Artículo de método

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

DOI:

10.3791/61446

⸱

15 de mayo de 2020

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos el procedimiento paso a paso para cultivar y diferenciar las células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales, seguido de una serie de ensayos para caracterizar las células diferenciadas. Las células madre embrionarias de ratón E14 se utilizaron para formar cuerpos embrionarios a través del método de la gota colgante, y luego se indujeron a diferenciarse en células progenitoras neurales por ácido retinoico, y finalmente se diferenciaron en neuronas. Los experimentos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR) e inmunofluorescencia revelaron que los progenitores neurales y las neuronas exhiben marcadores correspondientes (nestina para los progenitores neurales y neurofilamento para las neuronas) en los días 8 y 12 después de la diferenciación, respectivamente. Los experimentos de citometría de flujo en una línea E14 que expresan un informador de GFP impulsado por el promotor Sox1 mostraron que aproximadamente el 60% de las células en el día 8 son GFP positivas, lo que indica la diferenciación exitosa de las células progenitoras neurales en esta etapa. Finalmente, se utilizó el análisis RNA-seq para perfilar los cambios transcriptómicos globales. Estos métodos son útiles para analizar la participación de genes y vías específicas en la regulación de la transición de la identidad celular durante la diferenciación neuronal.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desde su primera derivación de la masa celular interna de los blastocistos de ratón en desarrollo1,2,las células madre embrionarias de ratón (mESC) se han utilizado como herramientas poderosas para estudiar la autorrenovación y diferenciación de las células madre3. Además, el estudio de la diferenciación mESC conduce a una tremenda comprensión de los mecanismos moleculares que pueden mejorar la eficiencia y la seguridad en la terapia basada en células madre en el tratamiento de enfermedades como los trastornos neurodegenerativos4. En comparación con los modelos animales, este sistema in vitro proporciona muchas ventajas, incluida la simplicidad en la práctica y la evaluación, el bajo costo en el mantenimiento de las líneas celulares en contraste con los animales y la relativa facilidad en las manipulaciones genéticas. Sin embargo, la eficiencia y la calidad de los tipos de células diferenciadas a menudo se ven afectadas por diferentes líneas de mESCs, así como por los métodos de diferenciación5,6. Además, los ensayos tradicionales para evaluar la eficiencia de la diferenciación se basan en el examen cualitativo de genes marcadores seleccionados que carecen de robustez y, por lo tanto, no logran comprender los cambios globales en la expresión génica.

Aquí pretendemos utilizar una batería de ensayos para la evaluación sistemática de la diferenciación neuronal. Utilizando tanto análisis tradicionales in vitro en marcadores seleccionados como ARN-seq, establecemos una plataforma para medir la eficiencia de diferenciación, así como los cambios transcriptómicos durante este proceso. Basándonos en un protocolo previamente establecido7,generamos cuerpos embrioides (EB) a través de la técnica de gota colgante, seguida de la inducción utilizando cantidad suprafisiológica de ácido retinoico (AR) para generar células progenitoras neurales (NPC), que posteriormente se diferenciaron a neuronas con medio de inducción neural. Para examinar la eficiencia de la diferenciación, además de los ensayos tradicionales de RT-qPCR e inmunofluorescencia (IF), se realizó citometría de flujo y ARN-seq. Estos análisis proporcionan una medición exhaustiva de la progresión de la diferenciación específica de la etapa.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultura mESC

