Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.
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Artículo de método
Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones
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Resumen
Resumen
El sistema nervioso central (SNC) está regulado por una compleja interacción de células neuronales, gliales, estromales y vasculares que facilitan su correcta función. Aunque el estudio de estas células en aislamiento in vitro o juntos ex vivo proporciona información fisiológica útil; características destacadas de la fisiología de las células neurales se perderán en tales contextos. Por lo tanto, hay una necesidad de estudiar las células neuronales en su entorno in vivo nativo. El protocolo detallado aquí describe imágenes repetitivas in vivo de dos fotones de células neuronales en la corteza de roedores como una herramienta para visualizar y estudiar células específicas durante largos períodos de tiempo de horas a meses. Describimos en detalle el uso de la vasculatura cerebral groseramente estable como un mapa grueso o dendritas etiquetadas fluorescentemente como un mapa fino de regiones cerebrales seleccionadas de interés. Usando estos mapas como una clave visual, mostramos cómo las células neuronales se pueden reubicar con precisión para obtener imágenes in vivo repetitivas posteriores. Utilizando ejemplos de imágenes in vivo de microglia, neuronas y células NG2+ con etiqueta fluorescente, este protocolo demuestra la capacidad de esta técnica para permitir la visualización repetitiva de la dinámica celular en la misma ubicación cerebral durante largos períodos de tiempo, que puede ayudar aún más a entender las respuestas estructurales y funcionales de estas células en la fisiología normal o seguir insultos patológicos. Cuando sea necesario, este enfoque se puede acoplar a imágenes funcionales de células neuronales, por ejemplo, con imágenes de calcio. Este enfoque es especialmente una técnica poderosa para visualizar la interacción física entre los diferentes tipos celulares del SNC in vivo cuando están disponibles modelos genéticos de ratón o tintes específicos con etiquetas fluorescentes distintas para etiquetar las células de interés.
Introducción
El sistema nervioso central (SNC) se rige por una compleja interacción de interacciones entre varios tipos de células residentes, incluyendo neuronas, glia y células asociadas a vasos. Tradicionalmente, las células neurales se estudiaban en contextos aislados, co-cultivados1,,2,3,4,5 (in vitro) o de tejido cerebral extirpado (ex vivo)6,7,,8,9,10. Sin embargo, es necesario comprender mejor el comportamiento de las células neuronales y las interacciones en el entorno nativo del cerebro in vivo in vivo. En este protocolo, describimos un método para asignar regiones in vivo de interés y volver a escuchar con precisión esas regiones en futuras sesiones de imágenes para realizar un seguimiento de las interacciones complejas entre los distintos tipos de células CNS durante largos períodos de tiempo.
El desarrollo de enfoques de imagen in vivo ha proporcionado ganancias significativas para la comprensión adecuada de la función neuronal11,12,13,14,15. Específicamente, estos enfoques proporcionan varias ventajas sobre los enfoques tradicionales in vitro y ex vivo. En primer lugar, los sistemas de imágenes in vivo tienen componentes celulares y tisulares fisiológicamente relevantes, como la vasculatura, con todo el repertorio de interacciones celulares para proporcionar una comprensión completa de la fisiología de la red neuronal. En segundo lugar, los hallazgos recientes sugieren que cuando se eliminan de su entorno nativo, ciertas células neuronales (como la microglia) pierden características importantes de su identidad y, por lotanto,la fisiología16,17 que se pueden conservar en el entorno in vivo. En tercer lugar, los sistemas de imágenes in vivo proporcionan la oportunidad de realizar investigaciones longitudinales estables de semanas a meses para estudiar las interacciones celulares del SNC. Por último, dada la creciente evidencia de las contribuciones del sistema inmunitario periférico18,19 y el microbioma20,21 en la fisiología del SNC, los sistemas in vivo proporcionan una plataforma para interrogar tales contribuciones y efectos en las células del SNC. Por lo tanto, los enfoques que emplean imágenes in vivo longitudinales para estudiar la fisiología neuroinmune y las interacciones en estados sanos, lesionados y enfermos son una gran adición complementaria a los enfoques tradicionales.
