Método MEJORADO UPLC-UV para la Cuantificación de la Vitamina C en Variedades de Lechuga (Lactuca sativa L.) y Cultivo De Parientes Silvestres (Lactuca spp.)

Summary

Presentamos un método rápido y fiable para cuantificar la vitamina C en Lactuca spp. utilizando UPLC-UV, potencialmente transferible a otras plantas. Los pasos clave son la preparación de la muestra y la extracción de vitamina C en condiciones estables, la reducción del ácido deshidroascórbico al ácido ascórbico y la optimización del procedimiento cromatográfico.

Abstract

Las vitaminas, especialmente la vitamina C, son importantes micronutrientes que se encuentran en las frutas y verduras. La vitamina C también es un importante contribuyente a su capacidad antioxidante. La lechuga es una de las verduras más populares entre los consumidores de todo el mundo. Un protocolo preciso para medir el contenido de vitamina C en lechuga y otras especies relacionadas es crucial. Aquí describimos un método que utiliza la técnica de cromatografía líquida-ultravioleta (UPLC-UV) de ultra alto rendimiento, en la que se optimizaron las condiciones de preparación de muestras, extracción de vitaminas y cromatografía.

Se recogieron muestras para representar toda la planta, congeladas a -80 oC y liofilizadas para evitar la oxidación indeseable y facilitar su manipulación. La extracción de vitamina C se llevó a cabo en medios ácidos, lo que también contribuyó a su estabilidad. Como la vitamina C puede estar presente en dos formas interconvertibles diferentes, el ácido ascórbico (AA) y el ácido deshidroascórbico (DHAA), ambos compuestos deben medirse para una cuantificación precisa. El DHAA se cuantificó indirectamente después de su reducción a AA porque AA muestra una mayor absorción que DHAA en el rango UV del espectro. A partir del mismo extracto, se llevaron a cabo dos mediciones, una antes y otra después de esa reacción de reducción. En el primer caso, estábamos cuantificando el contenido de AA, y en el segundo, cuantificamos la suma de AA y DHAA (TAA: ácido ascórbico total) en forma de AA. Entonces, la cantidad de DHAA se obtuvo indirectamente restando AA proveniente de la primera medición de TAA. Fueron determinados por UPLC-UV, utilizando un estándar comercial AA para construir una curva de calibración y optimizar el procedimiento cromatográfico, para obtener picos AA que se resolvieron completamente en poco tiempo. Este protocolo podría extrapolarse fácilmente a cualquier otro material vegetal con cambios leves o ninguno. Su precisión reveló diferencias estadísticamente significativas de lo contrario nopercibidas. Otras fortalezas y limitaciones se discuten más a fondo en el manuscrito.

Introduction

La lechuga cultivada(Lactuca sativa L.) es una de las verduras de hoja más producidas y consumidas en todo el mundo, con una producción total de alrededor de 27,3 millones de toneladas en 2018^1. La lechuga es percibida como saludable por los consumidores. Las propiedades nutricionales se atribuyen principalmente a la fuente de compuestos antioxidantes en el cultivo, como la vitamina C, entre otros como los polifenoles y la vitamina E^2. La vitamina C es un micronutriente esencial para los seres humanos a diferencia de muchos otros vertebrados, ya que no podemos producirlo debido a mutaciones presentes en la codificación genética para la enzima del último paso en la vía biosintética^3. Es necesario para un metabolismo celular normal y también juega un papel importante en las respuestas inmunitarias principalmente debido a su actividad antioxidante^3,4.

La vitamina C total se compone de ácido ascórbico (AA) y ácido deshidroascórbico (DHAA). AA es la forma biológicamente más activa de la vitamina, pero DHAA (su producto de oxidación) también muestra actividad biológica y se puede convertir fácilmente en AA en el cuerpo humano⁵. Por lo tanto, cuantificar ambas formas es importante determinar el contenido total de vitamina C de cualquier cultivo hortícola, lechuga incluida.

