Este protocolo es un método eficiente, rentable y robusto para aislar la microglia primaria del tejido cerebral humano vivo, adulto. La microglia humana primaria aislada puede servir como una herramienta para estudiar los procesos celulares en la homeostasis y la enfermedad.
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Artículo de método
Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto
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Resumen
Resumen
Las microglia son células inmunitarias innatas residentes del sistema nervioso central (SNC). La microglia desempeña un papel fundamental durante el desarrollo, en el mantenimiento de la homeostasis y durante la infección o lesión. Varios grupos de investigación independientes han puesto de relieve el papel central que desempeñan las microglia en las enfermedades autoinmunes, los síndromes autoinflamatorios y los cánceres. La activación de la microglia en algunas enfermedades neurológicas puede participar directamente en procesos patógenos. La microglia primaria es una herramienta poderosa para entender las respuestas inmunitarias en el cerebro, las interacciones celulares y celulares y los fenotipos de microglia desregulados en la enfermedad. La microglia primaria imita las propiedades microgliaales in vivo mejor que las líneas celulares microgliaales inmortalizadas. La microglia adulta humana exhibe propiedades distintas en comparación con la microglia fetal y de roedores humanos. Este protocolo proporciona un método eficiente para el aislamiento de la microglia primaria del cerebro humano adulto. El estudio de estas microglias puede proporcionar información crítica sobre las interacciones entre células celulares entre la microglia y otras poblaciones celulares residentes en el SNC, incluidos los oligodendrocitos, las neuronas y los astrocitos. Además, la microglia de diferentes cerebros humanos puede ser cultivada para la caracterización de respuestas inmunitarias únicas para la medicina personalizada y una miríada de aplicaciones terapéuticas.
Introducción
El sistema nervioso central (SNC) está construido de una compleja red de neuronas y células gliales1. Entre las células gliales, la microglia funciona como las células inmunitarias innatas del SNC2,3. Microglia es responsable de mantener la homeostasis en el SNC sano4. Microglia también juega un papel importante en el neurodesarrollo, mediante la poda de sinapsis2. Las microglia son fundamentales para la fisiopatología de varias enfermedades neurológicas, incluyendo pero no limitado a; Enfermedad de Alzheimer5, Enfermedad de Parkinson6, accidente cerebrovascular7, esclerosis múltiple8, lesión cerebral traumática9, dolor neuropático10, lesión de la médula espinal11 y tumores cerebrales como gliomas12.
Los estudios relacionados con la homeostasis y las enfermedades del SNC utilizan microglia de roedores debido a una escasez de protocolos de aislamiento de microglia primaria humana rentables y eficientes en el tiempo13. La microglia de roedores se asemeja a la microglia humana primaria en la expresión de genes como iba-1, PU.1, DAP12 y receptor M-CSF y han sido eficaces en la comprensión de cerebros normales y enfermos13. Curiosamente, la expresión de varios genes inmunes relacionados como TLR4, MHC II, Siglec-11 y Siglec-3 varía entre la microglia humana y la microglia de roedores13. La expresión de varios genes también varía en la expresión temporal y en las enfermedades neurodegenerativas en ambas especies14,,15. Estas diferencias significativas hacen de la microglia humana un modelo esencial para estudiar la función de la microglia en la homeostasis y la enfermedad. La microglia humana primaria también puede ser una herramienta eficaz para el cribado preclínico de posibles candidatos a medicamentos16. Las razones antes mencionadas subrayan la creciente necesidad de protocolos rentables para el aislamiento de la microglia humana primaria.
Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de la microglia humana primaria a partir del tejido cerebral humano adulto recogido como resultado de la ventana quirúrgica creada para resección de tumores u otras resecciones quirúrgicas. El método aquí es considerablemente diferente de los métodos existentes. Pudimos aislar y cultivar microglia después de un tiempo de tránsito de unos 75 minutos desde el sitio de recolección de tejidos hasta iniciar el protocolo de aislamiento en el laboratorio. Hemos utilizado el sobrenadante de células de fibroblastos L929 para promover el crecimiento de microglia aislada. Este método se centra específicamente en la cultura y el desarrollo de sólo la microglia primaria. El cultivo resultante preparado es de aproximadamente 80% microglia. Mientras que otros protocolos proporcionan un cultivo enriquecido de microglia por centrifugación de gradiente de densidad, citometría de flujo y cuentas magnéticas, el protocolo es una forma rápida, simple, robusta y rentable de cultivar microglia humana primaria17,18,19,20. La capacidad de utilizar el tejido cerebral adulto vivo extirpado quirúrgicamente en lugar de los tejidos cerebrales fijos de los cadáveres demuestra una ventaja adicional de este método en contraste con los procedimientos existentes18,,21.
