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Artículo de método

Activación forzada de ARN potenciadores in situ a través del sistema mediador de activación sinérgica dCas9

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DOI:

10.3791/61460

⸱

5 de junio de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, 2Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los ARN potenciadores (ARNe) son ARN no codificantes producidos a partir de potenciadores activos. Un enfoque óptimo para estudiar las funciones del ARNe es manipular sus niveles en las regiones nativas de la cromatina. Aquí presentamos un sistema robusto para estudios de ARNe mediante el uso de activadores transcripcionales fusionados con CRISPR-dCas9 para inducir la expresión de ARNs de interés.

Resumen

Los potenciadores son elementos genómicos fundamentales dispersos por el genoma de los mamíferos y dictan programas de expresión génica específicos de tejidos. Cada vez hay más pruebas de que los potenciadores no solo proporcionan motivos de unión al ADN para los factores de transcripción (TF), sino que también generan ARN no codificantes que se denominan ARNe. Los estudios han demostrado que las transcripciones de ARNe pueden desempeñar un papel importante en la regulación génica tanto en la fisiología como en la enfermedad. Los métodos comúnmente utilizados para investigar la función de los ARNe se limitan a enfoques de "pérdida de función" por la eliminación de los ARNe o por inhibición química de la transcripción del potenciador. No ha habido un método sólido para llevar a cabo estudios de "ganancia de función" de los ARNe para imitar enfermedades específicas como el cáncer humano, donde los ARNe a menudo se sobreexpresan. Aquí, presentamos un método para activar de manera precisa y robusta los eRNAs para la interrogación funcional de sus roles mediante la aplicación del sistema de Mediadores de Activación Sinérgica (SAM) mediado por dCas9. Presentamos todo el flujo de trabajo de la activación del eRNA, desde la selección de los eRNAs, el diseño de los gRNAs hasta la validación de la activación del eRNA mediante RT-qPCR. Este método representa un enfoque único para estudiar el papel de un ARNe en particular en la regulación génica y el desarrollo de enfermedades. Además, este sistema puede emplearse para el cribado CRISPR no sesgado con el fin de identificar objetivos de ARNe impulsores del fenotipo en el contexto de una enfermedad específica.

Introducción

El genoma humano contiene una constelación de elementos reguladores 1,2,3. Entre estos, los potenciadores emergen como una de las categorías más críticas 4,5,6. Los potenciadores desempeñan un papel esencial en la regulación del desarrollo y son responsables de generar programas de expresión génica espacio-temporal para determinar la identidad celular 5,6,7. Convencionalmente, los potenciadores solo se consideran elementos de ADN que proporcionan motivos de unión para los factores de transcripción (TF), que luego controlan la expresión génica diana 6,8. Sin embargo, una serie de estudios encontró que muchos potenciadores activos también transcriben ARN potenciadores no codificantes (es decir, ARNe)4,9,10.

Se encontró que el nivel de transcripción de eRNA se correlaciona con la actividad de un potenciador 4,10. Los potenciadores activos producen más transcripciones de eRNA y muestran niveles más altos de marcadores epigenómicos asociados con la transcripción activa, como H3K27ac y H3K4me1 9,11,12. Algunos estudios han demostrado que los transcritos de ARNe pueden desempeñar un papel importante en la activación transcripcional de los genes diana10,12. Se identificó un gran número de ARNe desregulados en cánceres humanos 13,14,15,16, muchos de los cuales mostraron una alta especificidad de tipo de cáncer y relevancia clínica. Estos hallazgos brindan oportunidades de que la elucidación de eRNAs que pueden impulsar/promover la tumorigénesis puede ofrecer nuevos objetivos para la intervención terapéutica13,15.

Los métodos actuales para estudiar las funciones del ARNe se basan casi exclusivamente en estrategias de derribo que utilizan ARN de interferencia pequeños (siRNA), ARN de horquilla corta (shRNA) u oligonucleótidos antisentido (ASO), de los cuales los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) son el tipo comúnmente utilizado en la investigación)10,12,17. Sin embargo, las enfermedades humanas como el cáncer muestran predominantemente una sobreexpresión de ARNe en comparación con su tejido normal adyacente15, lo que exige herramientas para "sobreexpresar" ARNs para imitar sus patrones de expresión relevantes para la enfermedad para los estudios funcionales. Para lograr esto, un sistema de sobreexpresión ectópica basado en plásmidos no es óptimo porque los sitios exactos de inicio y finalización de la transcripción de los ARNe siguen siendo en gran medida inciertos. Además, un sistema de expresión de plásmidos puede alterar la ubicación de los ARNe, causando posibles artefactos de sus funciones18. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para facilitar la caracterización funcional de los eRNAs mediante la aplicación de su "sobreexpresión" en el locus genómico nativo de su producción (es decir, in situ), que se basa en el Sistema de Mediadores de Activación Sinérgica (SAM) CRISPR/dCas9.