  1. Cubra una placa tratada con cultivo de tejidos de 10 cm con gelatina al 0,1% y deje que la gelatina se fije durante al menos 15-30 minutos antes de aspirarla.
  2. Semilla γ fibroblastos embrionarios de ratón irradiados (MEF) un día antes de cultivar las mESC en el medio mESC precalentado (medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con suero fetal bovino (FBS) al 15%), aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, LIF, PD0325901 (PD) y Chir99021 (CH)).
  3. Permita que los MEFs irradiados por γ se asienten y se adhieran a la superficie de la placa antes de cultivar las células E14.
  4. Descongele las ESC E14 en un baño de agua a 37 °C y transfiera rápidamente las células en un tubo cónico de 15 cm con medio mESC caliente. Peletizar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.
  5. Resuspender las células en 10 ml de medio mESC y colocar las células en la placa de cultivo que contiene los MEFs γ irradiados sembrados anteriormente. Incubar el cultivo celular en una incubadora de 37 °C bajo 5% de CO2.
  6. Para el pasaje de cultivo, aspire e el medio y lave la placa con 1x PBS estéril. Agregue suficiente tripsina al 0.05% para cubrir la superficie de la placa e incube a 37 ° C durante 3 min.
  7. Neutralizar la tripsina con medio mESC y pipeta para generar suspensión unicelular. Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.
  8. Cuente las células con un hemocitómetro o contador celular y siembre aproximadamente 5.0 x 105 células en una placa de cultivo de 10 cm.
  9. Resuspend las células en 10 ml de medio mESC, placa las células en la placa de cultivo de tejido recubierta de gelatina e incuba cultivos como se describió anteriormente.
    NOTA: Se recomienda que las mESCs se pasen cada 2 días para evitar que las células se diferencien en sus colonias. El rojo fenol en el medio funciona únicamente como un indicador de pH y dependiendo de la densidad celular, puede volverse amarillento (más ácido), antes de 2 días. Por lo tanto, puede ser necesario cambiar el medio todos los días. Los MEF irradiados por γ eventualmente morirán después de un par de pasajes.

2. EB, NPC y diferenciación neuronal

  1. Realice el protocolo de paso de cultivo mencionado anteriormente y cuente las células (pasos 1.7-1.10).
  2. Método de caída colgante (día 0)
    1. Para una placa de cultivo celular de 10 cm, cuente aproximadamente 2.5 x 104 células donde 5.0 x 102 células se suspenderán en un medio de diferenciación de 20 μL (DMEM con 15% de FBS, aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina / estreptomicina y piruvato de sodio). Aproximadamente cincuenta gotas de 20 μL que contienen las células se pueden enchapar en una placa de 10 cm.
    2. Alícuota el número apropiado de células, y luego centrifuga las células a 200 x g durante 3 min y retire el sobrenadante.
    3. Resuspender las células en el volumen apropiado del medio de diferenciación para una densidad celular de 5,0 x 102 células por 20 μL (por ejemplo, 2,5 x 104 células en 1 mL de medio de diferenciación).
    4. Usando una micropipeta o una pipeta repetidora, coloque gotas de 20 μL de la suspensión celular en la tapa de la placa de cultivo de tejidos. Asegúrese de que las gotas no estén demasiado cerca unas de otras para evitar que se fusionen.
      NOTA: Las gotas se pueden enchapar en una placa de fijación tratada con cultivo de tejidos o en una placa de suspensión, ya que se colocarán en la tapa y no en la placa en sí. Para un enfoque más factible y estéril, coloque las gotas en una placa de cultivo de tejido de fijación y transfiéralas a una placa de suspensión como se describe a continuación.