Se ha utilizado una amplia variedad de enfoques basados en diferentes técnicas analíticas para medir la vitamina C en las verduras, como los métodos enzimáticos, espectrofotométricos y titrimétricos^6,7,8. Aunque estos métodos son simples, no son químicamente específicos para AA⁹. En consecuencia, se prefieren los métodos cromatográficos, especialmente la técnica de cromatografía líquida-ultravioleta de alto rendimiento (HPLC-UV), debido a su mayor precisión¹⁰. HPLC-UV se ha utilizado para determinar la vitamina C en una gran diversidad de cultivos, como el brócoli, las espinacas y la lechuga^11,12,13. Sin embargo, la cuantificación simultánea de AA y DHAA es complicada debido a la baja absorción de DHAA en el rango UV del espectro. Alternativamente, DHAA se puede determinar indirectamente mediante el uso de un agente reductor que convierte DHAA a AA, midiendo el ácido ascórbico total (TAA), y luego calculando la diferencia entre TAA y AA. Debido a la necesidad de una reacción de reducción, en algunos estudios, sólo AA se ha cuantificado¹⁴, lo que en realidad podría representar una subestimación de la actividad de la vitamina C. Esa reacción de reducción adicional también es necesaria para determinar DHAA indirectamente incluso cuando se utiliza el último avance en técnicas de cromatografía líquida, cromatografía líquida de alto rendimiento (UPLC). Ese paso también se beneficia de las ventajas que UPLC exhibe en comparación con HPLC: mayor eficiencia y resolución, mayor sensibilidad, análisis de tiempo más corto y menor consumo de^{disolventes 15}. En consecuencia, la técnica UPLC-UV se ha utilizado para cuantificar la vitamina C en diferentes cultivos^16.

Además, AA es una molécula muy lábil; por lo tanto, es importante desarrollar un protocolo que evite su degradación durante el almacenamiento de lechuga y el análisis de vitamina C^9. En este contexto, el siguiente protocolo ofrece una cuantificación rápida y mejorada del contenido de vitamina C en lechuga por UPLC-UV, así como un procedimiento de extracción eficiente. No sólo se han incluido cultivares de élite en el presente estudio, sino también las razas terrestres tradicionales y algunos parientes silvestres debido a su interés potencial en la cría de cultivos, específicamente en la mejora del valor nutricional de la lechuga.

Protocol

1. Preparación de materiales vegetales

1. Muestre al menos dos hojas por planta en tubos de polipropileno de 50 ml, uno exterior (más antiguo) y uno interno (más joven) para representar con mayor precisión toda la planta. Recoger al menos tres réplicas biológicas para cada muestra.
2. Congelarlos inmediatamente con nitrógeno líquido y guárdalos a -80oC hasta su uso. Asegúrese de que el nitrógeno líquido no entre en los tubos; de lo contrario podrían explotar cuando se retiran debido a la expansión del gas durante la vaporización.
   ADVERTENCIA: Se requieren guantes y un protector facial debido a los peligros potenciales asociados con el uso de nitrógeno líquido.
3. Retire las tapas de los tubos y colóquelas en las bandejas dentro de la cámara de congelación del liofilizador(Tabla de materiales)programada de la siguiente manera: -25 oC para 72 h, -10 oC durante 10 h, 0 oC durante 10 h y 20 oC durante al menos 4 h. Mantenga la temperatura del condensador y la constante de vacío durante el proceso de secado por congelación a -80,2 oC y 112 mTorr, respectivamente.
4. Cuando el material esté completamente seco (entre 4 y 7 días dependiendo de la planta y el grado de compactación en el tubo), conservar a 4 oC, -20 oC o -80 oC para un corto (días a semanas), almacenamiento medio (meses) o largo (años), respectivamente. Se recomienda la inclusión de bolsas que contengan perlas de gel de sílice en los tubos que contienen muestras.
5. Coloque las muestras liofilizadas en tubos de polipropileno de 20 ml junto con bolas de acero inoxidable de 10 mm de diámetro y muele con un vórtice multitubo utilizando la intensidad y el tiempo necesarios para obtener un polvo fino.
   NOTA: Durante todo el proceso, proteja las muestras de la exposición a la luz directa.