El sistema SAM se desarrolló inicialmente para activar genes codificantes y ARN intergénicos largos no codificantes (lincRNAs) asociados con la resistencia a inhibidores de BRAF en células de melanoma19. A diferencia de otras tecnologías de activación CRISPR (CRISPRa), el sistema SAM consiste en una combinación de activadores de transcripción para conferir una activación transcripcional robusta de las regiones objetivo. Estos activadores incluyen: un Cas9 enzimáticamente muerto (dCas9) fusionado con VP64 (es decir, dCas9-VP64); un ARN guía que contiene dos aptámeros de ARN MS2 y una proteína activadora de fusión MS2-p65-HSF1. La presencia de los aptámeros MS2 en el ARNg puede reclutar la proteína de fusión MS2-p65-HSF1 en las proximidades de los sitios de unión de dCas9/ARNg. Entre estos, VP64 es un tetrámero diseñado del dominio activador transcripcional VP16 del herpes simple, que se ha demostrado que activa fuertemente la transcripción génica mediante el reclutamiento de factores de transcripción generales 20,21,22. La proteína de fusión MS2-p65-HSF1 consta de tres partes. La primera parte, la MS2-N55K, es una forma mutante de la proteína de unión a MS2 que tiene una afinidad23 más fuerte; las otras dos partes de esta proteína de fusión son el dominio de transactivación de p65 y el factor de choque térmico 1 (HSF1), ambos factores de transcripción que poseen fuertes dominios de transactivación y pueden inducir programas de transcripción robustos24,25. Por lo tanto, el sistema SAM creó esencialmente un complejo activador altamente potente para activar la transcripción de genes codificantes designados y lincRNAs19.

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Protocolo

En la Figura 1 se muestra todo el flujo de trabajo de este protocolo.

1. Selección de ARN potenciador (eRNA)

  1. Identifique una región potenciadora putativa de interés mediante el uso de picos de unión de datos de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq), es decir, de modificaciones de histonas (p. ej., H3K4me1 y H3K27ac), o de coactivadores de transcripción (p. ej., p300).
  2. Identifique el ARNe de interés intersectando el pico de ChIP-Seq con señales de RNA-seq (por ejemplo, de RNA-seq total o de RNA-seq naciente, como la secuenciación global de corrida (GRO-Seq).
    NOTA: La región elegida para el diseño de los ARNg debe limitarse generalmente a la región del "núcleo potenciador", donde los TF o coactivadores (por ejemplo, p300) mostraron picos claros de ChIP-seq (Figura 2A). El dCas9 y sus coactivadores de fusión serán reclutados por un ARNg a esta región para imitar la unión nativa de los coactivadores (Figura 2A). Si se dispone de conjuntos de datos específicos, como el Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 o el GRO-cap26, se pueden utilizar para determinar con precisión el "núcleo potenciador", la región entre dos sitios de inicio de la transcripción de los ARNe transcritos en direcciones opuestas 4,10,26.