En este protocolo, describimos un enfoque confiable para la imagen de diferentes tipos de células en el cerebro, incluyendo microglia, neuronas y NG2+ células como ejemplos. Se han desarrollado dos enfoques para visualizar las células neuronales in vivo: el enfoque del cráneo adelgazado y el cráneo abierto con un enfoque craneal de la ventana. Aunque los enfoques del cráneo adelgazado están en uso y son preferidos porque superan algunas de las desventajas del enfoque del cráneo abierto, como la activación de células gliales, la dinámica de la columna vertebral más alta que fisiológica y el uso de agentes antiinflamatorios22,,23,,24,,25,los enfoques del cráneo adelgazado también muestran algunos inconvenientes críticos. En primer lugar, el procedimiento de adelgazamiento es un procedimiento muy delicado que muchos investigadores encuentran difícil de perfeccionar, especialmente cuando es necesario volver a adelgazar. Este es el caso porque a menudo es difícil para los experimentadores determinar que han adelgazado el cráneo a una profundidad de 20 m. En segundo lugar, para las comparaciones adecuadas entre ratones, el adelgazamiento tendría que ser idéntico y una variedad de éxito de adelgazamiento entre sesiones de diagnóstico por imágenes o ratones podría complicar la visualización de las estructuras neuronales. En tercer lugar, cuando se emplean para imágenes longitudinales, los animales con cráneos adelgazados sólo se pueden utilizar para un número limitado de sesiones cuando se emplea el re-adelgazamiento del cráneo. En adelante, dado que todavía queda parte del tejido óseo, la claridad en profundidad de las imágenes podría verse comprometida a partir del enfoque del cráneo adelgazado, lo que permite una gran visualización de las regiones más superficiales pero no tan profundas. A la luz de esto, las estructuras cerebrales más profundas, como el hipocampo, no se pueden imaginar con éxito con el enfoque del cráneo adelgazado. Estas consideraciones plantean la necesidad de enfoques alternativos y complementarios que puedan superar estas preocupaciones.
Alternativamente al enfoque del cráneo adelgazado, el enfoque de implantación de la ventana del cráneo abierto utiliza un procedimiento en el que el cráneo se reemplaza con un cubreobjetos de vidrio ópticamente transparente. Esto permite un número casi ilimitado de sesiones de imágenes. Además, dado el reemplazo del cráneo por el cubreobjetos de vidrio, este método permite una ventana de visualización clara de células cerebrales etiquetadas fluorescentemente durante largos períodos de tiempos de horas a meses y, por lo tanto, se puede emplear para estudiar la actividad celular y las interacciones que son relevantes para la fisiología, el envejecimiento y la patología.
En general, detallamos los pasos que se pueden seguir para implantar ventanas craneales crónicas a través de una craneotomía estereotaxica que permite la toma de imágenes in vivo de las regiones cerebrales de interés. También describimos cómo la vasculatura cerebral muy estable o las dendritas etiquetadas fluorescentemente podrían utilizarse para generar un mapa grueso o fino, respectivamente de las regiones cerebrales de interés. Este enfoque se puede utilizar para imágenes repetidas durante varias sesiones. La importancia de esta técnica, por lo tanto, radica en su capacidad para imaginar los cambios a largo plazo o éxtasis en los elementos cerebrales, incluyendo la disposición, morfología, y las interacciones de los diferentes tipos celulares.
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Protocolo
Todos los pasos están de acuerdo con las pautas establecidas y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal de la Universidad de Virginia.
1. Preparación del ratón para la implantación de ventanas craneales
NOTA: Varias líneas transgénicas del ratón con etiquetas florescentes son adecuadas para la toma de imágenes.