    5. Llene el plato con 5-10 ml de 1x PBS y vuelva a colocar cuidadosamente la tapa en el plato. Incubar el cultivo en la incubadora de 37 °C.
      NOTA: PbS se agrega a la placa de cultivo para evitar que las gotas se sequen.
  3. El día 2,use una micropipeta para recoger las gotas de la tapa y colóquelas en una placa de suspensión de cultivo celular de 10 cm llena de 10 ml de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en un agitador orbital que tiembla a baja velocidad en la incubadora.
  4. El día 4,para cosechar los EB, recolectar las células, centrifugar a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.
    NOTA: Los EB también se pueden lavar con 1x PBS según los requisitos de los experimentos posteriores.
  5. Para continuar el procedimiento e inducir la diferenciación EB en células progenitoras neurales (NPC), prepare el medio de diferenciación con ácido retinoico (AR) de 5 μM.
  6. Retire el medio viejo peletizando los EB a 100 x g durante 3 minutos o permita que los EB se asienten antes de aspirar el medio viejo. Añadir 10 ml del medio de diferenciación que contiene 5 μM de AR a la placa de cultivo.
  7. El día 6, reemplace al menos la mitad del medio con un medio fresco que contenga 5 μM ra inclinando la placa y canalizando el medio como se describió anteriormente.
    NOTA: Se recomienda que al menos la mitad del medio se reemplace con un medio fresco que contenga AR los días 5 y 7. Tome nota del indicador rojo fenol; si se vuelve amarillento, es mejor reemplazar todo el medio.
  8. El día 8,cosecha los NPC recolectando las células, centrifugando a 200 x g durante 3 min, y retirando el sobrenadante.
    NOTA: Los NPC también se pueden lavar con 1x PBS de acuerdo con las necesidades de los experimentos posteriores. Si es necesario, los NPC pueden congelarse y descongelarse nuevamente para su posterior cultivo y análisis. Si los NPC van a ser cultivados, la accutasa también se puede utilizar como una alternativa a la tripsina.
  9. Para continuar el procedimiento y diferenciar los NPC en neuronas, recoja los NPC en un tubo cónico de 15 ml por centrifugación, disocie con tripsina e incube a 37 °C durante 3 min. Pipetear los NPC para asegurarse de que todos los agregados de NPC estén disociados y neutralizar la tripsina con el medio.
  10. Filtrar las células con un colador de células de nylon de 40 μm y contar las células antes de enchaparlas a una densidad de 1,5 x10 5/cm2 en medio N2 (medio DMEM/F12 + 3 mg/ml de glucosa + 3 mg/ml de albúmina bovina rica en lípidos (LBSA) + suplemento de 1:100 N2 + 10 ng/mL de bFGF + 50 U/mL de pluma/estreptococo + 1 mM de L-glutamina) en una placa tratada con cultivo de tejidos para experimentos posteriores de PCR y western blot; o en una cámara de cultivo de tejidos para experimentos de inmunofluorescencia.
  11. El día 9,reemplace el medio antiguo por un medio N2 fresco.
  12. El día 10,cambie el medio N2 con medio N2 / B27 (50% DMEM / F12 y 50% basal neural, 3 mg / ml LBA, suplemento 1: 200 N2, suplemento 1: 100 B27, 50 U / ml pluma / estreptococo y 1 mM L-glutamina).
  13. En los días 11-12,cosecha las neuronas de la siguiente manera. Lave las células con 1x PBS, agregue tripsina e incube el cultivo en la incubadora de 37 °C durante 3 min antes de neutralizar la tripsina con medio y centrífuga a 200 x g durante 3 min.