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Protocolo
Todos los tejidos fueron adquiridos después de la autorización ética de los comités de ética del Instituto Indio de Tecnología Jodhpur y el Instituto de Ciencias Médicas de all India (AIIMS) Jodhpur.
1.Adquisición y procesamiento de tejidos (Día 0)
- Recoger el tejido en un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de líquido cefalorraquídeo artificial helado (aCSF) (2 mM CaCl2a 2H2O, 10 mM de glucosa, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2a6H 2O, 202 mM sacarosa)20. Asegúrese de que el tubo se mantiene en hielo si el tejido necesita ser transferido a un lugar diferente.
NOTA: Prepare el aCSF en agua destilada autoclavada. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,22 m en la campana laminar. Esto se puede almacenar durante 1 mes a 4 oC. - Limpie el tubo de recogida cuidadosamente con 70% de alcohol y transfiera a una cámara de flujo de aire laminar aséptica.
- Deseche el aCSF cuidadosamente y pese el tejido en una condición aséptica. El peso del tejido es esencial para calcular el volumen de tripsina-EDTA necesario para los pasos posteriores.
- Mantener el tejido en aCSF fresco y caliente a 37 oC durante 5 minutos. Este paso es fundamental para evitar la muerte celular.
- Deseche el aCSF y lave el tejido una vez con 1 PBS (solución salina tamponada de fosfato) a 37 oC. Asegúrese de que toda la sangre se lave con lavados repetidos de PBS (según sea necesario).
- Incubar el tejido en PBS caliente, a 37oC, durante 5 min.
- Deseche PBS cuidadosamente y transfiera el tejido a una placa Petri esterilizada. PBS se puede quitar con una pipeta. Esto evitará cualquier pérdida de tejido.
- En dados el tejido en trozos pequeños (al menos 1 mm3)utilizando un bisturí estéril. El tejido finamente cortado en cubos proporciona una mayor superficie tisular para la disociación de tejidos por trippsina-EDTA asegurando un mayor rendimiento.
- Transfiera el tejido cortado en cubos a un tubo de 50 ml que contenga 10 ml/g de tejido de 0,25% de trippsina-EDTA y mezcle pipeteando a través de una pipeta serológica de 10 ml. Agregue 2 ml de tripps/EDTA a un plato de Petri y lave bien la placa con la ayuda de la pipeta. Añade esta tripina al tubo de halcón. Esto minimiza la pérdida de tejido y células mientras se dicing.
- Incubar el tubo en una coctelera durante 30 minutos a 37 oC a 250 rpm. Este paso aumenta la disociación de las células del tejido.
- Al final de la incubación, añadir 10 mL de medio neutralizador (50% DMEM/50% F12 con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS) para neutralizar la tripina. Mezclar con una pipeta serológica de 10 ml. La cantidad de medios neutralizantes añadidos debe ser igual a la cantidad de tripsina utilizada.
- Centrifugar el tubo a 2.000 x g a 4 oC durante 10 minutos.
- Desechar el sobrenadante y re-suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo (50% DMEM/50% F12 con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 20% sobrenadante L929, 10% FBS).
NOTA: Las células L929 se cultivan en DMEM (DMEM con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS). Se debe seguir el método de cultivo recomendado por ATCC para el cultivo celular. El sobrenadante debe recogerse del matraz de cultivo que sea al menos del 75% confluente. Se puede recoger a granel y almacenar a -80 oC para evitar la degradación de los factores de crecimiento. Se recomienda añadir L929 sobrenadante por separado en matraces en lugar de añadir al medio de cultivo de stock. - Placar las células en un matraz T-25, adecuado para las células adherentes, y añadir 4 ml de medio de cultivo adicional. Incubar el matraz a 37oC con 5% de CO2. Agitar cuidadosamente el matraz para dispersar homogéneamente el tejido. Evite llevar el soporte al cuello del matraz, mientras agita, ya que esto puede aumentar las posibilidades de contaminación.