2. Diseño de ARNg

  1. Utilice herramientas comunes de diseño de ARNg CRISPR, como CRISPOR27 , para seleccionar ARNg con bajo potencial de desorientación (http://crispor.tefor.net/).
    NOTA: Otras herramientas como Benchling28 o CHOPCHOP29 también se pueden utilizar como opciones adicionales para el diseño de ARNg.
  2. Pegue la secuencia de ADN del núcleo potenciador en la columna Paso 1 en el sitio web de CRISPOR, luego haga clic en el botón desplegable para elegir el genoma correspondiente (por ejemplo, humano) en la columna Paso 2 . Haga clic en el botón desplegable para establecer la secuencia de motivos adyacentes del protoespaciador (PAM) como "NGG" en la columna del Paso 3 y luego haga clic en el botón "Enviar" para generar secuencias de guía con una longitud de 20 pb.
  3. Elija las guías con las puntuaciones de especificidad más altas en la herramienta CRISPOR, es decir, con un bajo potencial fuera del objetivo, y luego agregue "CACCG" al extremo 5' y "C" al extremo 3', respectivamente.
    NOTA: Seleccione las guías con las puntuaciones de especificidad más altas (>85 en CRISPOR es preferible).
  4. Ordene oligonucleótidos para cada secuencia de sentido y antisentido de fuentes comerciales.
    NOTA: En otros estudios se pueden encontrar instrucciones adicionales sobre el diseño de ARNg CRISPR/Cas9 30,31. Los voladizos en el paso 2.2 harán que el ARNg sea compatible con la columna vertebral del ARNg SAM (Addgene #61427), que utiliza la enzima de restricción BsmBI.

3. Clonar ARNg en una construcción lentiviral

  1. Para recocer los oligonucleótidos, mezcle 1 μL de cada oligonucleótido emparejado a 100 μM, 1 μL de tampón de ligadura T4 10x, 0,5 μL de ADN ligasa T4 (400.000 unidades/mL) y 6,5 μL deH2O para alcanzar un volumen total de 10 μL. Incubar a 37 °C durante 30 min, luego a 95 °C durante 5 min, y bajar a 25 °C a 5 °C/min. Diluir a 100 μL usando H2O.
  2. Digiera la columna vertebral del ARNg mezclando 2 μL de tampón de enzima de restricción (RE) 10x, 300 ng de plásmido de columna vertebral de lenti_gRNA(MS2)_zeo (Addgene #61427) en 1 μL, 1 μL de enzima BsmBI y 16 μL de H2O para alcanzar un volumen total de 20 μL. Incubar a 55 °C durante 15 min.
  3. Mezcle los componentes de ligadura con 20 μL de producto de digestión añadiendo 2,5 μL de tampón de ligadura T4 10x, 1 μL de producto de recocido diluido y 1,5 μL de ADN ligasa T4 (400.000 unidades/mL) en un sistema de 25 μL. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  4. Transforme 2 μL de la mezcla de ligadura del paso 3.3 en células E. coli competentes para Stbl3. Colocarlos en una placa de agar LB de ampicilina e incubar durante la noche a 37 °C.
  5. Elija e inocule una sola colonia de bacterias y extraiga el plásmido. Envíelo para la secuenciación de Sanger para confirmar que la secuencia de ARNg se insertó correctamente.
    NOTA: Las secuencias de los cebadores y los ARNg están disponibles en la Tabla Suplementaria 1. Se recomienda el uso de células Stbl3 de E. coli químicamente competentes aquí porque tienen un mayor rendimiento de ADN plasmídico y una mayor estabilidad del plásmido cuando generan plásmidos de lentivirus propensos a la inestabilidad32.

4. Prueba de eficiencia de ARNg

NOTA: Aunque puede que no sea necesario para todos los ARNg, se recomienda que los investigadores examinen la calidad del ARNg mediante la realización de un ensayo Surveyor (es decir, un ensayo de escisión de desajustes) para detectar indels o mutaciones que solo pueden ser generadas de manera eficiente por ARNg de buena calidad33,34. Otros métodos, como el seguimiento de indels por descomposición (TIDE), también se pueden utilizar para determinar la eficiencia del ARNg30,35. La nucleasa topógrafa es un miembro de una familia de endonucleasas específicas de desajustes que pueden cortar ADN de doble cadena con discordancias (Figura 3A). La calidad de los ARNg puede ser revelada por la eficacia de producir especies de ADN más pequeñas. En la práctica, la eficacia del corte del topógrafo también puede verse afectada por la eficiencia de transfección de los ARNg y Cas9.