2. Preparación de reactivos y soluciones

1. Preparar la solución de extracción de disolvente: 8% ácido acético (v/v), 1% MPA (ácido metafosfórico) (p/v), 1 mM EDTA (ácido etilendiaminetetraacético).
   1. Calcular el volumen total de disolvente necesario para procesar todo el conjunto de muestras teniendo en cuenta que se añadirán 5 ml a cada una. Para preparar 1 L de la solución, añadir a un matraz: 30 g de MPA, 0,372 g de EDTA deshidratado, 80 ml de ácido acético y 500 ml de agua ultrapura (volumenes de escala y cantidades en consecuencia). Selle la boca del matraz con película de plástico.
   2. Una vez disuelto con la ayuda de un agitador magnético, utilice un matraz volumétrico para medir con precisión 1 L, añadiendo el agua ultrapura necesaria.
2. Preparar el tampón de reacción de reducción (0,5 M Tris (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol) pH 9.0) y la solución reductora (40 mM TDT (1,4-Dithiothreitol) con 0,5 M Tris pH 9.0).
   1. Calcular el volumen total de la solución reductora necesaria para procesar todo el conjunto de muestras teniendo en cuenta que se añadirán 200 l a cada una de ellas. Para preparar 100 ml del tampón, añadir a un vaso de precipitados: 6.055 g de Tris y 90 mL de agua ultrapura (volúmenes de escala y cantidades en consecuencia). Selle la boca del vaso de precipitados con película de plástico.
   2. Una vez disuelto con la ayuda de un agitador magnético, ajustar la solución a pH 9.0 mediante la adición de 2 M HCl y utilizar un matraz volumétrico para medir con precisión 100 ml, añadiendo el agua ultrapura necesaria.
   3. Para preparar 100 ml de la solución reductora, añadir a un vaso de precipitados: 0,629 g de TDT (pureza: 98%) y 90 ml del buffer (0,5 M Tris pH 9.0) previamente preparado (2.2.1 a 2.2.2). Escalar volúmenes y cantidades en consecuencia. Selle la boca del vaso de precipitados con película de plástico.
   4. Una vez disuelto con la ayuda de un agitador magnético, utilice un matraz volumétrico para medir con precisión 100 ml, añadiendo el volumen necesario de tampón 0,5 M Tris pH 9.0.
      NOTA: La solución reductora es muy inestable. Es por eso que se recomienda encarecidamente una solución recién hecha.
3. Acido sulfúrico (0,4 M H₂SO₄)
   1. Calcular el volumen total de ácido sulfúrico de 0,4 M necesario para procesar todo el conjunto de muestras teniendo en cuenta que se añadirán 200 l a cada una. Para preparar 100 mL de la solución, añadir a un vaso de precipitados: 80 mL de agua ultrapura y luego 2,22 mL de H₂SO₄ (pureza: 96%, densidad: 1,84 g mL^-1). Utilice un matraz volumétrico para medir con precisión 100 ml, añadiendo el agua ultrapura necesaria.
      ADVERTENCIA: El ácido sulfúrico es muy corrosivo, por lo que debe manipularse con equipo de protección y bajo el capó. Además, el ácido debe añadirse al agua ultrapura, y no al agua al ácido, para reducir los humos y evitar accidentes.
4. Acido clorhídrico (2 M HCl).
   1. Para preparar 100 mL de ácido clorhídrico de 2 M, añadir a un vaso de precipitados: 80 mL de agua ultrapura y luego 6,13 mL de HCl (pureza: 37%, densidad: 1,19 gL^-1). Selle la boca del vaso de precipitados con película de plástico. Utilice un matraz volumétrico para medir con precisión 100 ml, añadiendo el agua ultrapura necesaria. Escale los volúmenes en consecuencia.
      ADVERTENCIA: El ácido clorhídrico es muy corrosivo, por lo que tiene que ser manipulado utilizando equipos de protección y bajo el capó. Además, el ácido debe añadirse al agua ultrapura, y no al agua al ácido, para reducir los humos y evitar accidentes.
5. Estándar AA (stock y diluciones)
   1. Pesar exactamente 10 mg de estándar AA (pureza: 99%) utilizando una balanza de precisión y añadir 90 ml de fase móvil (pH de agua ultrapura 2.0 con ácido fórmico).
   2. Una vez disuelto con la ayuda de un agitador magnético, utilice un matraz volumétrico para medir con precisión 100 ml, añadiendo el volumen necesario de pH de agua ultrapura 2.0 con ácido fórmico.
      NOTA: Proteja esta solución de stock de la exposición a la luz.
   3. Prepare cinco diluciones del stock del estándar AA para obtener una curva de calibración siguiendo las instrucciones de la Tabla 1 y proceda con el paso 5.2.

Estándar	[AA] (g mL-1)	Solución AA (100 g de ml-1) (L)	Fase móvil (L)a
1	0.5	5	995
2	2.5	25	975
3	5	50	950
4	10	100	900
5	25	250	750
a PH de agua ultrapura 2.0 acidificado por ácido fórmico.

Tabla 1: Protocolo para preparar cinco normas de AA (ácido ascórbico). Se indican los volúmenes de soluto y disolvente para preparar cada una de las diferentes concentraciones de las normas.

3. Extracción de AA y DHAA

NOTA: Se recomienda trabajar en condiciones de baja intensidad lumínica durante los pasos de extracción.