- Utilice ratones CX3CR1GFP/+ 26 para visualizar la microglia in vivo. Por lo general, se utilizan ratones juveniles a adultos jóvenes de 4 a 10 semanas de edad que pesan 17-25 g.
NOTA: Aunque, este enfoque es incluso apto para ratones pre-destetados, la necesidad de devolver los ratones a su jaula con sus madres para la alimentación, puede complicar la recuperación si la madre no cuida adecuadamente a los cachorros después de la cirugía. Por lo tanto, se recomienda el uso de ratones después del destete. - Anestesar el ratón usando isoflurano (5% de flujo de oxígeno para la inducción durante 1 min) en una cámara anestésica. Compruebe que el ratón no muestre ningún movimiento o respuestas de contracción a los pellizcos de los dedos del dedo del dedo del y/o de la cola. Saca el ratón de la cámara y al aire libre afeita bien el cabello de la cabeza entre las orejas desde aproximadamente el nivel de los ojos hasta la parte superior de la región del cuello usando un recortador de cabello.
NOTA: La concentración de isoflurano utilizado dependería del tamaño de la cámara de inducción. Por lo tanto, para cámaras más pequeñas, el isoflurano del 3-4% se puede utilizar para inducir eficazmente la anestesia, mientras que las cámaras más grandes requerirán hasta un 5%. - Mueva el ratón al cono nasal de la estación de cirugía estereotáctica para anestesia (1,5-2% para el mantenimiento de la cirugía), estabilice la cabeza con barras para los oídos y mantenga el ratón en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo caliente.
- Lubricar ambos ojos con pomada en los ojos. Inyectar 100 l de 0,25% de bupivicaína (para proporcionar analgesia local al ratón que durará 8-12 h) y 100 l de dexametasona de 4 mg/ml (para reducir la inflamación que puede resultar del procedimiento de cirugía) subcutánea en el lugar de la incisión. Deje que el ratón se siente durante al menos 5 minutos antes de pasar al siguiente paso.
- Limpie la cabeza afeitada con tres hisopos alternos de betadina y un 70% de alcohol. Haga una incisión del cuero cabelludo de línea media utilizando cuchilla quirúrgica o tijeras que se extienden desde la parte posterior de la región del cráneo entre las orejas hasta el área frontal entre los ojos. La piel restante se corta para exponer el cráneo.
- Limpie el tejido conectivo situado entre el cuero cabelludo y el cráneo subyacente con un 3% de peróxido de hidrógeno (H2O2)y localice el área del cerebro a tomar imágenes con coordenadas estereotácticas.
NOTA: A menudo hay algo de sangrado (paso 1.5) de la incisión en la superficie del cráneo. Este sangrado generalmente se resuelve por sí mismo dentro de 3-5 min. La limpieza con el peróxido ayuda. También se observa un tratamiento previo con bupivacaína (paso 1.4) para limitar la cantidad de sangrado durante este tiempo.
2. Cirugía de implantación de ventanas craneales de ratón
- Taladre una abertura circular de 4 mm en el cráneo utilizando una broca dental (0,7 mm de diámetro de la punta) y retire cuidadosamente esta parte del cráneo utilizando fórceps puntiagudos. Para tomar imágenes de la corteza somatosensorial de ratones de 6-8 semanas de edad, localice el centro de la craneotomía en -2.5 posterior y de 2.0 laterales al bregma. Durante la perforación, humedezca regularmente el cráneo con solución salina estéril y hisopos de algodón para enfriar el cerebro, limpiar los restos óseos y suavizar el hueso del cráneo para su eliminación final.
NOTA: Las coordenadas de la craneotomía variarían dependiendo de la región de interés y la edad de los ratones. - Después de retirar el cráneo, coloque cuidadosamente una pequeña cubierta (tamaño #0 de 0,1 x 0,02 mm de espesor) humedecida con solución salina en la craneotomía. Seque el exceso de solución salina con una toallita estéril.