  1. Transfecte el ARNg junto con el plásmido pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988) que expresa la proteína Cas9 en células 293T utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos. Utilice 1,2 μg/mL para cada plásmido por pocillo en una placa de 6 pocillos. Continúe cultivando las células durante 3 días después de la transfección. Recolectar y extraer ADN genómico según el protocolo del fabricante36.
  2. Utilice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la región potenciadora objetivo del ADN genómico. Utilice las condiciones de PCR que se muestran en la Tabla complementaria 2. Utilice los cebadores de la Tabla Suplementaria 1 para un ejemplo de potenciador, NET1e. Desnaturalice los productos de PCR incubándolos a 95 °C durante 10 minutos y vuelva a hibridarlos disminuyendo de 95 °C a 25 °C a una velocidad de -0,3 °C/s para permitir que el ADN monocatenario (ssDNA) con y sin indels o mutaciones inducidas por ARNg se recocen entre sí.
  3. Digiera el ADN hibridado por la nucleasa Surveyor (Figura 3A) siguiendo el protocolo del fabricante37. Mezcle 400 ng de ADN hibridado del paso 4.2, 1 μL de nucleasa Surveyor, 1 μL de potenciador Surveyor y 5 μL de 0,15 M MgCl2 en un sistema de 50 μL. Incubar a 42 °C durante 60 min. Analiza el ADN de un gel de agarosa. Utilice el control negativo, como las células con Cas9 solo pero sin ARNg dirigidos, en el ensayo y la electroforesis en gel (Figura 3B).

5. Generación de lentivirus

  1. Agregue psPAX2, pMD2.G y un plásmido objetivo (por ejemplo, lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425; o lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) en la proporción de 3 μg : 1 μg : 4 μg en un tubo de polipropileno de 1,5 mL. Mezclarlos con 500 μL de Opti-MEM e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  2. En un tubo aparte, ponga 10 μL del reactivo de transfección a base de lípidos en 500 μL de Opti-MEM e incube durante 5 min a temperatura ambiente.
  3. Combine los productos de los pasos 5.1 y 5.2 e incube durante 20 min a temperatura ambiente.
  4. Coloque las células 293T un día antes de la transfección y déjelas alcanzar una confluencia de ~30% en una placa de 10 cm en el momento de la transfección. Agregue 4 mL de medio regular (DMEM con 10% de FBS), luego agregue el complejo del paso 5.3 gota a gota a las celdas. Agregue DMEM con 10% de FBS para hacer que el volumen final sea de hasta 6 mL. Incubar durante la noche en una incubadora de celdas a 37 °C con 5% de CO2.
  5. Al día siguiente, cambie el medio a 10 mL de DMEM nuevo con 10% de FBS. Cosechar el medio 24 h después del cambio de medio. Utilice un filtro de jeringa (por ejemplo, 0,45 μm) para filtrar el medio que contiene el virus y, a continuación, continúe con el paso 6 o almacene el virus a -80 °C.
    NOTA: Las operaciones de Lentivirus requieren un gabinete de BioSafety Nivel II. Se debe tener precaución para manejar de manera segura los experimentos asociados con el virus; Y si algún recipiente tiene contacto directo con el medio viral, debe blanquearse durante más de 20 minutos antes de desecharlo por ser de riesgo biológico.

6. Cultivo celular

  1. Mantener las células en una incubadora de cultivo celular de CO2 a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Cultivo de células MCF7 y 293T en el medio Eagle Medium Modified Eagle (DMEM) de Dulbecco con 10% de FBS.
  3. Cultive las células en platos de 10 cm y divídalas en una proporción de 1:3 a 1:5 cuando estén confluentes.