1. A un tubo centrífugo de polipropileno de 15 ml, añada 50 mg de muestra de suelo liofilizado y 5 ml del disolvente de extracción (paso 2.1).
2. Agitar la mezcla con un vórtice durante 5 s y luego un agitador orbital durante 10 min a 2000 rpm.
3. Introducir el tubo en un baño ultrasónico durante 10 minutos a temperatura ambiente con ultrasonido activado.
4. Centrifugar a 4.000 g durante 10 min a 4oC.
5. Tome el sobrenadante, páselo a través de un filtro de celulosa regenerada de 0,22 m y guárdelo en un vial de ámbar de 5 ml. Este es el extracto 1, que contiene AA y DHAA.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí congelando los extractos a -80 oC y protegiéndolos de la exposición a la luz, ya que AA y DHAA son muy inestables y se degradan fácilmente en presencia de luz, a altas temperaturas o bajo atmósferas oxidantes (Archivo Suplementario 1).

4. Reducción de DHAA a AA para extraer TAA

1. Transfiera 200 l de extracto 1 a un vial de ámbar de 2 ml para cromatografía líquida y añada 200 l de la solución reductora (paso 2.2). Cierre el vial con un tapón de silicona de PTFE con preapretura y agítelo con un vórtice durante 5 s.
2. Deje que la solución se ponga de pie durante 30 minutos a temperatura ambiente y protéjala de la luz.
3. Añadir 200 l de 0,4 M H₂SO₄ para detener la reacción y estabilizar AA en pH ácido. La solución resultante es el extracto 2, que contiene sólo AA y es realmente TAA.

5. Determinación

1. Preparación UPLC-UV
   1. Preparar las soluciones de trabajo descritas en la Tabla 2,debidamente filtradas a través de filtros de 0,22 m, sonicadas durante al menos 10 minutos y colocarlas en el sistema UPLC.
   2. Encienda los tres módulos UPLC y espere a que finalice el proceso de calibración interno.
   3. Abra el software (p. ej., Empower 3) y cargue el programa instrumental descrito en la Tabla 2: Potencia 3 Ejecutar muestras ? Método de vitamina C ( Vitamin C method) UPLC_PDA de la casa de la casa de los Utilice QuickStart.
   4. Una vez que el software se carga con el programa correcto, acceda a la consola de administración de UPLC: Quaternary Solvent Manager . Haga clic con el botón derecho del ratón ? Inicie la consola.
   5. Proceder a la preparación y estabilización del instrumento UPLC: Sistema de la UPLC Control de control ? Inicio.
      1. Purgar todas las líneas DE UPLC durante al menos 5 min: Disolventes Prime QSM ? Comprobación A, B, C, D y Seal Wash Duración de la prima > 5 min.
      2. Purgar y limpiar el inyector: Disolventes Prime SM (SM) Comprobar disolvente de lavado (> 45 s) y Comprobar disolvente de purga (> 35 ciclos).
      3. Equilibrar upLC a las condiciones del método: Equilibrar al método ? QSM ? Flujo (0,3 ml min^-1) Disolvente A (2%) ? Disolvente B (0%) ? Disolvente C (98%) ? Disolvente D (0%); Equilibrar al método ? SM (SM) Muestra (5 oC) Columna (30 oC) y Equilibrio al método Otros ? Comprobar la lámpara encendida Pulse Inicio.
      4. Espere al menos 1 h (se recomienda aún más tiempo) para que el equipo se estabilice. La estabilidad se puede verificar comprobando la presión en la columna en la consola de lanzamiento: Sistema ? Gerente de Disolventes Cuaternarios (Cuaternary Solvent Manager) Presión del sistema QSM. Asegúrese de que no haya tendencias identificables en los cambios de presión (ya sea aumentos o disminuciones) y que el valor delta sea inferior a 10 psi.
   6. En la pantalla Inicio rápido, rellene la matriz con los nombres de los estándares y muestras que se analizarán.
2. Determinación de AA en las normas
   1. Transfiera 1 ml de cada una de las cinco normas AA previamente preparadas (paso 2.5.3) a viales de ámbar de 2 ml para cromatografía líquida. Cierre el vial con un tapón de silicona de PTFE con preapretura e inyecte 5 ml en el instrumento UPLC.
   2. Llevar a cabo la cromatografía siguiendo el procedimiento descrito en la Tabla 2 desde la más diluida hasta la más concentrada.
3. Determinación de AA en las muestras
   1. Pipetear 200 l de extracto 1 en un vial de ámbar de 2 ml para cromatografía líquida y añadir 800 l de agua ultrapura. Cierre el vial con un tapón de silicona de PTFE con preapretura e inyecte 5 ml en el instrumento UPLC.
   2. Llevar a cabo la cromatografía siguiendo el procedimiento descrito en la Tabla 2.
4. Determinación de TAA en las muestras
   1. Añadir 400 l de agua ultrapura para extraer 2. Cierre el vial con un tapón de silicona de PTFE con preapretura e inyecte 5 ml en el instrumento UPLC.
   2. Llevar a cabo la cromatografía siguiendo el procedimiento descrito en la Tabla 2.

