Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.
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Artículo de método
Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Describimos el procedimiento paso a paso para cultivar y diferenciar las células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales, seguido de una serie de ensayos para caracterizar las células diferenciadas. Las células madre embrionarias de ratón E14 se utilizaron para formar cuerpos embrionarios a través del método de la gota colgante, y luego se indujeron a diferenciarse en células progenitoras neurales por ácido retinoico, y finalmente se diferenciaron en neuronas. Los experimentos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR) e inmunofluorescencia revelaron que los progenitores neurales y las neuronas exhiben marcadores correspondientes (nestina para los progenitores neurales y neurofilamento para las neuronas) en los días 8 y 12 después de la diferenciación, respectivamente. Los experimentos de citometría de flujo en una línea E14 que expresan un informador de GFP impulsado por el promotor Sox1 mostraron que aproximadamente el 60% de las células en el día 8 son GFP positivas, lo que indica la diferenciación exitosa de las células progenitoras neurales en esta etapa. Finalmente, se utilizó el análisis RNA-seq para perfilar los cambios transcriptómicos globales. Estos métodos son útiles para analizar la participación de genes y vías específicas en la regulación de la transición de la identidad celular durante la diferenciación neuronal.
Introducción
Desde su primera derivación de la masa celular interna de los blastocistos de ratón en desarrollo1,2,las células madre embrionarias de ratón (mESC) se han utilizado como herramientas poderosas para estudiar la autorrenovación y diferenciación de las células madre3. Además, el estudio de la diferenciación mESC conduce a una tremenda comprensión de los mecanismos moleculares que pueden mejorar la eficiencia y la seguridad en la terapia basada en células madre en el tratamiento de enfermedades como los trastornos neurodegenerativos4. En comparación con los modelos a....
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Protocolo
1. Cultura mESC
- Cubra una placa tratada con cultivo de tejidos de 10 cm con gelatina al 0,1% y deje que la gelatina se fije durante al menos 15-30 minutos antes de aspirarla.
- Semilla γ fibroblastos embrionarios de ratón irradiados (MEF) un día antes de cultivar las mESC en el medio mESC precalentado (medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con suero fetal bovino (FBS) al 15%), aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, LIF, PD0325901 (PD) y Chir99021 (CH)).
- Permita que los MEFs irradiados por γ se asienten y se adhieran a la superficie de la placa antes de cultivar las células....
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Resultados
Como representación de nuestro método, realizamos un experimento de EB, NPC y diferenciación neuronal en células E14. Las células E14 se cultivaron en MEFs irradiados γ(Figura 1A)hasta que la población de MEF γ-irradiada se diluyó. Confirmamos la pluripotencia de las células E14 mediante la tinción de fosfatasa alcalina (AP)(Figura 1B)y posteriormente RT-qPCR (ver más abajo) para los marcadores Nanog y Oct4. Las células E14 libres de MEF irradi.......
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Discusión
El método para la diferenciación neuronal de las células madre embrionarias de ratón se ha establecido durante décadas y los investigadores han seguido modificando los protocolos anteriores o creando otros nuevos para diversos fines7,10,11. Utilizamos una serie de ensayos para analizar exhaustivamente la eficiencia y el progreso de las etapas de diferenciación de las mESCs a las neuronas, que pueden usarse en el análisis de otra.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Nos gustaría agradecer al Dr. Ryan Hobbs por la asistencia en la sección. Agradecemos las instalaciones centrales de Penn State College of Medicine, incluidas las Ciencias del Genoma y la Bioinformática, las Imágenes Avanzadas de Microscopía de Luz y la Citometría de Flujo. También agradecemos a la Dra. Yuka Imamura por la asistencia en el análisis de ARN-seq.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina + 0,53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0,1% Gelatina | Sigma | G1890-100G | Preparado en agua desionizada |
| 16% Paraformaldehído | Thermo Scientific | 28908 | Diluido en 1X PBS |
| 40-μ filtro de células | m Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 cabra anti-ratón IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | El anticuerpo se diluyó a 1:500 para el |
| kit de tinción de fosfatasa alcalina IF II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| Suplemento B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD 657338 | ||
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer Kit de ADN de alta sensibilidad | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Cloroformo | C298-500 | Fisher Químico | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medio | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB tampón | Qiagen | 19086 | |
| Etanol | 111000200 | Pharmco | Diluido en agua desionizada |
| Suero fetal bovino | Atlanta Productos biológicos | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sistema de secuenciación | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analítico | Diluido en agua desionizada |
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Recolectado del sobrenadante MEF |
| m18srRNA cebadores | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM |
| Aminoácidos no esenciales | Corning | 25-025-Cl | |
| cebadores mNanog | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes imprimaciones | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGTGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGTGAGGGGTGT-3'mNeuroD1 |
| imprimaciones | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4 |
| imprimaciones | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6 |
| cebadores | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2 |
| suplemento Thermo Fisher Scientific | 17502048 | ||
| Nestin anticuerpo primario | Millipore | MAB5326 | se diluyó a 1:200 para IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | ||
| Anticuerpo primario de neurofilamento | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Kit de preparación de biblioteca de secuenciación de ARN direccional rápido | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicilina/estreptomicina | Corning | 30-002-Cl | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | N/A | N/A | Preparado en agua desionizada |
| - Cloruro de potasio | P217-500G | VWR | |
| - Fosfato de potasio monobásico anhidro | 0781-500G | VWR- | |
| Cloruro de sodio | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Fosfato de sodio, dibásico, heptahidratado | SX0715-1 | Milipore | |
| Imprimación de hexámero aleatorio | Thermo Scientific | SO142 | |
| Ácido retinoico | Sigma | R2625 | Preparado en DMSO |
| Piruvato de sodio | Corning | 25-000-Cl | |
| Sacarosa | Sigma | 84097 | Diluido en 1X PBS |
| SuperScript III Transcriptasa inversa | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compuesto | Sakura | 4583 | |
| Reactivo de aislamiento TriPure | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq | Rapid Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoetanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
Referencias
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent....
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Reimpresiones y permisos