2.Cultivo celular (Día 2)
- Recoger los medios del matraz de cultivo T-25 preparado el día 0 en tres tubos centrífugos de 1,5 ml mediante la recogida del mismo volumen de medios en cada tubo. Lave el matraz una vez con 1 x PBS. Agitar el matraz suavemente para eliminar los fragmentos de tejido remanente que queden. Evite el temblor brusca del matraz, ya que los fragmentos remanentes no afectarán negativamente al cultivo. Añadir 5 ml de medios de cultivo frescos al matraz.
- Centrifugar los medios recogidos a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 oC durante 4 minutos.
- Deseche el sobrenadante de cada tubo y agregue 1 ml de medio de cultivo a uno de los tubos. Mezclar bien con la pipeta. Agregue en serie los medios mixtos con las células a otros tubos. Mezclar bien con la pipeta y agrupar las células en un tubo.
- Placar las células en un matraz T-25 separado, adecuado para las células adherentes. Añadir 4 ml de medio de cultivo e incubar el matraz a 37oC con un 5% de CO2.
3.Cultivo celular (Día 4)
- Deseche el soporte de ambos matraces y añada 5 ml de medios de cultivo al matraz.
- Incubar el matraz a 37oC con 5% deCO2 durante 2 días.
4. Cultivo celular (Día 6)
- Las células estarán listas para más experimentos.
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Resultados
Mediante el uso del protocolo antes mencionado (Figura 1), pudimos aislar la microglia humana primaria de los tejidos cerebrales resecados quirúrgicamente en vivo. Las células cultivadas se tiñeron con Ricinus communis agglutinina-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) y con proteína ácida fibrillaria Glial (GFAP) para astrocitos (rojo) (Figura 2) como se describió anteriormente22,
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Discusión
Microglia asegurar la homeostasis en el cerebro normal y desempeñar un papel central en la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas4. Las microglia son fundamentales para el neurodesarrollo y la formación de sinapsis2. Los estudios microgliales han demostrado ser fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de diversas enfermedades neurológicas4. La microglia de roedores es el modelo predominante de elección para los estudi...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El laboratorio de SJ se estableció con subvenciones institucionales del IITJ y está financiado por subvenciones del Departamento de Biotecnología (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) y del Ministerio de Electrónica y Tecnología de la Información del Gobierno de la India (No 4(16)/2019-ITEA). Las secciones de tejido cerebral humano se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas de All India (AIIMS) Jodhpur después de la autorización del comité de ética institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, estudiante de B.Tech Student miembro de la Sociedad de Diseño y Artes IIT Jodhpur, por el apoyo a la videografía.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución antibiótica-antimicótica | Himedia | A002 | |
| Cloruro de calcio | Sigma | 223506 | |
| Centrífuga (4 & grados; C) | Tubos | 146532 | |
| Abdos | P10203 | ||
| Incubadora 2 | Nuevo Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucosa | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medio con glutamina | Himedia | AL007S | |
| Suero fetal bovino | Himedia | RM9955 | |
| Tubo de frasco (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluoresceína Ricinus communis aglutinina-1 | Vector | FL-1081 | |
| Microscopio fluorescente | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield con DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP anticuerpo | GA5 | 3670S | |
| Agitador incubador | Nuevo Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 línea celular | ATCC | NCTC clon 929 [célula L, L-929, derivado de la cepa L] (ATCC CCL-1) | |
| Flujo de aire laminar | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Cloruro de magnesio | Himedia | MB040 | |
| Fosfato monosódico | Merck | 567545 | |
| Mezcla de nutrientes F-12 Jamón | Medio Himedia | Al106S | |
| Petri | Duran Grupo | 237554805 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Himedia | ML023 | |
| Cloruro de potasio | Himedia | MB043 | |
| Pipeta serológica | Labware | LW-SP1010 | |
| Bicarbonato sódico | Himedia | MB045 | |
| Sacarosa | Himedia | MB025 | |
| Filtro de jeringa (0,2μ, 25 mm de diámetro) | Matraces | ||
| T-25 aptos para el cultivo de células adherentes. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Tripsina-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referencias
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