Componentes y parámetros	Descripción
Instrumento	Aquity UPLC Clase H
Detector	PDA e- Detector de abs para AA-245 nm
Software	Empoderamiento 3
Columna	Aquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 m)
Canal A	CH3OH
Canal B/Lavado	H2O:CH3OH (50:50 v:v)
Canal C	PH de agua ultrapura 2.0 acidificado por ácido fórmicoa
Canal D/Seal Wash	Agua ultrapura:acetonitrilo (90:10 v:v)
Fase móvil	0,3 ml min-1 de 2%A + 98%C (modo isocrático)
Temperatura de columna	30 oC
Temperatura del muestreador automático	5 oC
Volumen de inyección	5 l
Tiempo de retención de AA	1.874 min
Tiempo de ejecución	3 min
a Volumen indeterminado del ácido fórmico utilizado hasta el ajuste del pH

Tabla 2: Procedimiento cromatográfico optimizado para determinar AA (ácido ascórbico) en extractos de lechuga y parientes silvestres. Descripción de los componentes, condiciones y soluciones empleadas.

6. Cuantificación de AA y DHAA

1. Análisis estadístico
   1. Determinar los parámetros analíticos del método cromatográfico descritos por Bertolín et al.¹⁸ (Tabla 3).
      NOTA: Los valores de los parámetros presentados en el Cuadro 3 deberán definirse en condiciones experimentales específicas.

Parámetros analíticos del método	Valores
Rango lineal (g mL-1)	0.5-25
Ecuación lineal	y 53,143.03x
R2	0.99998
Límite de detección (mg AA g-1 de materia seca)	0.013
Límite de cuantificación (mg AA g-1 de materia seca)	0.045
Repetibilidad (CV,%)	1.75
Precisión intermedia (CV,%)	4.22
Recuperación (Rec, %)b	95.6±2.4
a CV: coeficiente de variación
b El ensayo de recuperación se realizó con 10 alícuotas que contenían 50 mg de la misma muestra, 5 púas con 2 mg de AA g-1 de materia seca y 5 sin puntas. %Rec([AA]spiked sample-[AA]sample)/([AA]spiked)x100.

Tabla 3: Parámetros analíticos optimizados para la detección y cuantificación de AA (ácido ascórbico) y TAA (ácido ascórbico total). El rango lineal, la ecuación y el coeficiente de determinación de la curva de calibración (R^2),así como los límites de detección y cuantificación de AA (el mismo para TAA), y la repetibilidad, precisión intermedia y recuperación se obtuvieron con un volumen de inyección de muestra de 5 l.

2. Calcule la concentración de AA y TAA.
   1. Abra los cromatogramas estándar y de muestra: QuickStart Explorar el proyecto ? Canales ? "nombre del estándar o de la muestra" PDA Ch1 245 nm@1.2 nm.
   2. Integre el pico correspondiente (AA o TAA) en las normas y muestras haciendo clic en su punto de partida (aproximadamente 1.790 min) y arrastrándolo con el ratón hasta su punto final (aproximadamente 1.910 min).
   3. Construir una curva de calibración que represente los valores de absorbancia determinados cromatográficamente (paso 5.2.) contra la concentración de las cinco normas AA preparadas anteriormente (Tabla 1).
   4. Interpolar los valores de absorbancia de las muestras determinadas en los pasos 5.3 y 5.4 y obtener la concentración de AA y TAA, respectivamente, con la siguiente fórmula:
      
      donde y es el área de pico integrada, x es la concentración AA o TAA en ppm y m y n son la pendiente y lae-intercepción de la línea de regresión obtenida, respectivamente.
   5. Para calcular la concentración de DHAA, aplique la siguiente fórmula:
      
      NOTA: Para obtener las concentraciones totales de DHAA, AA y TAA en mg g^-1 de peso seco, los valores obtenidos directamente interpolando en la curva de calibración tendrán que multiplicarse por el volumen total del extracto y el factor de dilución aplicado, y luego dividirse por el peso de la muestra utilizada para llevar a cabo la extracción.