7. Infección y selección celular

  1. Siembre las células objetivo (por ejemplo, MCF7) directamente en una mezcla de medio viral que contenga 0,5 mL de lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) y 0,5 mL de lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426). Añadir 8 μg/mL de bromuro de hexadimetrina para aumentar la eficacia de la infección. Utilice un pocillo de células no infectadas como control negativo para examinar la eficacia de la selección de antibióticos.
    NOTA: La cantidad de medio viral se recomienda de la siguiente manera: 6 mL de medio viral para un plato de 10 cm, 1 mL para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 0,5 mL para un pocillo de una placa de 12 pocillos.
  2. A las 24 h después de la infección, añadir a las células un medio fresco que contenga blasticidina (5 μg/mL para las células MCF7) e higromicina (200 μg/mL para las células MCF7).
  3. Mantenga las células en el medio de selección de antibióticos hasta que las células de control negativas se extingan.
    NOTA: Puede variar el tiempo para que las diferentes líneas celulares se estabilicen. En el caso de la MCF7, las células no infectadas suelen tardar entre 5 y 7 días en extinguirse por completo. Una curva de eliminación que utiliza un rango de concentraciones de antibióticos debe probarse para una nueva línea celular antes de los experimentos. Es aceptable usar una mezcla de células para los siguientes pasos, pero una alternativa es elegir colonias unicelulares que sean homogéneas en términos de expresión de las dos proteínas efectoras. La línea estable obtenida se denomina línea parental efectora SAM (por ejemplo, línea efectora SAM MCF7) en este trabajo. Se recomienda utilizar una línea celular parental intercambiada de células parentales efectoras de SAM para la infección por diferentes ARNg dirigidos o no dirigidos, especialmente si se van a comparar sus efectos.
  4. Utilice la Western blot para determinar si las células expresan de manera estable las dos proteínas efectoras (se muestra un ejemplo en la Figura 4A). Utilice la transcripción inversa de ARN totales seguida de PCR cuantitativa (RT-qPCR) como método alternativo para examinar los niveles de expresión de los dos ARNm (dCas9-VP64 y MS2-p65-HSF1, Figura 4B).
    NOTA: Los cebadores para examinar los niveles de ARNm de los dos efectores dCas9 están disponibles en la Tabla Suplementaria 1.
  5. Genere lentivirus de ARNg construidos en el paso 3.5 e infecte la línea celular SAM estable que expresa dualmente dCas9-VP64 y MS2-p65-HSF1 con lentivirus de ARNg individual. Agregue zeocina (100 μg/mL para las células MCF7) al medio 24 h después de la transducción viral de ARNg. Genere un control negativo que exprese ARNg no objetivo (NT-gRNA) en la línea celular SAM parental.
    NOTA: Asegúrese de que el fármaco de selección sea específico para el constructo de interés.

8. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa para examinar los niveles de ARNe

  1. Extraiga ARN totales de líneas celulares SAM que expresen NT-gRNA o ARNg dirigidos utilizando un kit de extracción de ARN38 u otro método basado en cloroformo fenol. Utilice celdas de ~80% de confluencia en un pocillo de una placa de seis pocillos para la extracción de ARN.
    NOTA: No se observaron diferencias significativas en nuestra práctica para la detección de ARNe cuando los ARN se extraen mediante columnas de unión comerciales o mediante reactivos de cloroformo de fenol.
  2. Producir ADN complementario (ADNc) a partir del ARN purificado mediante reacción de transcripción inversa con hexámero aleatorio, siguiendo el protocolo del fabricante39. Condiciones de uso en la Tabla Complementaria 2.
    NOTA: Debido a que la mayoría de los ARNe son 1,2,4,9,10 no poliadenilados, el hexámero aleatorio se usa de forma rutinaria para la generación de ADNc.
  3. Diseñe cebadores para la medición de ARNe objetivo por RT-qPCR utilizando una herramienta de diseño de cebadores de buena reputación (p. ej., Primer 3). Pruebe la linealidad de amplificación de los pares de cebadores examinando si los cebadores amplificarán linealmente ADNc diluidos en serie y mostrarán las diferencias esperadas en el ciclo de qPCR. Condiciones de uso en la Tabla Complementaria 2.
    NOTA: Los cebadores para RT-qPCR deben dirigirse a la región altamente transcrita en la secuenciación de ARN naciente, y la prueba de linealidad de los cebadores debe incluir una amplia gama de diluciones de ADNc para garantizar que se prueben todos los niveles de ARNe posiblemente encontrables. En la Figura 5A se muestra un ejemplo de prueba de linealidad.
  4. Realice RT-qPCR y analice los niveles de expresión de eRNA en células de control (línea celular SAM con NT-gRNA) y en líneas celulares SAM con gRNA dirigidos a eRNA (p. ej., NET1e gRNA#1) (p. ej., Figura 6A). Los cebadores para el ARN NET1e se muestran en la Tabla Suplementaria 1. Condiciones de uso en la Tabla Complementaria 2.  

9. dCas9 ChIP y qPCR

NOTA: Este paso es un experimento opcional para validar la unión del complejo dCas9/SAM-gRNA al potenciador objetivo por parte de los gRNA específicos. Si bien se recomienda que los usuarios realicen este paso, no es necesario analizar cada uno de los ARNg. Consulte un ejemplo que se muestra en la Figura 5B. Consulte los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 1.

