultivos neuronales primarios.
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Artículo de método
Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias
En este artículo
Resumen
Resumen
Las sinapsis son los elementos funcionales de las neuronas y sus defectos o pérdidas están en la base de varios trastornos neurodegenerativos y neurológicos. Los estudios por imágenes se utilizan ampliamente para investigar su función y plasticidad en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a su tamaño y estructura, los estudios de localización de proteínas requieren técnicas de imagen de alta resolución. En este protocolo, describimos un procedimiento para estudiar en las neuronas primarias la co-localización de proteínas diana con marcadores sinápticos a nivel de superresción utilizando microscopía de iluminación estructurada (SIM). SIM es una técnica de iluminación de luz estanco que duplica la resolución espacial de la microscopía de campo ancho, alcanzando un detalle de alrededor de 100 nm. El protocolo indica los controles y la configuración necesarios para estudios de co-localización robustos y una visión general de los métodos estadísticos para analizar los datos de imagen correctamente.
Introducción
La comprensión y la visión de la sinapsis ha cambiado enormemente desde su primera descripción por Foster y Sherrington en 18971. Desde entonces, nuestro conocimiento de la comunicación neuronal y los procesos moleculares detrás de ella ha crecido exponencialmente2. Ha quedado claro que las sinapsis pueden considerarse como un sistema de dos compartimentos: un compartimento presináptico que contiene vesículas para la liberación de neurotransmisores y un compartimento postsináptico con receptores3. Esta visión simplista, en los últimos veinte años, se ha convertido en una compleja red de proteínas ....
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Protocolo
1. Culturas primarias
- Neuronas primarias de hipocampo de ratón de cultivo en cubreobjetos con cámara (como Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que coinciden con el requisito objetivo para el espesor de la cubierta de #1,5 (0,17 mm).
- Cubiertas con cámara de abrigo con 100 ml de poli-L-lisina (100 g/ml).
- Al día siguiente, lave los cubreobjetos a cámara dos veces con solución salina estéril tamponada por fosfato (PBS).
- Para obtener neuronas primarias de ratón, aislar hipocampos de cachorros P1-P423.
- Coloque el hipocampo diseccionado en 10 ml de medios de disección (Tab....
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Resultados
Aquí presentamos el flujo de trabajo estándar para estudiar la co-localización de proteínas neuronales. Primero calibramos el microscopio y luego realizamos el análisis SIM de las muestras. Para calibrar el sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 m de diámetro. Al obtener imágenes 3D-SIM superconsúcesas de los cordones, los datos de imagen subyacentes se transforman en Fourier para volver a convertirlas en una representación de frecuencia espacial. En la Figura 2A,el patrón de .......
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Discusión
Elucidar la estructura y composición de la sinapsis es crucial para entender los procesos fisiológicos y patológicos que regulan la memoria y la cognición. Mientras que en el estado normal, las sinapsis son los bloques de construcción de la memoria, también subyacen a trastornos neurológicos complejos como la enfermedad de Alzheimer32. El protocolo descrito aquí sirve para estudiar la co-localización de proteínas neuronales con una técnica de microscopía de superresor resolución llamada SIM. Usand.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a Edoardo Micotti por la crítica constructiva del manuscrito. Este estudio fue apoyado por BrightFocus A2019296F, por Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), por la Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) y por la Red de Formación Innovadora Marie Sk-odowska-Curie (JK).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de azul de tripano al 0,4%... | Thermo Fisher Scientific 15250061 | Chemical | |
| 70 y micro; Filtro M | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher | Scientific-Antibody | |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Albúmina sérica bovina | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | |
| Cubreobjetos | con cámara Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific-Antibody | ||
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| Microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres, 0,1 μ m, amarillo– verde fluorescente | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | |
| Chemical Glutamax | GIBCO | 35050061 | |
| Chemical HEPES Merck | Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Ciencias de la Vida | C6852-25g | Químico |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Anticuerpo |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medio |
| MgCl Merck | Life Science | M8266 | Químico |
| NaOH | VWR International | 1.091.371.000 | Químico |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medio |
| N-SIM Microscopio de superresolución | Nikon-Instrument | ||
| Papain | Merck Life Science& nbsp; | P-3125 | |
| Paraformaldehído químico | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Chemical Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | solución |
| salina tamponada con fosfato químico | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lisine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Anticuerpo |
| Cubreobjetos redondo | Thermo | 12052712 Equiment | |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Anticuerpo |
| Sinaptofisina | Merck | S5768 | anticuerpo |
| Tritón X-100 | Merck | T8787 | Inhibidor químico |
| tripsina | Merck Ciencias de la Vida | T9003-500MG | Químico |
Referencias
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K.
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Reimpresiones y permisos