Results

La cuantificación de la vitamina C en matrices de Lactuca requiere el desarrollo de un enfoque cromatográfico que pueda asegurar resultados confiables. La Figura 1A muestra un cromatograma resultante de un protocolo no optimizado(Archivo Suplementario 2),que presenta un pico AA junto con un "hombro" menor no identificado. Sin embargo, después de mejorar las condiciones de extracción y cromatográfica, se logró un pico AA resuelto sin interferencias de compuestos desconocidos (Figura 1B). Además, el uso de equipos UPLC-UV en lugar de HPLC-UV nos permitió reducir el tiempo de retención (RT) para AA: 1.874 min en los cromatogramas optimizados frente a 2.980 min en los no optimizados(Figura 1), así como los tiempos de funcionamiento, 3 y 7 minutos para los protocolos optimizados y no optimizados, respectivamente.

Figura 1: Cromatogramas de AA en la misma muestra de lechuga (cultivar comercial 'Begoña'). (A) Cromatograma HPLC-UV resultante de un protocolo no optimizado (condiciones descritas en el archivo suplementario 2). (B) Cromatograma UPLC-UV obtenido con el protocolo optimizado (condiciones descritas en el Cuadro 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las interferencias en los picos AA, como las observadas en la Figura 1A,dieron lugar constantemente a una subestimación del contenido de vitamina C (AA, DHAA y TAA)(Figura 2)debido a una separación insuficiente durante el proceso cromatográfico, ya que las áreas de pico superpuestas se integraron mediante una caída vertical en el punto más profundo entre ellas. Este sesgo es especialmente notable en el caso de los parientes silvestres de los cultivos, particularmente en el contenido de DHAA y TAA (Figura 2).

Figura 2: Distribución del contenido de vitamina C. Parcelas de violín divididas de contenido de DHAA, AA y TAA (mg g^-1 de peso seco) en variedades comerciales y tradicionales de lechuga y algunos parientes silvestres utilizando protocolos no optimizados y optimizados. Las líneas negras muestran los valores medios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además, el uso de un protocolo no optimizado no nos impidió extraer cualquier conclusión útil de los resultados, ya que mostraban todas las muestras, tanto tipos de lechugas como los parientes silvestres, con un contenido similar de vitamina C. Por el contrario, el protocolo optimizado nos permitió detectar diferencias estadísticamente significativas entre ellos para el contenido de DHAA y TAA (Tabla 4), siendo los más ricos las especies silvestres (Figura 2).

	No optimizado		Optimizado
	Relación F	p-valor	Relación F	p-valor
DHAA	0.460	0.637ns	5.613	0.009**
AA	0.070	0.932ns	1.020	0.374ns
Taa	0.015	0.985ns	4.438	0.022*
ns, * y ** indican no significativos y significativos en p<0.05 y 0.01, respectivamente.

Tabla 4: Variación en el contenido de vitamina C. Relaciones F (cocientes de dos varianzas, la varianza entre grupos y la varianza dentro del grupo) y valores de significancia del ANOVA unidireccional teniendo en cuenta el tipo de Lactuca (variedades comerciales de lechuga, variedades tradicionales de lechuga y parientes silvestres de cultivos) para el contenido de DHAA, AA y TAA en protocolos no optimizados y optimizados.

Archivo Suplementario 1: Estabilidad de AA y TAA a 5 oC durante 24 h. (A) AA y TAA áreas pico a lo largo de 24 h. (B) AA y TAA contenido (mg g^-1 de peso seco) a lo largo de 24 h. Las barras representan las desviaciones estándar de dos réplicas técnicas (n-2) mantenidas en el automuestreador a 5 oC y protegidas de la exposición a la luz. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 2: Principales diferencias entre el protocolo optimizado y el protocolo no optimizado para la extracción y cuantificación de TAA, AA y DHAA. Las muestras utilizadas fueron las mismas en ambos casos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La vitamina C es un nutriente muy importante, pero también es un compuesto muy lábil, por lo que su cuantificación UPLC-UV depende de múltiples factores, como el almacenamiento y la preparación de muestras, el método de extracción y las condiciones cromatográficas. Por lo tanto, se necesitaba un procedimiento rápido y sencillo para prevenir la oxidación de AA (con poder antioxidante) a DHAA (sin propiedades antioxidantes). También fue crucial evitar condiciones de alto pH y temperatura, así como luz intensa y una atmósfera oxidante durante el tratamiento de la muestra para promover la estabilidad del compuesto.