3. Caracterización de mESCs y células diferenciadas

  1. Ensayo de fosfatasa alcalina (AP)
    1. Use un kit para evaluar la actividad de la fosfatasa alcalina (consulte la Tabla de materiales).
    2. Retire el medio de la placa de cultivo y lave los ESC con 1x PBS.
    3. Agregue 1 ml de la solución fija (consiste en formaldehído y metanol) provisto con el kit a la placa e incube a temperatura ambiente durante 2-5 min.
      NOTA: La sobreincubación en la solución fix puede comprometer la actividad de AP.
    4. Retire la solución fija, lave los ESC con 1x PBS y deje cierta cantidad de PBS en la placa.
      NOTA: Mantenga los ESC húmedos en PBS para no comprometer la actividad de AP.
    5. Prepare la solución AP mezclando las soluciones de sustrato A, B y C en una proporción de 1:1:1. Mezcle primero las soluciones A y B e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 2 minutos antes de agregar la solución C.
    6. Retire el PBS 1x y agregue la solución AP preparada anteriormente.
    7. Incubar los ESC durante unos 15 minutos en la oscuridad envolviendo la placa de cultivo con papel de aluminio o realizando el paso 3.5 en una habitación oscura.
    8. Controle la reacción y retire la solución de reacción cuando la solución se vuelva brillante para evitar manchas no específicas.
    9. Lave los ESC dos veces con 1x PBS.
    10. Evite que la muestra se seque cubriendo los ESC con 1x PBS o medio de montaje.
      NOTA: Aparecerá una mancha roja o púrpura para la expresión AP. La placa se puede almacenar en un refrigerador de 4 °C.
  2. RT-qPCR
    1. Recolecte células en varias etapas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y 2.4 para ESC y EB y NPC, respectivamente.
    2. Aislar el ARN utilizando ARN, ADN y solución de extracción de proteínas (ver Tabla de Materiales).
    3. Genere ADNc con un kit de transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales)y siga el manual del fabricante.
  3. Fijación e incrustación
    1. Coseche los EB y los NPC como se describió anteriormente (paso 2.6) y corríjalos con una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
    2. Retire el PFA y lave la muestra con 1x PBS durante 5 min.
    3. Coloque la muestra en una dilución en serie de 1x soluciones de PBS, 10%-, 20%-, y 30%-sacarosa a 25\u201228 °C donde la muestra se transfiere a la siguiente solución después de 30 min de incubación.
      NOTA: La muestra se puede almacenar en la solución de sacarosa al 30% a 4 °C antes de continuar con el paso de incrustación.
    4. Humedezca la punta de la pipeta con solución de sacarosa antes de colocar la muestra (sin apilarla) en el centro del criomolde y pipetee el exceso de líquido.
      NOTA: El papel de filtro también se puede utilizar para eliminar el exceso de solución. Mojar la punta de la pipeta con solución de sacarosa es importante para evitar que los EB y los NPC se peguen a las paredes de la punta.
    5. Agregue cuidadosamente la solución de temperatura de corte óptima (OCT) al molde sin volver a suspender las muestras y elimine el exceso de burbujas con una pipeta.
    6. Coloque el molde con la muestra en un mezclador de laboratorio a baja velocidad para agitar ligeramente la muestra durante 15 minutos. Esto ayuda a asentar los EB y NPC al fondo si se vuelven a suspender en la solución oct.
    7. Congele rápidamente la muestra colocando el molde en nitrógeno líquido o sobre hielo seco.
      NOTA: Las muestras se pueden almacenar en un congelador de -70 °C antes de continuar con el siguiente paso.
  4. Crioseccionado
    1. Ajuste el criostato para que se enfríe a -20 a -18 °C antes de transferir la muestra al instrumento.
    2. Separe el bloque de OCT congelado del molde y asegúrelo en el soporte con una pequeña solución de OCT colocada en la superficie del soporte.
    3. Alinee el bloque oct para que los EB y los NPC estén más cerca de la hoja para asegurarse de que la muestra no se pierda durante la sección.
    4. Separe cuidadosamente 10 μm del bloque y preste mucha atención a las rodajas que contienen la muestra.
    5. Coloque rápidamente la rebanada de OCT que contiene la muestra en el portaobjetos de vidrio que incrusta tejido y permita que las rebanadas de OCT se sequen al aire durante 1 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -70 °C para su uso posterior.
  5. Inmunofluorescencia (IF)
    1. Bloquee las secciones de OCT o las cámaras de cultivo que contienen neuronas en un 10% de suero de burro normal / 0.1% Triton X-100 en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
    2. Incubar las muestras en anticuerpo primario diluido en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante la noche a 4 °C.
    3. Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado.
    4. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios diluidos en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
    5. Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado y luego incube las muestras en 1 μg/mL DAPI.
    6. Monte las muestras con una funda y algún medio de montaje y deje que se seque.
    7. Observe las muestras bajo un microscopio de fluorescencia.
  6. Análisis de ARN-seq