- Usando un aplicador puntiagudo (como una punta de pipeta o el extremo puntiagudo de un palo de hisopo de algodón de madera roto), aplique pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana y permita que se adhiera al cerebro y al cráneo. Aplicar el pegamento de imprimación al resto del cráneo y curarlo con una luz de curado durante 20-40 s. Preparar un pozo alrededor de la ventana con el pegamento final y curar con una luz de curado para 20-40 s.
- Pega una pequeña placa de cabeza en el cráneo en el hemisferio contralateral de la craneotomía primero con el pegamento de imprimación como imprimación y luego con el pegamento final. Curar ambos con la luz de curado durante 20-40 s cada uno.
NOTA: Las suturas no son necesarias si el cráneo está totalmente cubierto con el pegamento durante este procedimiento.
3. Atención post-cirugía
- Permita que el ratón se despierte en ausencia de anestesia (la recuperación realizada en una almohadilla de calentamiento acorta el tiempo de recuperación) y vuelva a su jaula de casa una vez completamente despierto. Inyectar una dosis subcutánea de buprenorfina SR (0,5 mg/kg) como analgesia postoperatoria suficiente para 72 h.
- Para facilitar una recuperación saludable de la cirugía, proporcionar al ratón un alimento suave extra, que puede ser en forma de comida sólida regular en agua para suavizar la comida o alimentos en forma de un gel.
NOTA: Una provisión única de los alimentos blandos inmediatamente después de la cirugía es suficiente. - Monitoree el ratón diariamente para la salud y la recuperación adecuada para las primeras 72 h del procedimiento de cirugía. Después, realice imágenes desde tan solo 2 semanas desde la cirugía de implantación de ventanas.
NOTA: Si se hace bien, los ratones se recuperan bien mostrando comportamientos ambulatorios normales, suficiente exploración de jaulas, buena hidratación, aumento de peso estable e interacciones extensas con otros ratones en la jaula y otros artículos en la jaula. Los ratones que muestran letargo, deshidratación y más del 10% de pérdida de peso después de la cirugía son eutanasiados y eliminados del estudio.
4. Mapeo cerebral de dos fotones para imágenes iniciales
- Anestfetizar el ratón (isoflurano, 5 % de inducción y 1,5 % de mantenimiento). Estabilice la cabeza con tornillos para montar la placa frontal en la etapa del microscopio de dos fotones, manteniendo en una placa calefactora a 35 oC. Inyectar por vía intraperitoneal 100 ml de tinte para los vasos sanguíneos como Rhodamine B (2 mg/ml).
NOTA: Las imágenes también se pueden hacer en ratones despiertos sin anestesia. Sin embargo, estudios recientes indican que la anestesia afecta a la dinámica de vigilancia microglial27,28,29 y que la fijación de la cabeza para dos imágenes de fotones en ratones despiertos aumenta el estrés incluso durante la toma de imágenes crónicas durante al menos 25 días (ver Juczewski et al., 2020)30. - Limpie suavemente la superficie de la ventana craneal con un hisopo de algodón en un 70% de etanol. Ponga unas gotas de agua o solución salina en la ventana craneal y baje la lente objetivo en la solución ya que el objetivo es una lente de inmersión.
- Dibuje a mano un mapa grueso para denotar los principales puntos de referencia de los vasos sanguíneos en un cuaderno de laboratorio mientras mira a través del ocular por epiflorescencia. Utilice este dibujo para identificar las regiones específicas durante dos imágenes de fotón. Alternativamente, tome fotos de los vasos sanguíneos ya sea a través de una cámara instalada en el microscopio o a través de una cámara de mano o teléfono.
NOTA: Estas imágenes y imágenes dibujadas a mano son para facilitar la revisión de las mismas regiones anchas bajo el microscopio antes de dos imágenes de fotones. No se trata de una asignación de imágenes precisa. - Bajo dos imágenes de fotones, recoger imágenes de células florescentes y vasos según sea necesario. Tome notas cuidadosas con las coordenadas adecuadas para asegurarse de que las regiones precisas se pueden revisar para la toma de imágenes posteriores. Recopile varios campos de visión en esta sesión inicial de imágenes, por ejemplo, adquiera imágenes de la pila z cada 1-2 m a través de un volumen de tejido.