  1. Celdas de reticulación
    1. Retire el medio de las células y agregue formaldehído al 1% disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Dejar actuar durante 10 min.
    2. Agregue glicina 2,5 M a un volumen de 1:20 para apagar la reticulación y lave las celdas dos veces con PBS helado. Agregue 700 μL de PBS helado y raspe las células hasta un tubo de 1,5 mL.
    3. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 minutos a 4 °C. Continúe con el paso 9.2, o congele y almacene a -80 °C.
  2. Sonicato
    1. Prepare nuevos tampones LB1, LB2 y LB3. LB1: 50 mM de Hepes-KOH (pH 7,5), 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10% de glicerol, 0,5% de NP-40, 0,25% de Triton-X 100 y 1x Inhibidor de la proteasa. LB2: 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,5 mM de EGTA y 1x Inhibidor de la proteasa. LB3: 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,5 mM de EGTA, 0,1% de Na-desoxicolato, 0,5% de N-lauroylsarcosina y 1x Inhibidor de la proteasa. Complemente 1x Inhibidor de la proteasa recién aflorado al tampón antes del experimento.
    2. Añadir 1 mL de tampón LB1 a los gránulos de celda, pipetear bien, girar a 4 °C durante 10 min y centrifugar a 2.000 x g durante 5 mins a 4 °C. Vierta el sobrenadante, agregue 1 mL de tampón LB2, gire a 4 °C durante 10 min y centrifugue a 2,000 x g durante 5 min a 4 °C. Vierta el sobrenadante y retire el exceso del tampón LB2. Añadir 300 μL de tampón LB3.
    3. Sonicar y fragmentar el ADN de la cromatina a un tamaño medio de ~200-400 pb utilizando un sistema sonicador adecuado. Después de la sonicación, añadir 30 μL de Triton-X 100 al 10% y mezclar bien. Pruebe el tiempo de sonicación adecuado si se utiliza una nueva línea celular.
    4. Centrífuga a 14.000 x g para extraer el pellet. Transfiera el sobrenadante al nuevo tubo y agregue 630 μL de LB3 y 70 μL de Triton X-100 al 10% hasta un volumen total de 1 mL. Añada 2 μg del anticuerpo Cas9 al sobrenadante y gire a 4 °C durante la noche.
  3. Captura de inmunocomplejos y reticulación inversa
    1. Prepare el tampón RIPA (50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,7% Na-desoxicolato, 1% NP-40, 0,5 M LiCl) y tampón de elución (1% SDS y 0,1 M NaHCO3).
    2. Lave las drapeadas de proteína G con 1% de BSA en PBS 3 veces y tampón LB3 una vez.
    3. Añadir 30 μL de dynabeads de proteína G a la muestra e incubar a 4 °C durante 4 h.
    4. Lave el inmunocomplejo de perlas en 500 μL de tampón RIPA 6 veces. No dejes que las cuentas se sequen.
    5. Lave el inmunocomplejo de perlas una vez con tampón TE; Retire el búfer.
    6. Añadir 200 μL de tampón de elución al inmunocomplejo de perlas y al vórtice; luego colóquelo en un agitador calentado de temperatura ajustable a 65 °C con agitación de 600 rpm durante 6-16 h para revertir la reticulación.
  4. Extracción de ADN
    1. Retire los tubos de la coctelera, gire brevemente las cuentas y colóquelas en un soporte magnético. Transfiera 200 μL del sobrenadante a un tubo nuevo y agregue 200 μL de tampón TE.
    2. Añadir 1 μL de RNasa A (1 mg/mL) al tubo e incubar a 37 °C durante 1 h.
    3. Después de 1 h de incubación, añadir 2 μL de proteinasa K (20 mg/mL) a la muestra e incubarla a 65 °C durante 2 h.
    4. Centrifugar brevemente y añadir 400 μL de mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. Mezclar bien, luego centrifugar durante 5 min a 10.000 x g.
    5. Mover 400 μL de la capa superior a un tubo de 1,7 mL que contenga 16 μL de NaCl 5 M y 1 μL de glucógeno (20 μg/μL) y mezclar bien.
    6. Añadir 800 μL de etanol al 100% y dejar reposar toda la noche a -20 °C.
    7. A la mañana siguiente, centrifugar los tubos a 4 °C a 14.000 x g durante 15 min.
    8. Retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de etanol al 70%. Girar a 14.000 x g durante 10 min.
    9. Retire el etanol, seque el pellet al aire y vuelva a suspender en 50 μL de TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM de EDTA).
  5. Realice ChIP-qPCR para examinar el reclutamiento del complejo SAM al sitio objetivo mediante un par de cebadores potenciadores dirigidos al núcleo. Utilice un par de cebadores que se dirija a una región irrelevante como control negativo.