Para minimizar la oxidación de AA, se tomaron las siguientes medidas. En primer lugar, las muestras se liofilizaron como material de partida para ambos protocolos para garantizar una cuantificación precisa del contenido de vitamina C y manipular fácilmente las muestras. Esta opción fue preferida sobre la molienda fina, comúnmente se encuentra en toda la literatura^19,ya que el polvo se descongela muy rápidamente para que el agua vuelva a estar disponible. Durante el procedimiento de extracción, se utilizó como extractante un mayor volumen de una solución más ácida (8% ácido acético y 1% MPA) como extractante en el protocolo optimizado (Archivo Suplementario 2), que también actuó como estabilizador al prevenir la degradación de AA. Esta solución también contenía EDTA como un agente quelante para aumentar la estabilización^16,a diferencia del extractante en el protocolo no optimizado(archivo suplementario 2). Además, probamos si el procedimiento de extracción podría mejorarse mediante el uso de dos extracciones consecutivas con 2,5 ml de extractante en lugar de una sola con 5 ml y bajo una atmósfera N₂ en lugar de las condiciones atmosféricas estándar. Los mejores resultados se alcanzaron utilizando una sola extracción en una atmósfera no modificada, lo que simplificó el protocolo al realizar pasos adicionales innecesarios (datos no mostrados). También se introdujeron otros cambios menores en el protocolo con el fin de mejorar la extracción (es decir, sonicación), obtener un extracto más claro (filtración más fina) y reducir la duración del protocolo(archivo suplementario 2). En cuanto a las condiciones cromatográficas, la validación del método se llevó a cabo como se informó antes^{de 18,}garantizando buenos parámetros analíticos (Tabla 3). Además, el uso de agua ultrapura con ácido fórmico (pH 2.0) y metanol (98:2 v:v) con un flujo mínimo^-1 de 0,3 ml, en lugar de fosfato monopotásico 30 mM (pH 3.0) a 1 mL min^-1 como la fase móvil(Archivo Suplementario 2),resultó en un método mejorado. El avance más importante fue probablemente el uso de un sistema UPLC en lugar de un HPLC, lo que nos permitió un mayor control de las condiciones de impacto (como la temperatura) y resultando en picos AA resueltos sin interferencias por compuestos desconocidos, en un tiempo más corto y consumir menos volumen de extracto(archivo suplementario 2).

Sin embargo, hay dos limitaciones principales de este método. La primera es que DHAA no se puede medir directamente utilizando un detector UV debido a su baja absorción en el rango UV del espectro. Es importante cuantificar el contenido de DHAA porque presenta cierta actividad biológica y es fácilmente convertible a AA en el cuerpo humano⁵. Para ello, se necesita una reacción adicional para reducir el DHAA a AA, junto con una segunda ejecución cromatográfica para medir TAA y luego determinar DHAA indirectamente restando contenido de AA de TAA (Figura 3). En este sentido, el paso de reducción se ha optimizado mediante el uso de una mayor concentración del agente reductor (TDT), aumentando el tiempo de reacción de 5 a 30 min, y deteniendo la reacción con ácido sulfúrico (Archivo Suplementario 2). La baja estabilidad de AA constituye la segunda limitación del método. Como AA comienza a degradarse 4 h después de la extracción(archivo suplementario 1),es necesario cuantificarlo en este intervalo de tiempo. Por lo tanto, el número de muestras a extraer está condicionado por el procedimiento cromatográfico. Es por eso que proponemos congelarlos en ese paso de este protocolo, aunque en ese caso, no todos ellos podrían ser colocados en el automuestreador UPLC para ser medidos automáticamente. Afortunadamente, la RT reducida para AA nos permitió obtener cromatogramas de 3 min, mucho más cortos que los cromatogramas de 7 min obtenidos con HPLC (Archivo Suplementario 2). Por lo tanto, el contenido de vitamina C podría determinarse en un gran número de muestras en una ventana de 4 h.

Figura 3: Flujo de trabajo de la cuantificación de la vitamina C en lechuga y algunos parientes silvestres.
Diagrama esquemático del protocolo optimizado que muestra dos ramas para la determinación de sólo AA o AA + DHAA (TAA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como la vitamina C es un nutriente esencial para los seres humanos y debido a sus importantes beneficios para la salud, se ha convertido en el objeto de muchos estudios. Por lo tanto, se ha cuantificado en una gran variedad de cultivos, incluyendo la lechuga, una de las verduras más consumidas a nivel mundial. Los métodos clásicos simples han sido reemplazados gradualmente por técnicas de cromatografía líquida porque son más específicos y precisos^10. Sin embargo, debido a la necesidad de una reacción adicional para cuantificar ambos, AA y DHAA a través de HPLC, en algunos estudios sobre lechuga, sólo AA¹⁴ o sólo TAA¹¹ (sin cuantificar AA antes de la reducción de DHAA en AA) se han medido. Además, sólo unos pocos autores han cuantificado AA y DHAA, a pesar de la contribución de ambas moléculas a la actividad antioxidante de la vitamina C^2. Sin embargo, la técnica UPLC se ha vuelto más importante en los últimos tiempos debido a su mayor rendimiento a la hora de medir la vitamina C en varios cultivos^16. Comparando los resultados obtenidos en este estudio con las dos metodologías, UPLC y HPLC, se han confirmado estas ventajas: picos AA bien definidos gracias a una mayor sensibilidad, y en muy poco tiempos, se han logrado, lo que también implica menos recursos consumidos. A pesar de la eficiencia de la UPLC, sólo Chen y^{otros han} aplicado esta técnica para medir el contenido de vitamina C en la lechuga, lo que todavía condujo a una subestimación ya que sólo se cuantificó la forma AA.