NOTA: Al recopilar imágenes por dos fotónicos, los puntos de referencia de los vasos sanguíneos se utilizan para el mapeo grueso. Si se necesita una asignación fina, se utilizan dendritas etiquetadas por YFP de ratones Thy1-YFP31.- Utilice estos parámetros recomendados para la toma de imágenes: una longitud de onda de 880-900 nm es óptima; para la excitación GFP y/o dsRed / Rhodamine, se utilizan un espejo dicroico de 565 nm con filtros de emisión de 525/50 nm (canal verde) y 620/60 nm (canal rojo); para la separación de GFP y YFP, se utiliza un espejo dicroico de 509 nm con filtros de emisión de 500/15 y 537/26 nm; el poder en el cerebro se mantiene a 25 mW o menos; La resolución de la imagen es de 1024 x 1024 píxeles, el campo de visión tomado con un objetivo de 25X 0,9 NA a un factor de zoom de 1,5X es de 295,24 x 295,24 m.
- Al final de la toma de imágenes, saque el ratón del escenario, permita que se despierte de la anestesia y regrese a su jaula doméstica hasta una futura sesión de diagnóstico por imágenes.
5. Imágenes de dos fotones y re-imagen
- Para futuras sesiones de diagnóstico por imágenes posteriores, que podrían ser en cualquier lugar de unas pocas horas a meses después de la sesión inicial de imagen, anestesiar el ratón (isoflurano, 5% de inducción y 1,5% de mantenimiento), montar en el microscopio de dos fotones, mantener en una placa de calentamiento e inyectar 100 l de un tinte de los vasos sanguíneos como Rhodamine B (2 mg/ml).
- Abra las imágenes previamente obtenidas en ImageJ y, utilizando estas imágenes, así como las notas de la sesión anterior, identifique las áreas previamente imagen y vuelva a ser cuidadosamentelas.
- Repita esto mientras la ventana de imágenes esté clara o como esencial para la extensión del estudio.
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Resultados
Para visualizar la dinámica microglial in vivo, se utilizaron ratones transgénicos dobles transgénicos CX3CR1GFP/+:Thy1YFP. La línea Thy1-YFP H se utiliza en comparación con la línea Thy1-GFP M para evitar la superposición de florescencia de microglia (GFP) y neuronas (YFP). Los enfoques alternativos podrían utilizar una línea de reportero en la que la microglia se etiqueta con, por ejemplo, tdTomato y luego se puede utilizar la línea Thy1-GFP M. Un inconveniente de la línea H es que YFP etiqueta un...
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Discusión
El advenimiento de las imágenes in vivo de dos fotones ha abierto oportunidades para explorar la plétora de interacciones celulares y dinámicas que ocurren en el cerebro sano. Los estudios iniciales se centraron en el uso del enfoque de craneotomía del cráneo abierto para la imagen de las dendritas neuronales por imágenes agudas y crónicas37,,38. Esto también se puede utilizar para dilucidar interacciones neuroinmunes en el cerebro. Este protocolo describe un mét...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Eyo por discutir las ideas presentadas en este manuscrito. Agradecemos al Dr. Justin Rustenhoven del Laboratorio Kipnis de la Universidad de Virginia por el regalo de ratones NG2DsRed 33. Este trabajo es apoyado por la financiación del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares del Instituto Nacional de Salud a la U.B.E (K22 NS104392).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cubreobjetos (3 mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Pegamento de cianoacrilato (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Taladro dental | Osada: www.osadausa.edu | Broca EXL-M40 | |
| Fine Science Tools | #19008-07 | ||
| Ungüento para los ojos | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (pegamento de imprimación) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Pegamento Evoflow (Pegamento final) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon |
Referencias
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