Activación forzada de ARN potenciadores in situ a través del sistema mediador de activación sinérgica dCas9

Zian Liao; Joo-Hyung Lee; Joanna Krakowiak; Ruoyu Wang; Wenbo Li

doi:10.3791/61460

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Artículo de método

Activación forzada de ARN potenciadores in situ a través del sistema mediador de activación sinérgica dCas9

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DOI:

10.3791/61460

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5 de junio de 2020

Zian Liao^*¹^,² , Joo-Hyung Lee^*¹ , Joanna Krakowiak¹ , Ruoyu Wang¹^,² , Wenbo Li¹^,²

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, ²Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los ARN potenciadores (ARNe) son ARN no codificantes producidos a partir de potenciadores activos. Un enfoque óptimo para estudiar las funciones del ARNe es manipular sus niveles en las regiones nativas de la cromatina. Aquí presentamos un sistema robusto para estudios de ARNe mediante el uso de activadores transcripcionales fusionados con CRISPR-dCas9 para inducir la expresión de ARNs de interés.

Resumen

Los potenciadores son elementos genómicos fundamentales dispersos por el genoma de los mamíferos y dictan programas de expresión génica específicos de tejidos. Cada vez hay más pruebas de que los potenciadores no solo proporcionan motivos de unión al ADN para los factores de transcripción (TF), sino que también generan ARN no codificantes que se denominan ARNe. Los estudios han demostrado que las transcripciones de ARNe pueden desempeñar un papel importante en la regulación génica tanto en la fisiología como en la enfermedad. Los métodos comúnmente utilizados para investigar la función de los ARNe se limitan a enfoques de "pérdida de función" por la eliminación de los ARNe o por inhibición química de la transcripción del potenciador. No ha habido un método sólido para llevar a cabo estudios de "ganancia de función" de los ARNe para imitar enfermedades específicas como el cáncer humano, donde los ARNe a menudo se sobreexpresan. Aquí, presentamos un método para activar de manera precisa y robusta los eRNAs para la interrogación funcional de sus roles mediante la aplicación del sistema de Mediadores de Activación Sinérgica (SAM) mediado por dCas9. Presentamos todo el flujo de trabajo de la activación del eRNA, desde la selección de los eRNAs, el diseño de los gRNAs hasta la validación de la activación del eRNA mediante RT-qPCR. Este método representa un enfoque único para estudiar el papel de un ARNe en particular en la regulación génica y el desarrollo de enfermedades. Además, este sistema puede emplearse para el cribado CRISPR no sesgado con el fin de identificar objetivos de ARNe impulsores del fenotipo en el contexto de una enfermedad específica.

Introducción

El genoma humano contiene una constelación de elementos reguladores ^1,2,3. Entre estos, los potenciadores emergen como una de las categorías más críticas ^4,5,6. Los potenciadores desempeñan un papel esencial en la regulación del desarrollo y son responsables de generar programas de expresión génica espacio-temporal para determinar la identidad celular ^5,6,7.....