En resumen, este trabajo representa el primer intento exitoso de determinar el contenido total de vitamina C no sólo en diferentes variedades de lechuga, sino también en algunos de sus parientes silvestres. La cuantificación de la vitamina C también es esencial para seleccionar lechugas con mayor actividad antioxidante dentro de los programas de reproducción. En este sentido, el aumento del contenido total de vitamina C en parientes silvestres de lechuga encontrados aquí y el aumento del contenido de AA reportado en estudios anteriores^14,así como otros compuestos antioxidantes²¹, amplía los candidatos adecuados para mejorar el valor nutricional de las lechugas.

En conclusión, incluso con algunas limitaciones inherentes a la naturaleza de la vitamina C, como su degradación gradual pocas horas después de ser extraído o la necesidad de una reacción de reducción debido a la baja absorción DE UV de DHAA, ofrece un método menos intenso en el trabajo de parto y un método menos lento para medir el contenido de vitamina C. Además, también es muy robusto y muestra una alta sensibilidad y potencia de resolución. Además, es fácilmente transferible no sólo a otros materiales vegetales con ligeros o ningún cambio, sino también a los productos procesados que suministran la ingesta dietética de vitamina C a los seres humanos, lo que da lugar a una amplia gama de aplicaciones futuras en el campo emergente de pruebas para una calidad alimentaria confiable.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-ditiotreitol (DTT) y ge; El 98% (Ellman ′ Roche 10197777001
10 mm Φ bola de acero inoxidable	Euro Aznar Supplies S.L.
Tubo de polipropileno de 15 mL para centrífuga	Deltalab	429946
vial ámbar de HPLC de 2 mL	Agilent	5190-9063
Jeringa de 2 mL con aguja	Deltalab	JS2
Tubos de polipropileno de 20 mL	Deltalab	202840
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (TRIS) ≥ 99,9% (valoración)	Roche	10708976001
50 mL tubo de polipropileno	Deltalab	429951
Ácido acético (CH3COOH) ≥ 99% de pureza glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, grado de súper gradiente de HPLC (99.9 + % CH3CN-0.2 y micro; m filtrado)	Chem-lab	CL00.0189
Columna Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 y micro; m)	Aguas	186003540
Vaso de precipitados 1 L, 200 mL	Deltalab	191725, 191722
Fosfato dipotásico (KH2PO4)	Panreac	766384	Solo en el protocolo no optimizado (Archivo complementario 2)
Ácido etilendiaminotetraacético Sal disódica (EDTA x 2H2O) Ensayo al 99-101%, reactivo ACS	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Ácido fórmico 98-100% para HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
liofilizador VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mezclador	Heidolph	na
Heidolph Reax mezclador superior	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipado con un eλ Detector	Hewlett Packard	na	Solo en el protocolo no optimizado (Archivo complementario 2)
Ácido clorhídrico (HCl) 37% de pureza, reactivo ACS	Sigma-Aldrich	320331
Ácido L-ascórbico ≥ 99%, reactivo ACS	Sigma-Aldrich 255564
ácido metafosfórico (MPA) reactivo ACS, chips, 33,5-36,5%	Sigma-Aldrich	239275
metanol ≥ 99.9% (grado de supergradiente de HPLC)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipetas 10-1000 μ L	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Columna trazadora (250 mm x 4 mm x 5 & m)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Solo en el protocolo no optimizado (Archivo complementario 2)Tapa
de silicona de PTFE con apertura	Agilent	5190-9067
Centrífuga refrigerada Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Filtros de celulosa regenerada 0.22 &; m (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Filtros de celulosa regenerada 0.45-µ m (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Solo en el protocolo no optimizado (Archivo suplementario 2)
Espectrofotómetro Heλ iOS y beta;	Thermo Scientific Corporation	na
Ácido sulfúrico (H2SO4) 95,0-98,0% de pureza, reactivo ACS	Sigma-Aldrich	258105
Agua ultrapura	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Matraces aforados 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC Clase H equipado con una PDA eλ Detector	de aguas	na