    1. Recolecte las células en varias etapas y realice la extracción de ARN (ver paso 3.2).
    2. Preparar las bibliotecas de ADNc, realizar secuenciación profunda y análisis de datos según el protocolo descrito en Wang et al.8.
    3. Realice el análisis de Ontología Génica (GO) utilizando el paquete R, clusterProfiler.
  7. Citometría de flujo
    1. Recolecte escasiadas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y vuelva a suspender las células en medio. Recoge los EB y NPC siguiendo el paso 2.4 y vuelve a suspender las células en medio.
    2. Filtre la suspensión celular utilizando el colador de células de nylon de 40 μm en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    3. Mida la señal GFP de las muestras utilizando el citómetro de flujo (realizado por la instalación central de la institución).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como representación de nuestro método, realizamos un experimento de EB, NPC y diferenciación neuronal en células E14. Las células E14 se cultivaron en MEFs irradiados γ(Figura 1A)hasta que la población de MEF γ-irradiada se diluyó. Confirmamos la pluripotencia de las células E14 mediante la tinción de fosfatasa alcalina (AP)(Figura 1B)y posteriormente RT-qPCR (ver más abajo) para los marcadores Nanog y Oct4. Las células E14 libres de MEF irradi...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método para la diferenciación neuronal de las células madre embrionarias de ratón se ha establecido durante décadas y los investigadores han seguido modificando los protocolos anteriores o creando otros nuevos para diversos fines7,10,11. Utilizamos una serie de ensayos para analizar exhaustivamente la eficiencia y el progreso de las etapas de diferenciación de las mESCs a las neuronas, que pueden usarse en el análisis de otra...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Nos gustaría agradecer al Dr. Ryan Hobbs por la asistencia en la sección. Agradecemos las instalaciones centrales de Penn State College of Medicine, incluidas las Ciencias del Genoma y la Bioinformática, las Imágenes Avanzadas de Microscopía de Luz y la Citometría de Flujo. También agradecemos a la Dra. Yuka Imamura por la asistencia en el análisis de ARN-seq.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,05% Tripsina + 0,53mM EDTA 1XCorning25-052-CV
0,1% GelatinaSigmaG1890-100GPreparado en agua desionizada
16% ParaformaldehídoThermo Scientific28908Diluido en 1X PBS
40-μ filtro de célulasm Falcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 cabra anti-ratón IgG (H+L)InvitrogenA11001El anticuerpo se diluyó a 1:500 para el
kit de tinción de fosfatasa alcalina IF IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
Suplemento B27Thermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD 657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer Kit de ADN de alta sensibilidadAgilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
CloroformoC298-500Fisher Químico
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM/F12 medioThermo Fisher Scientific11320033
EB tampónQiagen19086
Etanol111000200PharmcoDiluido en agua desionizada
Suero fetal bovinoAtlanta Productos biológicosS10250
Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500 Sistema de secuenciaciónIlluminaSY-401-2501
IsopropanolBDH1133-4LGBDH VWR AnalíticoDiluido en agua desionizada
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030024
LIFN/AN/ARecolectado del sobrenadante MEF
m18srRNA cebadoresIDTDNAN/A5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
Aminoácidos no esencialesCorning25-025-Cl
cebadores mNanogIDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes imprimacionesIDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGTGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGTGAGGGGTGT-3'mNeuroD1
imprimacionesIDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
imprimacionesIDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
cebadoresIDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
suplemento Thermo Fisher Scientific17502048
Nestin anticuerpo primarioMilliporeMAB5326se diluyó a 1:200 para IF
Neural basalThermo Fisher Scientific
Anticuerpo primario de neurofilamentoDSHB2H3
NEXTflex Illumina Kit de preparación de biblioteca de secuenciación de ARN direccional rápidoBioO ScientificNOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
Penicilina/estreptomicinaCorning30-002-Cl
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)N/AN/APreparado en agua desionizada
- Cloruro de potasioP217-500GVWR
- Fosfato de potasio monobásico anhidro0781-500GVWR-
Cloruro de sodioBP358-10Fisher Bioreagents
- Fosfato de sodio, dibásico, heptahidratadoSX0715-1Milipore
Imprimación de hexámero aleatorioThermo ScientificSO142
Ácido retinoicoSigmaR2625Preparado en DMSO
Piruvato de sodioCorning25-000-Cl
SacarosaSigma84097Diluido en 1X PBS
SuperScript III Transcriptasa inversaInvitrogen18064022
Tissue-Tek O.C.T. compuestoSakura4583
Reactivo de aislamiento TriPureSigma-Aldrich11667165001
TruSeqRapid Illumina20020616
β-mercaptoetanolFisher BioReagentsBP176-100
21103049

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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