10. Ensayo de crecimiento celular y otras pruebas funcionales de sobreactivación de eRNA

  1. Tripsinizar las líneas celulares SAM que expresan el ARNg no objetivo o los ARNg dirigidos al ARNe y colocar una placa de ~3.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos.
  2. Medir el crecimiento celular mediante el uso de un generador de imágenes de células vivas u otros métodos (por ejemplo, recuento de células o ensayo de sal de tetrazolio-1 soluble en agua).
  3. Utilice la concentración inhibitoria media máxima (IC50) para probar las respuestas celulares a fármacos específicos contra el cáncer en células con o sin sobreexpresión de NET1e por SAM15.
    NOTA: Los resultados de los ensayos de crecimiento celular y las pruebas de sensibilidad a los medicamentos de las células de cáncer de mama se presentan después de la sobreexpresión de un ARNe transcrito adyacente al gen NET1 , que se denominó NET1e15. Se pueden realizar otros ensayos a nivel celular o de organismos en función de la necesidad de cada proyecto específico.

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Resultados

La figura 1 ilustra el flujo de trabajo general de este protocolo. Nos centramos en un ARNe representativo, NET1e15, que está sobreexpresado en el cáncer de mama, para el que se utilizó el sistema SAM para activar y estudiar su papel biológico en la regulación de la expresión génica, la proliferación celular y la respuesta a los fármacos contra el cáncer. Para este potenciador de NET1 , se marcaron varios picos de ChIP-Seq de p300, flanqueados por tr...

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Discusión

Basándonos en nuestros datos, concluimos que el sistema SAM es adecuado para estudiar el papel de los ARNe en la regulación de los fenotipos celulares, por ejemplo, el crecimiento celular o la resistencia a los fármacos. Sin embargo, se requiere un diseño cuidadoso del ARNg para una activación robusta del ARNe, debido a las siguientes razones. En primer lugar, el sitio de inicio de la transcripción (TSS) del ARNe en cada línea/tipo celular específico permanece menos claramente anotado. D...

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Divulgaciones

El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas.

Agradecimientos

Este trabajo está respaldado por subvenciones a W.L (Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas, CPRIT RR160083 y RP180734; K22CA204468 del NCI; NIGMS R21GM132778; el Premio Estrellas de la Universidad de Texas UT; y la fundación Welch AU-2000-20190330) y una beca postdoctoral a J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). Reconocemos la publicación original15 de donde se adoptaron algunas de nuestras figuras actuales (con modificaciones), que sigue la licencia Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BlasticidinaGoldbioB-800-100
BsmBI enzima de restricciónNueva Inglaterra BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lote: 10216001
Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP)Nueva Inglaterra BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco' s Águila Modificada MedioCorning10-013-CM
Dynabeads Proteína GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Suero Fetal BovinoGenDEPOTF0900-050
GlucógenoThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Bromuro de hexadimetrinaSigmaH9268
Higromicina BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
Generador de imágenes de células vivas IncuCytede análisis de células vivas IncuCyte S3Essen BioScience
dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo columna vertebralAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DesoxicolatoSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosinaSigma97-78-9
Opti-MEM Medio de suero reducidoThermo Fisher Scientific31985070
PES filtro de jeringaBASIX13-1001-07
Inhibidor de la proteasa Tableta de cóctelRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 ADN polimerasa de alta fidelidadNew England BioLabs Inc.Tampón de reacción M0491S
Q5Nueva Inglaterra BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Tampón enzimático de restricciónNueva Inglaterra BioLabs Inc.B7203S Sistema de
detección RT-qPCR SDSThermo Fisher ScientificQuant Studio3
Thermo Fisher ScientificBP359-500
QsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
célula competente Stbl3Thermo Fisher ScientificC7373-03
Superíndice IV transcripción inversaThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Kits de detección de mutacionesTecnologías de ADN integradas706020
T4 ADN ligasaNueva Inglaterra BioLabs Inc.M0202S
T4 T4 Tampón de reacción de ADN ligasaNueva Inglaterra BioLabs Inc.B0202S
Tampón TEThermo Fisher Scientific46009CM
TermocicladorBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma 5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p
Sistema de lenti_ de

Referencias

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